ces 97.12(2000):6640-6645；
[0050] pKD46記載在如下文獻(xiàn)中：Datsenko,Kirill A.，and Barry L.Wanner.One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K_12using PCR products .Proceedings of the National Academy of Sciences 97.12(2000):6640-6645；
[0051] pCP20記載在如下文獻(xiàn)中：Datsenko,Kirill A.，and Barry L.Wanner.One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K_12using PCR products .Proceedings of the National Academy of Sciences 97.12(2000):6640-6645；
[0052] 硫酯酶基因?yàn)槿缦?0種：
[0053] 硫酯酶基因1為tesC(fadM，ybaW)，其核苷酸序列如序列表中序列1所示；
[0054]硫酯酶基因2為tesB，其核苷酸序列如序列表中序列2所示；
[0055]硫酯酶基因3為tesA(apeA，pldC)，其核苷酸序列如序列表中序列3所示；
[0056] 硫醋酶基因4為ybdB(entH)，其核甘酸序列如序列表中序列4所不；
[0057] 硫酯酶基因5為ybgC，其核苷酸序列如序列表中序列5所示；
[0058] 硫酯酶基因6為ybhC，其核苷酸序列如序列表中序列6所示；
[0059] 硫酯酶基因7為yciA，其核苷酸序列如序列表中序列7所示；
[0060] 硫酯酶基因8為ydbV(paal)，其核苷酸序列如序列表中序列8所示；
[0061] 硫酯酶基因9為ydil(menl)，其核苷酸序列如序列表中序列9所示；
[0062] 硫酯酶基因10為yigl，其核苷酸序列如序列表中序列10所示。
[0063] 一、敲除tesC的重組菌EB228AtesC: :kan制備
[0064] 1、重組菌 EB228(pKD46)的制備
[0065] EB228感受態(tài)細(xì)胞：在三角瓶中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期的200ml EB228菌液，冰浴 3〇111；[11。4<€，300(^離心51]1；[11。棄掉上清液，用預(yù)冷的無(wú)菌10%甘油重懸菌體，洗滌兩次。最后 加入lml預(yù)冷的10%甘油重懸菌體，50μ1每管分裝至預(yù)冷的1.5ml無(wú)菌離心管中備用，得到 EB228感受態(tài)細(xì)胞。
[0066] EB228(pKD46)重組菌：取ΙμL pKD46與上述EB228感受態(tài)細(xì)胞混合，冰浴5min，將混 合物轉(zhuǎn)移至2mm電擊杯內(nèi)進(jìn)行轉(zhuǎn)化，電擊轉(zhuǎn)化參數(shù)為：電壓2.5kV，25yF，電阻200 Ω。電擊轉(zhuǎn) 化完畢后，立即將菌液轉(zhuǎn)移至lml LB中，30°C復(fù)壯lh，涂布于含100μg/ml氨芐青霉素的LB平 板上，30 °C培養(yǎng)12h，得到EB228 (pKD46)重組菌。
[0067] EB228(pKD46)感受態(tài)細(xì)胞:將上述涂布的平板上長(zhǎng)出的EB228(pKD46)重組菌菌落 轉(zhuǎn)接至含l〇〇μg/ml氨芐青霉素的液體LB中，30°C培養(yǎng)至0D6QQ值約為0.2時(shí)，加入終濃度為 10mm 〇l/l的阿拉伯糖進(jìn)行誘導(dǎo)，誘導(dǎo)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期的菌體按照上述制備EB228的方法制 備EB228(pKD46)感受態(tài)細(xì)胞。
[0068] 圖1為EB228體內(nèi)的丁醇生產(chǎn)途徑。
[0069] 2、敲除硫酯酶基因 tesC的重組菌EB228AtesC: :kan [0070]圖2為tesC基因敲除的過(guò)程示意圖。
[0071] l)、tesC同源重組片段的制備
[0072] 1-KoF:GACGTTTACCAGCACGTCAACAACGCCCGCTACCTTGAATTGTAGGCTGGAGCTGCTTC
[0073] 1-KoR:CTTCCAGAGCTAATGCTTTCTGCGTTTTAAGATCAATACATGGGAATTAGCCATGGTCC
[0074] 以pKD4為模板，以敲除引物1-KoF和1-KoR進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到約1.6kb的PCR擴(kuò)增產(chǎn) 物，為tesC同源重組片段，經(jīng)過(guò)測(cè)序，tesC同源重組片段的核苷酸序列為序列表中序列11。
[0075] tesC同源重組片段包括tesC基因上游同源臂、上游FRT、卡那霉素抗性基因、下游 FRT和tesC基因下游同源臂；其中，tesC基因上游同源臂為序列11第1-40位、上游FRT為序列 11第59-106位、卡那霉素抗性基因?yàn)樾蛄?1第468-1262位、下游FRT為序列11第1453-1498 位和tesC基因下游同源臂為序列11第1535-1574位。
[0076] 上述使用的DNA聚合酶為MCLAB 15高保真聚合酶，上述PCR程序如表1:
[0077] 表1為PCR程序
[0078]
[0079]
[0080] 2)、通過(guò)同源重組敲除tesC
[0081 ] 將ΙμL上述1)制備的tesC同源重組片段與上述1制備的EB228(pKD46)感受態(tài)細(xì)胞 混合，按照上述1中的電擊轉(zhuǎn)化方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化，30°C復(fù)壯1.5h，涂布于含50μg/ml卡那霉素的 LB平板上，37 °C培養(yǎng)24h，得到重組菌。
[0082]將重組菌作為模板，用引物1-F和1-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增。以EB228為對(duì)照。
[0083] 1-F:ACACAAATCAAAGTTCGTGGATATCATC
[0084] 1-R：CCATCTGCTCCAGCTTTTCGCGCAATTC
[0085] 將上述PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè)，結(jié)果得到約1.7kb片段的重組菌為陽(yáng)性重組菌，EB228得 到約385bp片段。
[0086] 該陽(yáng)性重組菌命名為EB228AtesC: :kan，該菌為將EB228基因組上的硫酯酶基因 tesC替換為兩端帶有FRT的卡那霉素抗性基因片段(序列11第41-1534位）的重組菌，該重組 菌又命名為EB228-1#，EB228-1#為EB228的突變體。
[0087] 二、敲除其余9個(gè)硫酯酶基因的重組菌制備
[0088] 敲除其余9個(gè)硫酯酶基因的重組菌制備方法與上述一基本相同，不同的僅是敲除 引物、同源片段和驗(yàn)證引物，具體列在如下：
[0089] 1、敲除硫酯酶基因 tesB的重組菌EB228-2#制備
[0090] 重組菌EB228-2#為將EB228基因組上的tesB基因替換為兩端帶有FRT的卡那霉素 抗性基因（序列12的第41 -1534位)得到的重組菌。
[0091]所需的敲除引物、同源片段和驗(yàn)證引物如下：
[0092] tesB敲除引物：
[0093] 2-KoF:GTGAAGATTTAGGTTTACGCCAGGTGTTTGGCGGCCAGGTTGTAGGCTGGAGCTGCTTC
[0094] 2-KoR:GTATAAAACTCACCGCGCACAAAGCCACGTGCGCTGGACGTGGGAATTAGCCATGGTCC
[0095] tesB同源重組片段的核苷酸序列為序列12,包括tesB基因上游同源臂、上游FRT、 卡那霉素抗性基因、下游FRT和tesB基因下游同源臂；其中，tesB基因上游同源臂為序列12 第1-40位、上游FRT為序列12第59-106位、卡那霉素抗性基因?yàn)樾蛄?2第468-1262位、下游 FRT為序列12第1453-1498位和tesB基因下游同源臂為序列12第1535-1574位。
[0096] tesB驗(yàn)證引物，得到1 · 8kb為陽(yáng)性：
[0097] 2-F：AAATTTACTGACATTGTTAAATCTGG
[0098] 2-R：ATTACGCATCACCCCTTCCTGAACGG
[0099] 2、敲除硫酯酶基因 tesA的重組菌EB228-3#制備
[0100] 重組菌EB228-3#為將EB228基因組上的tesA基因替換為兩端帶有FRT的卡那霉素 抗性基因（序列13的第41 -1534位)得到的重組菌。
[0101] 所需的敲除引物、同源片段和驗(yàn)證引物如下：
[0102] tesA敲除引物：
[0103] 3-KoF:CAGCGGACACGTTATTGATTCTGGGTGATAGCCTGAGCGCTGTAGGCTGGAGCTGCTTC
[0104] 3-KoR:TTGGGATGAATACCGTCATCCTGCATCCATTGTGGCTTGATGGGAATTAGCCATGGTCC [0105] tesA同源重組片段的核苷酸序列為序列13,包括tesA基因上游同源臂、上游FRT、 卡那霉素抗性基因、下游FRT和tesA基因下游同源臂；其中，tesA基因上游同源臂為序列13 第1-40位、上游FRT為序列13第59-106位、卡那霉素抗性基因?yàn)樾蛄?3第468-1262位、下游 FRT為序列13第1453-1498位和tesA基因下游同源臂為序列13第1535-1574位。
[0106] tesA驗(yàn)證引物，得到1 · 8kb為陽(yáng)性：
[0107] 3-F：TGTTTTCCGCTGGCATTTGCCCTTCCTG
[0108] 3-R：AGGCTGCAACTGCTTCGCCATCCAGTCG
[0109] 3、敲除硫酯酶基因 ybdB的重組菌EB228-4#制備
[0110] 重組菌EB228-4#為將EB228基因組上的ybdB基因替換為兩