中的包被抗體工作液，用洗液洗板3次，然后按照20化17孔的用量加入 封閉液，室溫封閉1小時； (3) 按照下法配置標(biāo)準(zhǔn)品蛋白標(biāo)準(zhǔn)液:取7個EP管并依次編號，按照10化17管的用量分 別加入樣品稀釋液并置于EP管架上;采用樣品稀釋液將標(biāo)準(zhǔn)品蛋白配制成濃度為lOng/mL 的液體，并吸取100化加入到第1個EP管中，混勻后從第1個EP管中吸取100化液體，并加入到 第2個EP管中進行二倍稀釋，依此類推至第7個EP管； (4) 棄掉酶標(biāo)板中的封閉液，用洗液洗板3次，然后按照10化17孔的用量加入標(biāo)準(zhǔn)品蛋 白標(biāo)準(zhǔn)液和待測樣品，室溫反應(yīng)2小時； 巧)棄掉酶標(biāo)板中的標(biāo)準(zhǔn)品蛋白標(biāo)準(zhǔn)液和待測樣品，用洗液洗板3次，采用抗體稀釋液 將檢測抗體配制成濃度為0.扣gAiL的檢測抗體工作液，然后按照10化17孔的用量加入到酶 標(biāo)板中，室溫反應(yīng)2小時； (6) 棄掉酶標(biāo)板中的檢測抗體工作液，用洗液洗板5~6次，采用樣品稀釋液將酶標(biāo)二抗 配制成濃度為0.化g/mL的酶標(biāo)二抗工作液，然后按照10化17孔的用量加入到酶標(biāo)板中，室 溫反應(yīng)1小時； (7) 棄掉酶標(biāo)板中的酶標(biāo)二抗工作液，用洗液洗板8~10次，然后按照10化17孔的用量加 入底物，室溫避光反應(yīng)10~15分鐘； (8) 將終止液加入到酶標(biāo)板中終止反應(yīng)，然后應(yīng)用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定酶標(biāo)板中 各孔的OD值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的OD值擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線，并將待測樣品的OD值代入方程，計算待測樣 品中人S ICO化的濃度，即可完成定量檢測。
[0017]有益效果:與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的人可溶性IC0SL ELISA試劑盒不僅具有較高 的檢測靈敏度，而且具有較好的檢測特異性，開發(fā)及應(yīng)用前景良好。檢測發(fā)現(xiàn)，在健康人W 及類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者的外周血清中存在sICO化。與健康人相比，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者的 外周血中sICO化的表達水平顯著升高(P<0.01);與穩(wěn)定期類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者相比，活動 期類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者體內(nèi)sico化的表達水平也顯著升高(P<0.01);經(jīng)治療，同一發(fā)作期 類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者的外周血中sico化的表達水平降低(P<0.01)。因此，該試劑盒在自身 免疫性疾病(特別是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎)的診斷和療效判斷中具有一定的應(yīng)用價值。
[001 引
【附圖說明】
[0019] 圖1為雜交瘤培養(yǎng)物上清的蛋白鑒定結(jié)果示意圖； 圖2為雜交瘤培養(yǎng)物上清的Ig亞類鑒定結(jié)果示意圖； 圖3為單克隆抗體識別抗原位點的競爭性抑制試驗示意圖； 圖4為單克隆抗體的Western印跡鑒定結(jié)果示意圖； 圖5為本發(fā)明的ELISA試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程； 圖6為本發(fā)明的ELISA試劑盒的特異性考察曲線圖； 圖7為L929^C0化基因轉(zhuǎn)染細胞體外培養(yǎng)過程中sICO化蛋白檢測示意圖； 圖8為sICO化在正常人外周血清中的表達水平示意圖； 圖9為sICO化在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者外周血清中的表達水平示意圖；
【具體實施方式】
[0020] W下將結(jié)合附圖和具體實施例對本發(fā)明中的技術(shù)方案做出進一步的說明。除特殊 說明W外，下列實施例中所使用的各種材料、藥品、試劑及儀器均可通過商業(yè)途徑獲得。
[0021] 實施例一:雜交瘤細胞株2B4和20B10的獲取。
[0022] 使用自行建立的ICO化分子的轉(zhuǎn)基因細胞(L929/IC0SL)作為免疫原，Ξ次免疫接 種Ba化/c小鼠（107/50化1/只），每次間隔3周。末次免疫后第四天，取小鼠脾臟細胞與SP2/0 骨髓瘤細胞株進行細胞融合(共20塊96孔板）。W高表達ICO化分子的L929/IC0化為陽性對 照及表達B7H4分子的L929/B7H4和表達空載體的L929/Mock為陰性對照，用間接免疫巧光法 對雜交瘤培養(yǎng)物上清進行初步篩選、蛋白鑒定(參見圖1)及Ig亞類鑒定（參見圖2)。陽性克 隆經(jīng)3次有限稀釋后，克隆的陽性率達到約95%。經(jīng)復(fù)篩及亞克隆后獲得穩(wěn)定地分泌特異性 鼠抗人ICO化的雜交瘤細胞株，并分別被命名為2B4(CGMCC No. 11291)、20B10(CGMCC No. 11187)。運些雜交瘤細胞經(jīng)體外持續(xù)傳代(40代)后，仍能穩(wěn)定地分泌特異性抗體。對雜 交瘤細胞株2B4和20B10的染色體分析顯示，運兩株雜交瘤細胞的染色體數(shù)目為80~110。
[0023] 實施例二:抗人ICO化單克隆抗體2B4和20B10的獲取與特性鑒定。
[0024] 1、采用腹水體內(nèi)誘生方法獲取單克隆抗體： 取6~8周齡的雌性Ba化/c小鼠，腹腔內(nèi)注入Pris化ne(0.5ml/只）。一周后腹腔內(nèi)接種雜 交瘤細胞（lX10シ只），同時再次腹腔內(nèi)注射Pristane與福氏不完全佐劑的等體積混合物 (0.2ml/只）。5-10天后收獲腹水，并離屯、取上清，于-80°C保存。
[0025] 2、腹水型單抗的純化和定量： 腹水液經(jīng)去除纖維蛋白和鹽析處理后，W蛋白G親和柱層析法純化。收集蛋白峰流出 液，對憐酸鹽緩沖液(PBS)透析后，用751紫外分光光度計測定抗體蛋白濃度為0.8~lOmg/ ml。間接免疫巧光法分析，純化后單抗的效價為1:1000?上。
[0026] 3、Ig亞類鑒定： 采用CBA法(抓公司）鑒定Ig亞類，結(jié)果顯示2B4和20B10均為小鼠重鏈1旨6姑型，輕鏈為 Ka 卵 a(K)型。
[0027] 4、抗體識別抗原位點的競爭性抑制試驗： 在L929^C0化細胞巧^lO5/管)懸液分別加入單克隆抗體(每管2g)，于4°C解育45分鐘。 洗細胞后依次加入生物素標(biāo)記的單抗和streptavidine-PE，并分別于4°C解育30分鐘。再次 洗涂后用流式細胞儀分析，同時設(shè)陽性和陰性對照。如圖3所示，單抗2B4和20B10均不能阻 斷單抗2D3與L929/1C0化細胞上ICO化分子的結(jié)合。由此表明，單抗2B4與20B10識別的IC0SL 分子抗原位點完全不同。
[002引 5、單抗的Western印跡鑒定： O.lg表達GST-IC0化工程菌的菌體蛋白經(jīng)12%SDS-PAGE電泳，并電轉(zhuǎn)移(0.65mA/cm2)至 硝酸纖維膜上，用5%脫脂奶粉4°C封閉過夜。翌日加入純化的抗體室溫解育1小時。用TBST溶 液洗去未結(jié)合的抗體，加入AP標(biāo)記的二抗，30分鐘。解育后加入底物顯色。如圖4所示，2B4， 20B10和2D3(商品化ICO化單抗)均能與ICO化蛋白特異性結(jié)合，形成陽性條帶，表明運兩株 單抗均具有識別ICO化分子的良好特異性。
[0029] 6、單克隆抗體相關(guān)序列表： SEQ ID NO: 1為抗人可溶性ICO化單克隆抗體2B4輕鏈的氨基酸序列； SEQ ID NO:2為抗人可溶性ICO化單克隆抗體2B4重鏈的氨基酸序列； SEQ ID NO:3為編碼抗人可溶性ICO化單克隆抗體2B4輕鏈的核巧酸序列； SEQ ID N0:4為編碼抗人可溶性ICO化單克隆抗體2B4重鏈的核巧酸序列； SEQ ID NO:5為抗人可溶性ICO化單克隆抗體20B10輕鏈的氨基酸序列； SEQ ID N0:6為抗人可溶性ICO化單克隆抗體20B10重鏈的氨基酸序列； SEQ ID NO:7為編碼抗人可溶性ICO化單克隆抗體20B10輕鏈的核巧酸序列； SEQ ID NO:8為編碼抗人可溶性ICO化單克隆抗體20B10重鏈的核巧酸序列。
[0030] 實施例1CO化定量檢測試劑盒。
[0031] 該試劑盒的組成、規(guī)格、來源、膽存條件等信息如下表所示。
[0032] 實施例四：利用化ISA試劑盒進行人血清中sICO化的定量檢測。
[0033] 1、樣品處理： 采集人體血液，置于離屯、管中，待血液凝固后，于2500巧m條件下離屯、lOmin，得到待測 血清樣本，于-20°C保存，避免反復(fù)凍融。
[0034] 2、定量檢測操作步驟： (1) 采用0.01M CBS緩沖液(pH=9.6，15mL)將單抗20B10(30yg)配制成濃度為化g/mL的 包被抗體工作液，按照10化L/孔的用量加入到化ISA板中，于4°C靜置，過夜； (2) 棄掉包被抗體工作液，用0.01M PBS(含0.2% Tween20)洗板3次，按照20化L/孔的用 量加入BSA，室溫封閉化； (3) 按照下法配置標(biāo)準(zhǔn)品蛋白標(biāo)準(zhǔn)液:取7個EP管并依次編號，按照10化17管的用量分 別加入0.01M PBS(含0.5% BSA)并置于EP管架上；采用0.01M PBS(含0.5% BSAKlmL)將 ICOSklg融合蛋白（Wng)配制成濃度為lOng/mL的液體，并吸取100化加入到第1個EP管中， 混勻后從第1個EP管中吸取1(Κ)化液體，并加入到第2個EP管中進行二倍稀釋，依此類推至第 7個ΕΡ管； (4) 棄掉封閉液，用0.01Μ PBS(含0.2% Tween20)洗板3次，然后按照1 ΟΟμL孔的用量加 入ICO化-Ig融合蛋白標(biāo)準(zhǔn)液和待測血清樣品，室溫反應(yīng)化； 巧)棄掉ICOSklg融合蛋白標(biāo)準(zhǔn)液和待測血清樣品，用O.OIM PBS(含0.2% Tween20)洗 板3次，采用0.01M CBS緩沖液(pH=9.6，20mL)將單抗2B4( lOyg)配制成濃度為0.5yg/mL的檢 測抗體工作液，然后按照1〇化17孔的用量加入到化ISA板中，室溫反應(yīng)化； (6) 棄掉檢測抗體工作液，用0.01M PBS(含0.2% Tween20)洗板5次，采用樣本稀釋液將 Strep化vidin-HRP配制成濃度為0.扣g/mL的酶標(biāo)二抗工作液，然后按照10化17孔的用量加 入到化ISA板中，室溫反應(yīng)1小時； (7) 棄掉酶標(biāo)二抗工作液，用0.01M PBS(含0.2% Tween20)洗板8次，然后按照100μL孔 的用量加入ΤΜΒ，室溫避光反應(yīng)10~15min; (8) 將2M此S化加入到化ISA板中終止反應(yīng)，然后應(yīng)用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定酶標(biāo)