板中各孔的0D值，根據(jù)ICOSklg融合蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的0D值，采用GraphPad軟件利用最佳的擬 合曲線列出最合適的函數(shù)方程，并將待測(cè)血清樣品的0D值代入方程，計(jì)算待測(cè)樣品中人 sICO化的濃度，樣品孔取復(fù)孔的平均值，即可完成定量檢測(cè)。
[00對(duì) 3、檢測(cè)結(jié)果： (1) ICOSklg融合蛋白的檢測(cè)數(shù)據(jù)如下表所示。
[0036] (2)曲線方程:y=0.2226X+0.00370，r2=0.99817(參見(jiàn)圖 5) (3)血清樣品的檢測(cè)數(shù)據(jù)如下所示。
[0037] 4、準(zhǔn)確性考察： (1)板內(nèi)準(zhǔn)確性分析:在同一次實(shí)驗(yàn)中，將Ξ個(gè)已知濃度的樣本（10、5、2.5ng/mL)分別 設(shè)置20個(gè)復(fù)孔，進(jìn)行sICO化檢測(cè)，分析該試劑盒的準(zhǔn)確性。
[003引（2)板間準(zhǔn)確性分析:在不同實(shí)驗(yàn)室中，將Ξ個(gè)已知濃度的樣本（10、5、2.5ng/mL) 分別設(shè)置10個(gè)復(fù)孔，進(jìn)行sICO化檢測(cè)，分析該試劑盒的準(zhǔn)確性。
[0039] (3)結(jié)果與討論：
變異系數(shù)CV<10%，證實(shí)該檢測(cè)方法具有良好的準(zhǔn)確性。
[0040] 5、特異性考察： 將不同濃度梯度的1(：051^邑、口0-1^1邑、1(：051^邑和87寸41邑的蛋白（40、20、10、5、2.5、 1.25、0.625和0叫/1111)加入抗1(：0化單抗（克?。?0810)預(yù)包被的化154檢測(cè)孔，用建立的 ELISA檢測(cè)方法測(cè)定每種蛋白不同濃度的吸光值。如圖6所示，sICO化蛋白組0D45順光值與 蛋白濃度之間呈現(xiàn)顯著的依賴性，吸光值隨著蛋白濃度增加而升高，其他Ξ種蛋白組吸光 值都很低(〇〇450<〇.1)，且無(wú)蛋白濃度相關(guān)性。因此，該檢測(cè)方法具有良好的特異性。
[0041] 實(shí)施例五:L929/IC0化基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞體外培養(yǎng)過(guò)程中S ICO化蛋白表達(dá)。
[0042] 將5X 1〇4 L929/IC0SL細(xì)胞于24孔培養(yǎng)板中連續(xù)培養(yǎng)，每間隔12h收集培養(yǎng)上清，用 上述建立的sICO化ELISA檢測(cè)方法測(cè)定上清中sICO化的表達(dá)水平。如圖7所示，L929/IC0SL 細(xì)胞增殖過(guò)程中能夠逐步產(chǎn)生sICO化（1~5ng/ml)，培養(yǎng)時(shí)間越長(zhǎng)，該因子含量越高，而 L929/B7H4、L929/B7冊(cè)和L929/mock對(duì)照細(xì)胞各組上清均低于檢測(cè)闊值。
[0043] 實(shí)施例六:正常人外周血清中sICO化的表達(dá)水平考察。
[0044] 利用上述研制成功的sICO化ELISA檢測(cè)體系測(cè)定健康對(duì)照外周血中sICO化的表 達(dá)特性，將收集的160例健康對(duì)照的外周血清進(jìn)行sICO化定量分析。如圖8A所示，0~5歲和5~ 20歲健康對(duì)照的血清中該可溶性因子表達(dá)水平較高(p<0.05)，分別達(dá)到245 ± 13.45ng/ml 和278.4±8.835ng/ml。而在20~90歲健康人中sICO化含量在不同組間不存在表達(dá)差異(P〉 0.05)。另外，如圖8B所示，在大于20歲的健康對(duì)照中，男性外周血清中sICO化顯著高于女 性(p<0.001)，分別達(dá)310.6±6.80：3ng/ml和261.9±8.396ng/ml。
[0045] 實(shí)施例屯:活動(dòng)期與穩(wěn)定期類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)患者外周血清中sICO化的表達(dá)水平考 察。
[0046] 收集類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者外周血清44例，其中活動(dòng)期RA 24例，穩(wěn)定期RA 20例， ELISA法檢測(cè)RA患者外周血清中的SIC0S的表達(dá)。如圖9A所示，活動(dòng)期RA患者外周血清中的 sICO化表達(dá)顯著高于穩(wěn)定期RA患者，分別為393.0 ± 21.5化g/ml和287.7 ± 19.17ng/ml，即 RA患者sICO化表達(dá)水平與該疾病的臨床嚴(yán)重程度相關(guān)。隨后，對(duì)10例接受治療的RA患者動(dòng) 態(tài)檢測(cè)sICO化的表達(dá)。如圖9B所示，與治療前（422.0±40.0化g/ml)相比，治療后sICO化表 達(dá)明顯降低(319.8±22.95雌/1111)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(9=0.04)。
[0047]綜上所述，使用本發(fā)明的人可溶性ICOSL ELISA試劑盒不但能夠?qū)︻愶L(fēng)濕性關(guān)節(jié) 炎進(jìn)行診斷及分期，還可W對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者在臨床治療過(guò)程中的效果進(jìn)行評(píng)價(jià)。類 風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者血清中存在sICO化的表達(dá)，且該表達(dá)水平隨著病情的好轉(zhuǎn)而降低，直至 達(dá)到健康人的水平。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一對(duì)用于制備抗人可溶性ICOSL單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株： 雜交瘤細(xì)胞株2B4,保藏編號(hào)為CGMCC N0.11291; 雜交瘤細(xì)胞株20B10，保藏編號(hào)為CGMCC NO: 11187。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一對(duì)雜交瘤細(xì)胞株在制備人可溶性ICOSL ELISA試劑盒中的 用途，其中： 所述雜交瘤細(xì)胞株2B4用于產(chǎn)生檢測(cè)抗體； 所述雜交瘤細(xì)胞株20B10用于產(chǎn)生包被抗體。3. -對(duì)抗人可溶性ICOSL單克隆抗體： 單克隆抗體2B4,其由根據(jù)權(quán)利要求1所述的雜交瘤細(xì)胞株2B4產(chǎn)生，其包括輕鏈和重 鏈，其氨基酸序列分別如SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO: 2所示，其編碼基因的核苷酸序列分別 如SEQIDN0:3和SEQIDN0:4所示； 單克隆抗體20B10，其由根據(jù)權(quán)利要求1所述的雜交瘤細(xì)胞株20B10產(chǎn)生，其包括輕鏈和 重鏈，其氨基酸序列分別如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示，其編碼基因的核苷酸序列分 別如SEQ ID N0:7和SEQ ID N0:8所示。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的一對(duì)抗人可溶性ICOSL單克隆抗體在制備人可溶性ICOSL ELISA試劑盒中的用途，其中： 所述單克隆抗體2B4用作檢測(cè)抗體； 所述單克隆抗體20B10用作包被抗體。5. -種人可溶性ICOSL ELISA試劑盒，其包括如下組分： 1) 固相載體:酶標(biāo)板，1塊； 2) 包被抗體:抗人ICOSL單克隆抗體20B10，30yg/管，1管； 3) 檢測(cè)抗體:抗人ICOSL單克隆抗體2B4，10yg/管，1管； 4 )抗體稀釋液:0.01M碳酸鹽緩沖液，pH9.6，50mL/瓶，1瓶； 5)封閉液:牛血清白蛋白溶液，2g/100mL，30mL/瓶，1瓶； 6 )樣品稀釋液:0.01M磷酸鹽緩沖液，含有0.5%牛血清白蛋白，250mL/瓶，1瓶； 7) 標(biāo)準(zhǔn)品蛋白：IC0SL-Ig融合蛋白，25ng/管，1管； 8) 酶標(biāo)二抗:鏈霉親和素-辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)物，10yg/管，1管； 9) 底物:3,3'，5,5'-四甲基聯(lián)苯胺，1〇11117管，1管； 10 )洗液:0.01M磷酸鹽緩沖液，含有0.2%吐溫20，100mL/瓶，1瓶;和 11)終止液:2M硫酸，5mL/管，1管。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的人可溶性ICOSL ELISA試劑盒在定量檢測(cè)人體血清、血漿或組 織液內(nèi)s ICOSL中的用途。7. -種利用根據(jù)權(quán)利要求5所述的人可溶性ICOSL ELISA試劑盒進(jìn)行人可溶性ICOSL定 量檢測(cè)的方法，其包括如下步驟： 1) 采用抗體稀釋液將包被抗體配制成濃度為2yg/mL的包被抗體工作液，然后按照100μ L/孔的用量加入到酶標(biāo)板中，于4°C靜置，過(guò)夜； 2) 棄掉酶標(biāo)板中的包被抗體工作液，用洗液洗板3次，然后按照200yL/孔的用量加入封 閉液，室溫封閉1小時(shí)； 3) 按照下法配置標(biāo)準(zhǔn)品蛋白標(biāo)準(zhǔn)液:取7個(gè)ΕΡ管并依次編號(hào)，按照100μL7管的用量分別 加入樣品稀釋液并置于EP管架上;采用樣品稀釋液將標(biāo)準(zhǔn)品蛋白配制成濃度為lOng/mL的 液體，并吸取1 〇〇yL加入到第1個(gè)EP管中，混勻后從第1個(gè)EP管中吸取1 OOyL液體，并加入到第 2個(gè)EP管中進(jìn)行二倍稀釋，依此類推至第7個(gè)EP管； 4) 棄掉酶標(biāo)板中的封閉液，用洗液洗板3次，然后按照100μL7孔的用量加入標(biāo)準(zhǔn)品蛋白 標(biāo)準(zhǔn)液和待測(cè)樣品，室溫反應(yīng)2小時(shí)； 5) 棄掉酶標(biāo)板中的標(biāo)準(zhǔn)品蛋白標(biāo)準(zhǔn)液和待測(cè)樣品，用洗液洗板3次，采用抗體稀釋液將 檢測(cè)抗體配制成濃度為〇.5yg/mL的檢測(cè)抗體工作液，然后按照100μL7孔的用量加入到酶標(biāo) 板中，室溫反應(yīng)2小時(shí)； 6) 棄掉酶標(biāo)板中的檢測(cè)抗體工作液，用洗液洗板5~6次，采用樣品稀釋液將酶標(biāo)二抗配 制成濃度為〇.5yg/mL的酶標(biāo)二抗工作液，然后按照100μL孔的用量加入到酶標(biāo)板中，室溫 反應(yīng)1小時(shí)； 7) 棄掉酶標(biāo)板中的酶標(biāo)二抗工作液，用洗液洗板8~10次，然后按照100μL孔的用量加 入底物，室溫避光反應(yīng)10~15分鐘； 8) 將終止液加入到酶標(biāo)板中終止反應(yīng)，然后應(yīng)用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定酶標(biāo)板中 各孔的0D值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的0D值擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線，并將待測(cè)樣品的0D值代入方程，計(jì)算待測(cè)樣 品中人s IC0SL的濃度，即可完成定量檢測(cè)。
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種人可溶性ICOSL？ELISA試劑盒及其檢測(cè)方法。具體而言，本發(fā)明的ELISA試劑盒包括一對(duì)抗人可溶性ICOSL單克隆抗體2B4和20B10，其分別由雜交瘤細(xì)胞株2B4（保藏編號(hào)為CGMCC？NO:11291）和20B10（保藏編號(hào)為CGMCC？NO:11187）產(chǎn)生，并分別用作改良雙抗體夾心ELISA方法中的檢測(cè)抗體和包被抗體。本發(fā)明利用該試劑盒成功完成了人可溶性sICOSL的定量檢測(cè)，不僅具有較高的檢測(cè)靈敏度，而且具有較好的檢測(cè)特異性，開(kāi)發(fā)及應(yīng)用前景良好。CGMCC NO.lll8720150810
【IPC分類】C12N5/20, G01N33/577, G01N33/68, C12R1/91, C07K16/28
【公開(kāi)號(hào)】CN105586318
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201610045558
【發(fā)明人】張學(xué)光, 劉翠平, 胡筱涵
【申請(qǐng)人】蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院
【公開(kāi)日】2016年5月18日
【申請(qǐng)日】2016年1月25日