一種改性柚皮固定化糖化酶的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及固定化酶技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種固定化糖化酶的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]糖化酶又稱(chēng)葡萄糖淀粉酶，學(xué)名α-1，4葡萄糖水解酶，主要分布在霉菌中，是一種外切酶，除了能從淀粉鏈的非還原性端水解α_1，4葡萄糖苷鍵，也能緩慢水解α_1，6葡萄糖苷鍵，在制糖、釀酒、發(fā)酵方面廣泛應(yīng)用，是一種十分重要的酶制劑，工業(yè)生產(chǎn)上都以微生物發(fā)酵法大規(guī)模生產(chǎn)糖化酶。
[0003]酶固定化技術(shù)是采用吸附、交聯(lián)、包埋或共價(jià)結(jié)合的方式將游離酶固定在載體上，從而提高酶的穩(wěn)定性和重復(fù)使用性，便于生產(chǎn)的連續(xù)化、自動(dòng)化，降低酶的使用成本。目前糖化酶的固定化應(yīng)用較多的方法有海藻酸鋁吸附固定、具磁響應(yīng)的聚乙二醇吸附-交聯(lián)固定、聚乙烯醇復(fù)合凝膠固定、磁性殼聚糖固定、糊精包埋固定等多種方法。然而這些固定化方法步驟大多較為復(fù)雜，固定化載體需經(jīng)復(fù)雜的處理后才能獲取，且固定化過(guò)程中使用的試劑對(duì)人體存在一定的傷害，從而限制了其應(yīng)用。
[0004]柚皮一方面具有豐富的多孔結(jié)構(gòu)，利于形成空間，另一方面富含纖維素，含有大量的羥基、多酚基團(tuán)，通過(guò)不同的機(jī)制如靜電吸附、絡(luò)合、氫鍵等方式，具有交強(qiáng)的吸附性能，此外，基于柚子皮的可食用性，利用柚皮改性后吸附固定化糖化酶具有較強(qiáng)的可行性和應(yīng)用性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種簡(jiǎn)單、行之有效的固定化糖化酶的方法，通過(guò)分析固定化底物濃度、溶液pH、吸附時(shí)間、吸附溫度、戊二醛濃度、對(duì)固定化糖化酶活力及酶活回收率的影響，確定最佳固定化條件，并對(duì)固定化糖化酶的重復(fù)使用次數(shù)進(jìn)行研究，為固定化糖化酶及糖化酶的應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。另一方面利用柚皮的多纖維疏松結(jié)構(gòu)對(duì)其進(jìn)行改性，使得利用柚皮這種天然原料固定化糖化酶成為可能。
[0006]本發(fā)明的目的通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):
[0007]—種改性柚皮固定化糖化酶的方法，包括以下步驟:
[0008]步驟一、游離酶制備:
[0009]將粉末狀糖化酶用乙酸-乙酸鈉緩沖液溶解混勻后，紗布過(guò)濾，取濾液即為游離糖化酶溶液；
[0010]步驟二、固定化載體制備:
[0011]I)、取干燥的柚皮內(nèi)層白色部分，切成丁狀;2)、將柚皮按1:10(w/v)加入到pH 4的蒸餾水中，持續(xù)攪拌3.5h，結(jié)束后抽濾，濾渣用蒸餾水洗至中性;將濾渣按固液比1:10加入到質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3 %的氫氧化鈉溶液中，持續(xù)攪拌3.5h，結(jié)束后抽濾，濾渣用蒸餾水洗至中性，再用無(wú)水乙醇洗滌數(shù)次，60 °C干燥;3)、將干燥的柚皮加入琥珀酸酐，吡啶回流24h，結(jié)束后用2M的鹽酸溶液洗脫，再用蒸餾水洗滌數(shù)次，干燥得到改性柚皮載體，作為后續(xù)的固定化載體；
[0012]步驟三、固定化酶的制備:
[0013]將游離糖化酶與步驟二中制得的改性柚皮載體混勻直接固定化，再用戊二醛交聯(lián)固定化糖化酶，待固定化完全后，采用紗布過(guò)濾，改性柚皮載體用緩沖液或蒸餾水洗滌數(shù)次直至表面無(wú)殘留游離糖化酶為止，即得改性柚皮固定化糖化酶。
[00Μ]作為實(shí)施例的優(yōu)選方式，所述步驟一中乙酸-乙酸鈉緩沖液的pH為5.0，濃度為
0.2mol/L，體積為1mL;溶解的糖化酶采用4層紗布過(guò)濾。
[00? 5 ]作為實(shí)施例的優(yōu)選方式，所述步驟二中柚皮大小為2mm X 2mm X 2mm的立方體。
[0016]作為實(shí)施例的優(yōu)選方式，所述步驟三中將濃度為20U/mL的游離糖化酶與改性柚皮載體按20:1的比例混勻，于25 °C直接吸附游離的糖化酶，吸附時(shí)間為1.5h，再用1mL濃度為I %的戊二醛溶液交聯(lián)固定化糖化酶20min ；待固定化完全后，紗布過(guò)濾，改性柚皮載體用pH4.6濃度為0.2mol/L的乙酸-乙酸鈉緩沖液或蒸餾水洗滌數(shù)次直至表面無(wú)殘留游離糖化酶為止，即得改性柚皮固定化糖化酶。
[0017]作為實(shí)施例的優(yōu)選方式，所述步驟三中固定化糖化酶重復(fù)使用4次后殘余酶活力為 38%。
[0018]本發(fā)明的有益效果為將柚皮變廢為寶，達(dá)到了糖化酶重復(fù)使用的效果，工藝簡(jiǎn)單，產(chǎn)物易于分離，可操作性高，對(duì)環(huán)境的污染小，具有良好的應(yīng)用前景。
【附圖說(shuō)明】
[0019]圖1游離酶濃度對(duì)改性柚皮載體固定糖化酶活力的影響；
[0020]圖2不同pH對(duì)改性柚皮載體固定糖化酶活力的影響；
[0021 ]圖3不同吸附溫度對(duì)改性柚皮載體固定糖化酶活力的影響；
[0022]圖4不同吸附時(shí)間對(duì)改性柚皮載體固定糖化酶活力的影響；
[0023]圖5不同戊二醛濃度對(duì)改性柚皮載體固定糖化酶活力的影響；
[0024]圖6改性柚皮載體固定糖化酶的重復(fù)利用性。
【具體實(shí)施方式】
[0025]下面結(jié)合附圖與具體實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此。
[0026]實(shí)施例中采用的檢測(cè)方法:
[0027]游離糖化酶活力測(cè)定:取400yL濃度為2%的可溶性淀粉溶液，加入10yL游離糖化酶溶液，于40°C條件下反應(yīng)20min，反應(yīng)結(jié)束后加入0.5mL的DNS溶液，立即沸水浴顯色5min，冷卻后加蒸餾水1mL，測(cè)540nm處的吸光度，根據(jù)以葡萄糖繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算反應(yīng)液中還原糖的生成量。上述條件下，每小時(shí)水解可溶性淀粉產(chǎn)生Img葡萄糖作為一個(gè)酶活力單位(U)。
[0028]固定化糖化酶活力測(cè)定:取改性柚皮固定化糖化酶0.5g，于1mL濃度為2 %的可溶性淀粉溶液中，在40°CpH 4.6條件下反應(yīng)20min，采用游離酶的測(cè)定方法測(cè)定固定化酶反應(yīng)過(guò)程中還原糖的生成量。
[0029]酶活回收率(% )=固定化酶總活力/加入游離酶總活力X 100%。
[0030]實(shí)施例1:改性柚皮載體的制備
[0031]取干燥的柚皮內(nèi)層白色部分，切成丁狀，按1:10(w/v)加入到pH4的蒸餾水中，持續(xù)攪拌3.5h，結(jié)束后抽濾，濾渣用蒸餾水洗至中性，按固液比I: 10加入到3 %的氫氧化鈉溶液中，持續(xù)攪拌3.5h，結(jié)束后抽濾，再用蒸餾水洗至中性，無(wú)水乙醇洗滌數(shù)次，60°C干燥;將干燥的柚皮加入琥珀酸酐，吡啶回流24h，結(jié)束后用2M的鹽酸溶液洗脫，再用蒸餾水洗滌數(shù)次，干燥得到改性柚皮載體，作為后續(xù)的固定化載體。
[0032]實(shí)施例2:游離酶濃度對(duì)改性柚皮載體固定糖化酶活力的影響
[0033]將粉狀的糖化酶用pH為4.6的乙酸-乙酸鈉緩沖液溶解后，采用紗布過(guò)濾制成游離糖化酶溶液，取0.5g改性柚皮載體，加入到1mL濃度分別為10?30U/mL的游離酶溶液中，于室溫條件下吸附2h，固定化結(jié)束后用0.02M的乙酸-乙酸鈉緩沖液沖洗數(shù)次，洗盡表面殘留的游離酶。加入1mL 2%