水稻自噬相關(guān)蛋白OsATG8b及其基因的新應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[00011本發(fā)明屬于生物基因工程領(lǐng)域，具體涉及水稻自噬相關(guān)蛋白0sATG8b(^ryza sativa Autophagy-related Gene 8b)及其編碼基因和在調(diào)控釀酒酵母對(duì)錦耐受和積累方 面的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 自噬是一種真核細(xì)胞中保守的代謝途徑，在真核生物中廣泛存在，主要介導(dǎo)細(xì)胞 內(nèi)物質(zhì)分解和養(yǎng)分循環(huán)利用。在植物中，已有研究表明，自噬途徑參與應(yīng)答植物生長(zhǎng)、發(fā)育 和逆境響應(yīng)等多個(gè)生理過程。自噬相關(guān)蛋白ATG8是參與自噬小體形成的關(guān)鍵因子之一。 ATG8是一種泛素類似蛋白，其序列的典型特征是在氨基端含有2個(gè)α螺旋，而在其羧基端則 形成一個(gè)類似泛素的核心。ATG8經(jīng)一個(gè)類泛素結(jié)合系統(tǒng)與脂類物質(zhì)磷脂酰乙醇胺(ΡΕ)相連 形成ATG8-PE。ATG8-PE定位于自噬膜上，有助于形成自噬小體。自噬小體可將細(xì)胞內(nèi)毒性蛋 白，失活蛋白或損傷細(xì)胞器包裹起來，經(jīng)自噬降解后，其中對(duì)細(xì)胞有益的成分可進(jìn)入再循環(huán) 利用。自噬途徑一方面幫助細(xì)胞清除細(xì)胞內(nèi)的廢棄物，另一方面又將廢棄物進(jìn)行分解，重新 利用其中的營(yíng)養(yǎng)元素，類似于一個(gè)細(xì)胞內(nèi)的垃圾回收處理系統(tǒng)。目前為止，在植物中，有關(guān) 細(xì)胞自噬的分子機(jī)理和生理功能研究仍然僅限于擬南芥等模式物種上，在重要農(nóng)作物中的 報(bào)道較少。
[0003] 已有的研究表明，水稻中至少存在33個(gè)自噬相關(guān)蛋白，參與應(yīng)答水稻在激素處理、 氮饑餓與逆境下的表達(dá)反應(yīng)。該基因編碼一個(gè)水稻自噬相關(guān)蛋白基因，該基因在水稻基因 組數(shù)據(jù)庫(kù)（MSU Rice Genome Annotation Project Database and Resource,http:// rice · plantbiology .msu · edu/index · shtml)中的編號(hào)為L(zhǎng)0C_0s04g53240，命名為0sATG8b (Oryza sativa Autophagy-related Gene處）。該基因編碼一個(gè)包含360個(gè)核苷酸的開放 閱讀框，其序列如SEQ ID NO. 1所示。其編碼蛋白具有119個(gè)氨基酸殘基，其序列如SEQ ID NO. 2所示。
[0004] 重金屬鎘是一種毒性元素，極易在水稻體內(nèi)富集，并通過食物鏈進(jìn)入人體，危害人 體健康。我國(guó)水稻栽培區(qū)耕地土壤鎘污染極其嚴(yán)重，因此，通過克隆水稻鎘耐受及解毒相關(guān) 基因，并研究該基因?qū)Φ久祖k積累的影響，具有重要的意義。
[0005] 目前，還沒有文獻(xiàn)報(bào)道水稻自噬相關(guān)蛋白OsATGSb基因是否能影響重金屬(特別是 鎘)在水稻中的的耐受或者積累。
[0006] 在本發(fā)明中，主要公開了其中的一個(gè)水稻自噬相關(guān)蛋白，0sATG8b，在參與水稻應(yīng) 答重金屬鎘脅迫方面的應(yīng)用，以及該蛋白在調(diào)控工程菌釀酒酵母對(duì)鎘的耐受和積累方面的 應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種水稻自噬相關(guān)蛋白OsATGSb及其編碼基因 0sATG8b的新應(yīng)用。
[0008] 本發(fā)明的水稻自噬相關(guān)蛋白0sATG8b，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，其編碼 基因0sATG8b的的cDNA核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。應(yīng)當(dāng)理解，考慮到密碼子的簡(jiǎn)并性， 在不改變氨基酸序列的前提下，對(duì)上述編碼基因的核苷酸序列進(jìn)行修改，也屬于本發(fā)明的 保護(hù)范圍內(nèi)。
[0009] 氨基酸序列如SEQ ID如.2所示的水稻自噬相關(guān)蛋白〇8六了6813和/或〇84了6813基因 在提高轉(zhuǎn)基因植物對(duì)重金屬的耐受中的應(yīng)用，所述重金屬為〇(1、〇1、211，所述〇84了6813基因?yàn)?如SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列，或?yàn)榕cSEQ ID NO. 1互補(bǔ)配對(duì)的核苷酸序列，或?yàn)榫幋a 氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示的水稻自噬相關(guān)蛋白的核苷酸序列。
[0010] 氨基酸序列如SEQ ID如.2所示的水稻自噬相關(guān)蛋白〇8六了6813和/或〇84了6813基因 在降低轉(zhuǎn)基因植物對(duì)重金屬的積累中的應(yīng)用，所述重金屬為Cd、Cu、Zn，所述0sATG8b基因的 cDNA為如SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列，或?yàn)榕cSEQ ID N0.1互補(bǔ)配對(duì)的核苷酸序列，或 為編碼氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示的水稻自噬相關(guān)蛋白的核苷酸序列。
[0011] 優(yōu)選地，所述植物為水稻。
[0012] 優(yōu)選地，所述重金屬為Cd。
[0013] 氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示的ATG8和/或核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示 0sATG8b基因在水稻育種中調(diào)控對(duì)高鹽、抗病脅迫中的應(yīng)用。
[0014] 本發(fā)明將0sATG8b基因應(yīng)用于植物基因工程中，用于改變轉(zhuǎn)基因植物對(duì)重金屬鎘 的耐受和富集的可能性。本發(fā)明公開了 OsATGSb基因在鎘、鋅、銅脅迫下的誘導(dǎo)表達(dá)特征，表 明了該基因參與重金屬脅迫的應(yīng)答及解毒。本發(fā)明采用real time PCR的方法鑒定了 0sATG8b基因在重金屬Cd、Cu、Zn和多種逆境脅迫及激素處理下的表達(dá)特征，表明該基因在 包括重金屬在內(nèi)的多種脅迫處理下均有誘導(dǎo)表達(dá)的特征，而在根中的表現(xiàn)尤其明顯，論證 了該基因?yàn)樗倔w內(nèi)應(yīng)答重金屬(包括鎘)及其他脅迫的重要基因，進(jìn)一步延伸了該基因作 為影響水稻重金屬積累和脅迫的候選功能基因。在本發(fā)明中，OsATGSb基因的表達(dá)還受過氧 化氫，甲基紫精，茉莉酸甲酯，NaCl和甘露醇等誘導(dǎo)，進(jìn)一步表明了該基因也參與調(diào)控了上 述代謝及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，可將該基因應(yīng)用于上述基因工程領(lǐng)域。
[0015] 本發(fā)明的另一目的是公開一種釀酒酵母重組表達(dá)載體及其應(yīng)用，該重組載體插入 了OsATGSb基因。將該重組載體轉(zhuǎn)化進(jìn)入釀酒酵母中，通過半乳糖誘導(dǎo)該基因在酵母中的超 表達(dá)，能夠在鎘脅迫下，提高酵母對(duì)重金屬鎘的耐受，并降低酵母細(xì)胞內(nèi)鎘積累。
[0016] 實(shí)現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案如下。
[0017] 插入有0sATG8b基因的釀酒酵母重組表達(dá)載體，所述0sATG8b基因?yàn)槿鏢EQ ID NO.2所示的核苷酸序列，或?yàn)榕cSEQ ID NO.2互補(bǔ)配對(duì)的核苷酸序列，或?yàn)榘被嵝蛄腥?SEQ ID N0.2所示的水稻自噬相關(guān)蛋白的核苷酸序列。
[0018] 上述釀酒酵母重組表達(dá)載體在提高工程菌株釀酒酵母對(duì)重金屬鎘的耐受性中的 應(yīng)用。
[0019] 上述釀酒酵母重組表達(dá)載體在降低工程菌株釀酒酵母對(duì)重金屬鎘的積累中的應(yīng) 用。
[0020] 本發(fā)明的另一目的是提供一種改良水稻中重金屬鎘的耐受性的生物制劑。
[0021 ]實(shí)現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案如下。
[0022] -種提高水稻中重金屬鎘耐受性的生物制劑，其活性成份為上述釀酒酵母重組表 達(dá)載體，或其活性成份含有0sATG8b基因，所述OsATG8b基因的cDNA為如SEQ ID NO. 1所示的 核苷酸序列，或?yàn)榕cSEQ ID NO. 1互補(bǔ)配對(duì)的核苷酸序列，或?yàn)榫幋a氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所不的水稻自相關(guān)蛋白的核昔酸序列。
[0023] -種降低水稻中重金屬鎘積累的生物制劑，其活性成份來源于上述釀酒酵母重組 表達(dá)載體，或其活性成份含有調(diào)控0sATG8b基因表達(dá)的生物制品，所述0sATG8b基因的cDNA 為如SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列，或?yàn)榕cSEQ ID NO. 1互補(bǔ)配對(duì)的核苷酸序列，或?yàn)榫?碼氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示的水稻自噬相關(guān)蛋白的核苷酸序列。
[0024] 本發(fā)明還提供一種調(diào)控水稻中重金屬鎘耐受性或重金屬鎘積累的方法。具體如 下。
[0025] -種調(diào)控水稻中重金屬鎘耐受性或重金屬鎘積累的方法，該方法步驟中包括調(diào)控 水稻中0sATG8b基因的表達(dá)，所述所述0sATG8b基因?yàn)槿鏢EQ ID N0.1所示的核苷酸序列，或 為與SEQ ID N0sATG8b基因 0.1互補(bǔ)配對(duì)的核苷酸序列，或?yàn)榫幋a氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所不的水稻自相關(guān)蛋白的核昔酸序列。
[0026] 本發(fā)明的有益效果如下：
[0027] 在本發(fā)明中，我們通過對(duì)篩選文庫(kù)獲得的OsATGSb基因的進(jìn)行應(yīng)用性探索，發(fā)現(xiàn)該 基因以下應(yīng)用方式：（1)該基因在釀酒酵母中的超量表達(dá)能夠提高酵母對(duì)重金屬鎘的耐受 性；（2)在釀酒酵母中的超量表達(dá)能夠降低酵母細(xì)胞對(duì)重金屬鎘的積累，促進(jìn)酵母體內(nèi)鎘的 外排。
[0028] 本發(fā)明也可推廣至農(nóng)業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域，通過改變0sATG8b基因在農(nóng)作物中的表達(dá)， 調(diào)控農(nóng)作物對(duì)重金屬鎘的耐受和富集，以及參與農(nóng)作物對(duì)多種逆境脅迫的適應(yīng)性改變。
【附圖說明】
[0029]圖1示水稻0sATG