ium)上生長(zhǎng)，即可誘導(dǎo) 0sATG8b在酵母中異源超量表達(dá)。
[0049] 酵母轉(zhuǎn)化采用的方法為醋酸鋰轉(zhuǎn)化法，具體步驟如下：
[0050] 1)接種待轉(zhuǎn)化的酵母菌株Δ ycfl的單菌落于5mL YPD液體培養(yǎng)基中，于30°C恒溫 搖床(200rpm)，培養(yǎng)過夜達(dá)到飽和。
[00511 2)按照1: 100比例轉(zhuǎn)移上述培養(yǎng)物到20mL YPD液體培養(yǎng)基中于30°C恒溫?fù)u床 (200rpm)繼續(xù)培養(yǎng)，搖3-5h至菌液0D_值達(dá)0· 4-0 · 6 ·
[0052] 3)培養(yǎng)液在室溫條件下4000g離心5min，收集細(xì)胞。細(xì)胞用10mL無菌超純水重懸， 再于室溫下5000-6000g離心5min，沉淀細(xì)胞。
[0053] 4)細(xì)胞用2mL鋰鹽溶液重懸，鋰鹽溶液按照下表配制(現(xiàn)配現(xiàn)用）：
[0054]
[0055] 5)將2yL待轉(zhuǎn)化質(zhì)粒和10yL變性鮭魚精一起加入1.5mL離心管中混勻。
[0056] 6)往每個(gè)離心管中加入200yL用鋰鹽溶液重懸的細(xì)胞懸液，再加入lmL新鮮配制的 PEG溶液。PEG溶液的配方為：
[0057]
[0058] 30Γ 搖蕩溫育 30min。
[0059] 7)于42°C熱激15min，室溫下離心5s，細(xì)胞沉淀用200yL-lmL 1XTE緩沖液(從10X 儲(chǔ)液新鮮配制）重懸，并取其中200yL涂布在添加了半乳糖的SD固體培養(yǎng)基平板上。30 °C培 養(yǎng)2-5天，直到出現(xiàn)轉(zhuǎn)化子。
[0060] 挑取酵母菌株Δ ycf 1轉(zhuǎn)化空載體PYES260和0sATG8b基因超表達(dá)載體0sATG8b-PYES260的單克隆，接種于2ml添加了半乳糖的SD液體培養(yǎng)基中，30°C恒溫?fù)u床(200rpm)培 養(yǎng)至菌液〇D 6Q()值達(dá)2。按照1:1、1:10、1:100、1:1000將菌液進(jìn)行逐級(jí)稀釋，分別吸取2μ1逐級(jí) 稀釋的菌液滴至添加有0. 〇75mM Cd的SD(添加半乳糖）固體培養(yǎng)基平板上。30°C培養(yǎng)7天，觀 察酵母生長(zhǎng)情況。
[0061 ] 如圖3所示，超表達(dá)0sATG8b基因的轉(zhuǎn)基因酵母相比較于轉(zhuǎn)化空載體PYES260的Δ ycf!酵母突變株而言，能夠在添加 0.075mM Cd的SD中生長(zhǎng)，而未表達(dá)0sATG8b基因的酵母 (轉(zhuǎn)化空載體PYES260)則不能生長(zhǎng)，表明0sATG8b基因在酵母中的表達(dá)能夠提高酵母對(duì)重金 屬鎘的耐受性。
[0062]實(shí)施例4: 0sATG8b基因在釀酒酵母中的表達(dá)降低酵母體內(nèi)鎘的積累
[0063] 培養(yǎng)釀酒酵母菌株野生型WT和Δ ycfl (購自歐洲酵母研究中心Euroscarf， http://web·uni-frankfurt ·de/fbl5/mikro/eu;roscarf/，菌株編號(hào)Y00000和Y04069)，米 用實(shí)施例2的方法轉(zhuǎn)化酵母表達(dá)載體空載體PYES260和0sATG8b基因超表達(dá)載體0sATG8b-PYES260。在超凈臺(tái)中用無菌牙簽挑取四種酵母轉(zhuǎn)化子(酵母菌株野生型WT和Δ yCfl分別轉(zhuǎn) 化PYES260和0sATG8b-pYES260)到2mL添加了半乳糖的生長(zhǎng)選擇合成培養(yǎng)基（Selective Growth Synthetic Medium，SD medium)液體培養(yǎng)基中，30°C恒溫?fù)u床（200rpm)培養(yǎng)至菌液 〇D6qQ值達(dá)2。之后將兩種酵母按照1:500的體積比接種于600ml添加了半乳糖的SD液體培養(yǎng) 基中，30°C搖床(200-250rpm)培養(yǎng)約12小時(shí)至0D6QQ值達(dá)2,之后分別添加 CdCl2至終濃度20μ Μ。繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)后離心收集菌體。采用雙蒸水清洗菌體3遍后，將菌體65°C干燥3-5天，干 燥的酵母塊進(jìn)行微波消解后，采用火焰法原子吸收光譜測(cè)定酵母細(xì)胞中鎘的積累。
[0064] 在本發(fā)明中，轉(zhuǎn)化0sATG8b-pYES260的兩種酵母菌株(WT和Aycfl)在添加有20μΜ 的CdCl2的培養(yǎng)基中，體內(nèi)積累的鎘均顯著低于轉(zhuǎn)化PYES260空載體的酵母菌株(見圖4所 示），這表明OsATGSb基因在酵母體內(nèi)的表達(dá)降低了酵母細(xì)胞對(duì)重金屬鎘的富集，促進(jìn)了酵 母體內(nèi)鎘的外排。
[0065] 本發(fā)明也可推廣至農(nóng)業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域，通過改變0sATG8b基因在農(nóng)作物中的表達(dá)， 調(diào)控農(nóng)作物對(duì)重金屬鎘的耐受和富集，以及參與農(nóng)作物對(duì)多種逆境脅迫的適應(yīng)性改變。
[0066]以上所述實(shí)施例僅表達(dá)了本發(fā)明的幾種實(shí)施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并 不能因此而理解為對(duì)本發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員 來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保 護(hù)范圍。因此，本發(fā)明專利的保護(hù)范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 氨基酸序列如SEQ ID ^).2所示的水稻自噬相關(guān)蛋白〇8六了6813和/或〇84了6813基因在 提高轉(zhuǎn)基因植物對(duì)重金屬的耐受中的應(yīng)用，所述重金屬為〇(1、〇1、211，所述〇84了6813基因的 cDNA為如SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列，或?yàn)榕cSEQ ID N0.1互補(bǔ)配對(duì)的核苷酸序列，或 為編碼氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的水稻自噬相關(guān)蛋白的核苷酸序列。2. 氨基酸序列如SEQ ID ^).2所示的水稻自噬相關(guān)蛋白〇8六了6813和/或〇84了6813基因在 降低轉(zhuǎn)基因植物對(duì)重金屬的積累中的應(yīng)用，所述重金屬為Cd、Cu、Zn，所述0sATG8b基因的 cDNA為如SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列，或?yàn)榕cSEQ ID NO. 1互補(bǔ)配對(duì)的核苷酸序列，或 為編碼氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的水稻自噬相關(guān)蛋白的核苷酸序列。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征是，所述植物為水稻。4. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征是，所述重金屬為Cd。5. 氨基酸序列如SEQIDN0.2所示的ATG8和/或核苷酸序列如SEQIDN0.1所示 0sATG8b基因在水稻育種中調(diào)控對(duì)高鹽、抗病脅迫中的應(yīng)用。6. 插入有0sATG8b基因的釀酒酵母重組表達(dá)載體，所述0sATG8b基因的cDNA為如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，或?yàn)榕cSEQ ID NO.1互補(bǔ)配對(duì)的核苷酸序列，或?yàn)榫幋a氨基酸序列 如SEQ ID NO.2所示的水稻自噬相關(guān)蛋白的核苷酸序列。7. 權(quán)利要求6所述的釀酒酵母重組表達(dá)載體在提高工程菌株釀酒酵母對(duì)重金屬鎘的耐 受性中的應(yīng)用。8. 權(quán)利要求6所述的釀酒酵母重組表達(dá)載體在降低工程菌株釀酒酵母對(duì)重金屬鎘的積 累中的應(yīng)用。9. 一種提高水稻中重金屬鎘耐受性或降低水稻中重金屬鎘積累的生物制劑，其特征 是，其活性成份來源于權(quán)利要求6所述的釀酒酵母重組表達(dá)載體，或其活性成份含有含有調(diào) 控0sATG8b基因表達(dá)的生物制品，所述0sATG8b基因的cDNA為如SEQ ID NO. 1所示的核苷酸 序列，或?yàn)榕cSEQ ID NO. 1互補(bǔ)配對(duì)的核苷酸序列，或?yàn)榫幋a氨基酸序列如SEQ ID NO.2所 不的水稻自相關(guān)蛋白的核昔酸序列。10. -種調(diào)控水稻中重金屬鎘耐受性或重金屬鎘積累的方法，其特征是，該方法步驟中 包括調(diào)控水稻中0sATG8b基因的表達(dá)，所述所述0sATG8b基因的cDNA為如SEQ ID NO. 1所示 的核苷酸序列，或?yàn)榕cSEQ ID NOsATGSb基因0.1互補(bǔ)配對(duì)的核苷酸序列，或?yàn)榫幋a氨基酸 序列如SEQ ID N0.2所不的水稻自相關(guān)蛋白的核昔酸序列。
【專利摘要】本發(fā)明公開了水稻自噬相關(guān)蛋白OsATG8b及其編碼基因在改良植物對(duì)重金屬的耐受性或積累性中的應(yīng)用。該基因在工程菌釀酒酵母中表達(dá)可以提高酵母對(duì)鎘的耐受能力，可以降低酵母中的鎘含量，表明OsATG8b蛋白具有重金屬鎘解毒的能力。若將該基因在工程菌中進(jìn)行轉(zhuǎn)基因表達(dá)，一方面，可以提高工程菌對(duì)重金屬鎘耐受性，另一方面也可以降低轉(zhuǎn)基因酵母菌對(duì)重金屬鎘的積累，從而將該工程菌應(yīng)用于針對(duì)重金屬鎘污染的微生物遺傳改造工程。該基因具有應(yīng)用于植物抗鎘的遺傳工程育種的潛力，通過調(diào)控該基因在植物中的表達(dá)，可以改變轉(zhuǎn)基因植物對(duì)重金屬鎘耐受性，也可以改變轉(zhuǎn)基因植物對(duì)重金屬鎘的積累，從而克服重金屬鎘污染土壤中農(nóng)產(chǎn)品因鎘富集導(dǎo)致的品質(zhì)下降問題。該基因具有應(yīng)用于農(nóng)作物低鎘或抗鎘的遺傳工程育種的潛力。
【IPC分類】C12N15/82, C12N15/81, A01H5/00
【公開號(hào)】CN105624186
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201610066712
【發(fā)明人】張美 , 莫輝, 李靜
【申請(qǐng)人】中國(guó)科學(xué)院華南植物園
【公開日】2016年6月1日
【申請(qǐng)日】2016年1月29日