一種培養(yǎng)戊型肝炎病毒的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種戊型肝炎病毒毒株在體外成功培養(yǎng)并提高子代病毒復(fù)制效率的新方法。
【背景技術(shù)】
[0002]戊型肝炎病毒(hepatitis E virus, HEV)是一種經(jīng)腸道傳播，嚴重危害人類健康的病毒性肝炎病原體，并且可以跨種間感染人和多種動物。HEV為無囊膜單股正鏈RNA病毒，呈球形、直徑27?34nm無囊膜，核衣殼呈二十面體立體對稱，表面有突起和缺刻，內(nèi)部密度不均勻，基因組全長約為7.3 kb，由3個開放閱讀框組成。全球HEV主要有4種基因型，在中國主要以IV型HEV毒株常見。HEV傳播途徑主要經(jīng)糞-口途徑，也可通過其他途徑傳播，包括血液傳播，接觸傳播，垂直傳播，以及器官移植進行傳播等。
[0003]戊型肝炎病毒導(dǎo)致每年大約2000萬人感染。由此而導(dǎo)致每年大約300萬人患急性病癥，而7萬人死亡。戊型肝炎的病死率是所有病毒性肝炎中最高的，對孕婦和胎兒危害尤為嚴重，妊娠晚期感染HEV后死亡率高達25%，極易造成胎兒早產(chǎn)、流產(chǎn)和死胎。世界衛(wèi)生組織(WHO)估計，全球1/3的人口曾感染過戊型肝炎病毒。南亞和東亞每年約發(fā)生650萬例戊肝，導(dǎo)致16萬人死亡及2700例胎兒死胎。我國1986?1988年新疆地區(qū)戊肝大流行造成20多萬人發(fā)病，死亡707人(孕婦414人)，是迄今為止世界上最大的HEV流行。因此，戊型肝炎的防控形勢已經(jīng)迫在眉睫，發(fā)展有效的戊型肝炎疫苗已成為關(guān)系公眾健康的急為緊迫的問題，而在這一過程中病毒培養(yǎng)至關(guān)重要。
[0004]病毒培養(yǎng)是研究病毒生物學(xué)特性，致病機理及疫苗研制的基礎(chǔ)。自1983年首次電鏡下觀察到HEV病毒顆粒，距今已經(jīng)超過30年，一直以來，大量涉及HEV的研究，病毒的體外培養(yǎng)一直是研究的熱點和難點之一，這也就嚴重阻礙了病毒的復(fù)制機制和致病機理的研究，進而阻滯了HEV疫苗的研發(fā)。直到2007年Tanaka等，嘗試用21種細胞系培養(yǎng)HEV，HEV在A549和PLC/PRF/5細胞中增殖較快且易于被檢測，2011年Okamoto和Tanaka等，進一步利用A549和PLC/PRF/5細胞系成功建立了HEV細胞培養(yǎng)體系，通過接種高滴度的病毒(107)后獲得了更高滴度的子代病毒(接種50天后達到18)，HEV體外培養(yǎng)體系的建立為后續(xù)HEV復(fù)制機制、抗病毒藥物研發(fā)等奠定堅實的基礎(chǔ)。然而，HEV病毒復(fù)制仍然受限，因而必須優(yōu)化其培養(yǎng)條件。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種戊型肝炎病毒(HepatitisE Virus，HEV)在體外培養(yǎng)的方法，該方法通過細胞轉(zhuǎn)染miRNA-A6 24h后接種病毒，能夠使病毒大量復(fù)制，為深入研究HEV生物學(xué)、免疫學(xué)特性及HEV疫苗的研發(fā)提供必不可少的病原材料，為戊型肝炎的藥物篩選與評價提供有效的體外實驗?zāi)Ｐ汀?br>[0006]本發(fā)明戊型肝炎病毒體外培養(yǎng)方法，采用如下步驟進行:
(I)將HEV病毒溶液經(jīng)0.22μπι濾膜過濾除菌后，加入病毒溶液體積I?2%的雙抗溶液，4°C處理lh，-80°c保存?zhèn)溆?，?jīng)Real-time qPCR測定其病毒拷貝數(shù)為2 X 15?2 X 16拷貝數(shù)/mL，其中雙抗溶液為含有400U/mL青霉素和1000U/mL鏈霉素的溶液；
(2)將A549細胞按2X 15/孔接種至6孔板中，用含質(zhì)量百分比10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基在37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中靜止培養(yǎng)細胞，直至細胞匯合度70%?80%; I XI3BS洗滌細胞3次，加入無血清的DMEM培養(yǎng)基，將miRNA-A6脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染混合物滴入孔板中，6h后采用I XI3BS洗滌細胞3次，加入10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，在37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中靜止培養(yǎng)24h;
(3)將步驟(I)的HEV病毒懸液按每孔500yL接種至步驟(2)的細胞中，置37°C孵育I小時，每15min輕微搖勻一次，使病毒充分吸附到細胞上，同時添加0.0lmM MgCl2保護病毒顆粒的完整性及增強病毒與細胞的吸附作用；棄上清，I XPBS洗滌細胞3次，加入含質(zhì)量百分比2%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置于37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)；
(4)接種HEV病毒6?7天后A549細胞出現(xiàn)病變現(xiàn)象，反復(fù)凍融，收集病變細胞及培養(yǎng)液，-80 °C保存待用。
[0007]所述miRNA-A6脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染混合物是常規(guī)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑與miRNA-A6序列按體積質(zhì)量比(μ?:yg)l:1?1:5的比例混合制得，其中miRNA-A6序列如SEQ ID NO:1所示。
[0008]相比于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明采用戊型肝炎病毒在轉(zhuǎn)染miRNA-A6的A549細胞中培養(yǎng)6?7天，可使病毒復(fù)制效率增加至1.17 X 18拷貝數(shù)/mL。
[0009]采用本發(fā)明方法對分離自中國云南省的豬HEV和人HEV病毒，HEV毒株能在體外培養(yǎng)，培養(yǎng)上清液中未經(jīng)濃縮的病毒滴度約2X 18拷貝數(shù)/mL，細胞轉(zhuǎn)染miRNA-A6后接種該病毒可以有效促進病毒的復(fù)制，病毒在-80°C冰箱保存3年生物活性不變，仍能感染人肺癌細胞(A549)株，在體外可以連續(xù)傳代到10代以上。
【附圖說明】
[0010]圖1是本發(fā)明中使用的A549細胞感染HEV的示意圖；其中A圖為正常A549細胞，8圖為HEV感染6天未轉(zhuǎn)染的A549細胞，C圖為HEV感染6天轉(zhuǎn)染miRNA-A6的A549細胞。
[0011]圖2是本發(fā)明中Real-TimeqPCR檢測培養(yǎng)上清液中病毒定性示意圖；其中I為正常A549細胞，2為HEV感染未轉(zhuǎn)染的A549細胞，3為轉(zhuǎn)染miRNA_A6的HEV感染A549細胞。
[0012]圖3是本發(fā)明中Western blot檢測HEV 0RF2蛋白示意圖；其中I為正常A549細胞;2為HEV感染未轉(zhuǎn)染的A549細胞，3為HEV感染轉(zhuǎn)染miRNA-A6的A549細胞。
[0013]圖4是本發(fā)明中Westernblot檢測HEV 0RF2蛋白灰度密度示意圖；其中I為正常A549細胞;2為HEV感染未轉(zhuǎn)染的A549細胞，3為HEV感染轉(zhuǎn)染miRNA-A6的A549細胞。
【具體實施方式】
[0014]下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步詳細說明，但本發(fā)明保護范圍不局限于所述內(nèi)容;實施例中主要采用常規(guī)的細胞生物學(xué)方法，這些方法是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的。按照以下實施例，不難根據(jù)具體情況略作修改和變換而成功實施本發(fā)明，這些修改和變換均落在本申請權(quán)利要求的范圍內(nèi)。
[0015]實施例1:A549細胞培養(yǎng)
1、自液氮中取出A549細胞(購買于美國ATCC，編號CCL-185)迅速放入37°C的溫水中，使細胞懸液快速融化；然后加入含有10%新生牛血清DMEM(購買于GIBCO InvitrogenCorporat1n公司)培養(yǎng)液，調(diào)pH至7.2于37°C培養(yǎng)4h左右，棄去全部培養(yǎng)液，加入新鮮的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，待長成致密單層后，用PBS(購買于GIBCO Invitrogen Corporat1n公司)洗細胞，胰酶-EDTA(購買于GIBCO Invitrogen Corporat1n公司)消化，加入上述培養(yǎng)液，置于37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，如圖1A正常A549細胞所示。
[0016]2、用轉(zhuǎn)染miRNA-A6的A549細胞培養(yǎng)HEV
(1)將收集到的用于HEV分離的HEV陽性糞便制備重量體積比10%的I3BS(pH7.4)糞便懸液，劇烈震蕩，使糞便乳化，經(jīng)40C，12000g離心1min，收集上清液，0.22μπι濾膜過濾除菌，加入病毒溶液體積2%的雙抗溶液(400U/mL青霉素和1000U/mL鏈霉素)，4°C處理Ih，-80 °C保存?zhèn)溆?，?jīng)Real-time qPCR測定其病毒拷貝數(shù)為2 X 15拷貝數(shù)/mL;
分離自中國云南昆明市HEV RNA陽性豬糞便樣品，基因型為4型，毒株號為KMOl株。
(2)將步驟I中細胞(A549細胞)按2X 15/孔接種至6孔板中，用質(zhì)量百分比為10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基在37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中靜止培養(yǎng)細胞，直至細胞匯合度70%?75