高效表達(dá)海腎熒光素酶基因的重組HCoV-OC43病毒及其應(yīng)用
【專利說明】
[0001]技術(shù)領(lǐng)域本發(fā)明涉及人冠狀病毒0C43重組病毒，尤其涉及一株高效表達(dá)海腎熒光素酶基因的人冠狀病毒0C43重組病毒，本發(fā)明還涉及該0C43重組病毒在抗冠狀病毒藥物篩選實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用，屬于表達(dá)海腎熒光素酶基因的人冠狀病毒0C43重組病毒的拯救和應(yīng)用領(lǐng)域。
[0002]【背景技術(shù)】人冠狀病毒0C43(Human coronavirus 0C43，HCoV_0C43)是目前已知的6種人冠狀病毒中的一種，該病毒最早發(fā)現(xiàn)于1967年美國馬里蘭州貝塞斯達(dá)市，從一名上呼吸道感染患者中分離獲得。據(jù)報(bào)道約有5%?20%的人呼吸道感染是由HCoV-0C43引起的，人感染HCoV-0C43后一般會(huì)出現(xiàn)上呼吸道感染的臨床特征，如鼻炎、咽炎和喉痛等，但是越來越多的實(shí)驗(yàn)證明，HCoV-0C43會(huì)使免疫功能低下的人群，如嬰幼兒和老年人表現(xiàn)出支氣管炎、肺炎等嚴(yán)重的下呼吸道癥狀。最近，隨著研究的深入，病毒學(xué)者們還發(fā)現(xiàn)HCoV-0C43具有嗜神經(jīng)性，在患有急性弛緩性麻痹病例患者的鼻咽拭子中檢測到了 HCoV-0C43和HCoV-229E病毒的共感染。HCoV-0C43屬于β群，同屬于該群人冠狀病毒的還有HCoV-HKUl、SARS-CoV和MERS-CoV，其中2003年爆發(fā)的SARS-CoV和2012年9月在沙特地區(qū)爆發(fā)的MERS-CoV都能夠引起嚴(yán)重的呼吸道疾病。針對這6種人冠狀病毒，特別是2種新型冠狀病毒，目前尚無特效藥和疫苗，因此構(gòu)建一株能夠用于高通量篩選抗人冠狀病毒藥物的重組病毒迫在眉睫。
[0003]HCoV-0C43與其它冠狀病毒相似，是一種有包膜的單股正鏈RNA病毒，基因組大小約31kb。冠狀病毒基因組RNA具有和真核生物mRNA—樣的5'端甲基化帽子結(jié)構(gòu)和3'端的多聚賴氨酸尾巴?；蚪MRNA的5'端是一段由65至98個(gè)堿基組成的“前導(dǎo)序列”，緊接著“前導(dǎo)序列”的是一段由200-400個(gè)堿基組成的“非翻譯區(qū)” (untranslated reg1n,UTR)，在基因組的3'端也有一段由300至500堿基組成的“非翻譯區(qū)”，這兩個(gè)“非翻譯區(qū)”的功能目前還不是很清楚，可能與冠狀病毒基因組包裝信號(hào)有關(guān)。冠狀病毒基因組5'端到2/3處的兩個(gè)開放閱讀框ORFla和ORFlb負(fù)責(zé)編碼16個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白，這些非結(jié)構(gòu)蛋白在病毒復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過程中發(fā)揮了重要作用。其中nsP5是主要的蛋白酶，在眾多冠狀病毒中nsp5蛋白的單體結(jié)構(gòu)均顯示出較高程度的結(jié)構(gòu)保守性，這也使得設(shè)計(jì)或篩選光譜抗冠狀病毒藥物成為可能，該蛋白也是第一個(gè)用于設(shè)計(jì)針對冠狀病毒廣譜抑制劑的蛋白。此外，HCoV-0C43基因組與同屬于β群的SARS-CoV和MERS-CoV具有極高的基因組相似性，特別是在ORFlb的復(fù)制酶(nspl2)和解旋酶(nspl3)區(qū)域，這兩個(gè)蛋白同樣也成為了研究抗冠狀病毒藥物的靶點(diǎn)。因此，以HCoV-0C43作為冠狀病毒模型可以不依賴于BSL3實(shí)驗(yàn)室，并用來研究冠狀病毒復(fù)制，病毒編碼蛋白的功能和篩選新型抗冠狀病毒藥物等。
[0004]反向遺傳操作技術(shù)的建立為研究冠狀病毒基因功能和抗病毒藥物篩選開辟了新的途徑。利用反向遺傳操作技術(shù)將外源報(bào)告基因插入病毒基因組中可以用來研究病毒的復(fù)制、病毒編碼蛋白的功能及抗病毒藥物的篩選等。例如，攜帶綠色熒光蛋白的SARS-CoV可用于影響病毒復(fù)制的宿主的篩選(de Wilde AH.et al.A Kinome-ffide Small InterferingRNA Screen Identifies Proviral and Antiviral Host Factors in Severe AcuteRespiratory Syndrome Coronavirus Replicat1n,Including Double-Stranded RNA-Activated Protein Kinase and Early Secretory Pathway Proteins.J Virol.2015,89,8318-8333.)。但是，利用綠色熒光蛋白標(biāo)記的SARS-CoV篩選抗冠狀病毒因子需要在生物安全防護(hù)三級實(shí)驗(yàn)室(BSL3)中進(jìn)行，而且綠色熒光蛋白的檢測需要通過借助熒光顯微鏡進(jìn)行判斷，而且誤差相對較大，因此在高通量篩選方面受到了限制。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]利用反向遺傳學(xué)技術(shù)拯救出4株表達(dá)海腎焚光素酶(Renilla luciferase,Rluc)基因的HCoVs-0C43重組病毒，其中一株重組病毒r0C43-ns2DelRluc能夠穩(wěn)定和高效表達(dá)Rluc基因，并且該重組病毒能夠快速檢測冠狀病毒的復(fù)制并且適用于高通量篩選抗冠狀病毒藥物，解決了現(xiàn)有熒光定量技術(shù)測定病毒拷貝數(shù)操作繁瑣以至在高通量篩選方面受到限制等問題。
【附圖說明】
[0006]圖1為pBAC-0C43FL(A)、pBAC-0C43-ns2DelRluc(B)、pBAC-0C43-ns2Fus1nRluc(C)、pBAC-0C43-nsl2.9StopRluc(D)和 pBAC-0C43-nsl2.9Fus1nRluc(E)的構(gòu)建示意圖；
[0007]圖2為4株重組病毒r0C43-ns2DelRluc、r0C43-ns2Fus1nRluc、r0C43-nsl2.9StopRluc 和 r0C43-nsl2.9Fus1nRluc 與親本病毒 HCoV-0C43_WT 免疫熒光鑒定結(jié)果，可見4株重組病毒均拯救成功；
[0008]圖3為4株重組病毒與親本病毒HCoV-0C43-WT的生長曲線，可見r0C43-ns2DelRluc與未本病毒生長動(dòng)力學(xué)較為相似，在不同時(shí)間點(diǎn)病毒滴度約降低了 3倍；
[0009]圖4為4株重組病毒Rluc基因表達(dá)的動(dòng)力學(xué)，可見r0C43-ns2DelRluc表達(dá)海腎熒光素酶活性最強(qiáng)，峰值為108( 144h);
[0010]圖5 為We stern blot檢測重組病毒 r0C43_ns2De IRluc和r0C43_ns2Fus1nRluc (A)r0C43-nsl2.9StopRluc和r0C43_nsl2.9Fus1nRluc(B)的N蛋白和Rluc蛋白的表達(dá)；
[0011]圖6為IFA測定4株重組病毒在連續(xù)傳代過程中的病毒滴度，可見4株重組病毒滴度在傳代過程中略有升高并最終趨于穩(wěn)定；
[0012]圖7為測定4株重組病毒在連續(xù)傳代過程中表達(dá)的Rluc活性，可見在傳代過程中，r0C43_ns2DelRlu(^Pr0C43-nsl2.9StopRluc的Rluc基因表達(dá)活性基本沒變，而r0C43_ns2Fus1nRluc和r0C43_nsl2.9Fus1nRluc的Rluc基因表達(dá)活性在傳代過程中均有所下降。
[0013]圖8為4株重組病毒在傳代過程中插入Rluc基因穩(wěn)定性測序?qū)嶒?yàn)，可見重組病毒r0C43-nsl2.9StopRluc 穩(wěn)定性最強(qiáng)，其次是 r0C43_ns2DelRluc，而 r0C43_ns2Fus1nRluc 和r0C43-nsl2.9Fus1nRluc插入外源基因穩(wěn)定性最差，分別在P4代和P6代即可檢測到堿基突變；
[0014]圖9為已報(bào)道HCoVs_0C43抗病毒藥物氯喹(Chloroquine)對重組病毒r0C43_nS2DelRluc和其親本病毒HCoV-0C43-WT復(fù)制的影響，可見隨著氯喹濃度的增加，能顯著抑制兩種病毒的復(fù)制；
[0015]圖10為Western blot檢測不同濃度氯喹對親本病毒HCoV-0C43_WT蛋白表達(dá)量的影響，可見隨著氯喹濃度的增加，親本病毒N蛋白合成量顯著下降；
[0016]圖11為氯喹對重組病毒抑043-11820611?111(3報(bào)告基因表達(dá)量的影響，可見隨著氯喹濃度的增加，rOC43-ns2DelRluc報(bào)告基因的表達(dá)量顯著下降。
[0017]圖12為抗病毒藥物病毒唑(Ribavirin)對重組病毒r0C43-ns2DelRluc和其親本病毒HCo V-0C43-WT復(fù)制的影響；可見隨著病毒唑濃度的增加，雖然能抑制兩種病毒的復(fù)制，但是需要較高的藥物濃度；
[0018]圖13為Western blot檢測不同濃度病毒唑?qū)τH本病毒HCoV-0C43_WT蛋白表達(dá)量的影響，可見隨著病毒唑濃度的增加(>10μΜ)，親本病毒N蛋白合成量隨之下降；
[0019]圖14為病毒唑?qū)χ亟M病毒r0C43-nS2DelRluc報(bào)告基因表達(dá)量的影響，可見隨著病毒唑濃度的增加，r0C43-ns2