一種提取擬南芥種子中總rna的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種提取擬南芥種子中總RNA的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] RNA提取是分子生物學(xué)研究領(lǐng)域的基礎(chǔ)，高產(chǎn)量，高純度的RNA樣品是后續(xù)進(jìn)行基 因克隆、基因表達(dá)、基因功能分析等研究的必要前提。因此，一套高效的RNA提取方法在分子 生物學(xué)研究中顯得非常重要。
[0003] 植物組織特別是高等植物組織細(xì)胞內(nèi)外組成成分的復(fù)雜多樣性，使得植物組織 RNA的提取比其他生物材料更加困難。富含酪類化合物和多糖類物質(zhì)，或含有大量次生代謝 產(chǎn)物，或內(nèi)源RNase含量較高是運(yùn)些植物RNA提取的主要障礙。很多植物組織含有大量的多 酪和多糖類物質(zhì)，酪類化合物在勻漿時極易被氧化成釀類物質(zhì)，與RNA不可逆地結(jié)合，從而 影響RNA的分離純化。多糖的許多理化性質(zhì)與RNA相似，在提取過程中能與RNA共沉淀，很難 將他們分開。
[0004] 公告號為CN 101638651 B的專利文獻(xiàn)公開了一種利用異硫氯酸脈-氯仿抽提、 Tris飽和酪純化植物RNA的抽提方法。改良了傳統(tǒng)的異硫氯酸脈法，采用裂解后氯仿抽提加 酪純化兩步法，分別從紅皮梨的葉片和果皮、葡萄的葉片和果肉、果皮組織W及草替果實(shí)和 新疆紫草愈傷組織中提取到了高質(zhì)量的總RNA。該方法的抽提緩沖液中含有異硫氯酸脈、十 二烷基肌氨酸鋼、巧樣酸鋼、可溶性聚乙締化咯燒酬和0-琉基乙醇，既能高效裂解植物細(xì)胞 釋放RNA，有效抑制RNA酶的活性，還能防止酪類物質(zhì)的氧化和排除次生代謝物質(zhì)的干擾。第 二步用化is飽和酪純化粗提RNA溶液，能除去與RNA共沉淀的多糖和蛋白質(zhì)。該方法操作步 驟簡單、經(jīng)濟(jì)實(shí)惠、穩(wěn)定性好，適用于從富含多糖多酪及次生代謝物質(zhì)的植物組織中提取高 質(zhì)量總RNA。
[0005] 擬南芥作為典型的模式植物，從擬南芥中提取純度高、完成性好的總RNA，有利于 其分子生物學(xué)研究的開展。但是擬南芥種子含有大量的脂類、蛋白、多糖多酪等物質(zhì)，嚴(yán)重 影響了RNA提取的質(zhì)量和純度，目前常用的提取方法如Trizol法、苯酪法、異硫氯酸脈酪法、 RNA plant plusW及Reagent Kits很難提取擬南芥種子RNA。
[0006] 公告號為CN 102220312 B的專利文獻(xiàn)公開了一種室溫提取花生種子中總RNA的方 法，包括如下步驟：（1)研磨花生未成熟種子，制得花生凍干粉；（2)將花生凍干粉加入 化izol試劑，然后加入β-琉基乙醇和聚乙締化咯燒酬振蕩，再加入苯酪/氯仿/異戊醇混合 液混合，靜置，20~32°C離屯、，取上清液；（3)加入氯仿/異戊醇混合液混合，靜置，20~32°C 離屯、，取上清液；（4)加入異丙醇混合，靜置，20~32°C離屯、，取沉淀，醇洗后，干燥，復(fù)溶，即 得。該方法離屯、步驟在20~32°C完成，且操作時間較原有技術(shù)時間短，從而縮短了 RNA被降 解的時間，重復(fù)性好，提取的花生種子總RNA具有得率高、完整性好等優(yōu)點(diǎn)。
[0007] 已有的報導(dǎo)提取含油脂、多糖、多酪的種子RNA的方法（如SIMONABIRTICJLSE KRANNER.，Phytochem. Anal. 2006,17 :144-148)應(yīng)用到擬南芥種子的RNA提取中，效果均不 理想，且提取步驟多，提取試劑貴；利用Trizol提取的RNA的快速方法化ing and Lewis, Biotechnol.J. ,2010,5:183-186)也不能在擬南芥種子中提取高純度的RNA，提取質(zhì)量不 好。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明提供了一種提取擬南芥種子中總RNA的方法，解決了現(xiàn)有技術(shù)中提取步驟 多、提取質(zhì)量不高的問題。
[0009] -種提取擬南芥種子中總RNA的方法，包括W下步驟：
[0010] (1)在液氮冷卻條件下研磨擬南芥種子，得擬南芥種子凍干粉；
[0011] (2)將擬南芥種子凍干粉加入到預(yù)熱的提取緩沖液中，再加入β-琉基乙醇，滿旋混 合，離屯、，吸取上清液，得第一離屯、上清液；
[001^ (3)第一離屯、上清液中加入氯仿和水飽和酪，滿旋混勻，18~25°C條件下離屯、，吸 取上清液，得第二離屯、上清液；
[0013] (4)第二離屯、上清液中加入氯化裡，靜置，離屯、，得第一離屯、沉淀；
[0014] (5)用DEPC水溶解第一離屯、沉淀，加乙酸鋼和異丙醇，靜置，離屯、，得第二離屯、沉 淀；
[0015] (6)將第二離屯、沉淀經(jīng)醇洗，干燥，復(fù)溶即得所述擬南芥種子總RNA。
[0016] 所述提取緩沖液的成分為：100ml Tris-肥laOmM抓TA，2%w/v十二烷基硫酸裡， 0.6M NaCl，0.4M巧樣酸Ξ鋼。
[0017] 作為優(yōu)選，步驟(2)中，每百毫克擬南芥種子凍干粉中加入提取緩沖液1~3mL，i3- 琉基乙醇50~15化L。
[001引本發(fā)明在提取緩沖液中添加抗氧化劑β-琉基乙醇、金屬離子馨合劑抓TA和腳ase 抑制劑十二烷基硫酸裡，高效裂解植物細(xì)胞和釋放RNA到水相。高鋼環(huán)境有利于RNA從種子 細(xì)胞中釋放。
[0019] 本發(fā)明研究表明，提取緩沖液加熱到一定溫度，有助于種子細(xì)胞的破碎和核酸的 釋放。作為優(yōu)選，步驟(2)中，提取緩沖液的預(yù)熱溫度為40~60°C。更為優(yōu)選的，提取緩沖液 的預(yù)熱溫度為60°C。
[0020] 作為優(yōu)選，步驟(2)中，滿旋振蕩1~2min。
[0021] 本發(fā)明用氯仿-水飽和酪代替?zhèn)鹘y(tǒng)的苯酪-氯仿-異戊醇的提取方法，避免了異戊 醇運(yùn)種有毒害試劑，而且不影響RNA的提取效果。
[0022] 氯仿-水飽和酪用于去除蛋白質(zhì)，作為優(yōu)選，步驟(3)中，氯仿添加量為1倍體積的 第一離屯、上清液，水飽和酪添加量為1倍體積的第一離屯、上清液。
[0023] 本發(fā)明在研究中發(fā)現(xiàn)，在進(jìn)行到步驟(3)時，4°C條件下離屯、，得到的離屯、液的分層 效果與常溫（18-25°C)離屯、相比，分層效果不好，得到的上清液回收效率低，常溫離屯、所得 上清液約是4°C離屯、所得上清液的1.5倍。因此，本發(fā)明對該步驟進(jìn)行了改進(jìn)，提高離屯、時的 溫度條件，在18~25°C條件下離屯、，得到更大體積的離屯、液。
[0024] 獲得的第二離屯、上清液經(jīng)高濃度氯化裡作用下選擇性沉淀RNA，降低多糖污染。作 為優(yōu)選，步驟(4)中，所述氯化裡的終濃度為2~3M。
[00巧]作為優(yōu)選，步驟(4)中，-80°C條件下靜置15min~化。更為優(yōu)選的，-80°C條件下靜 置化。本發(fā)明研究發(fā)現(xiàn)，靜置1小時得到的RNA產(chǎn)率最高。
[0026] 靜置結(jié)束，4°C、12000~13000巧m條件下離屯、3~5min，獲得RNA粗品。
[0027] 步驟(5)對RNA進(jìn)一步純化，RNA粗品重新溶于DEPC水中，用乙酸鋼除去多余的多糖 等物質(zhì)。作為優(yōu)選，步驟(5)中，所述乙酸鋼的終濃度為0.15~0.3M。
[00%]步驟(5)中，添加等體積異丙醇后，室溫靜置3~5min，異丙醇再次沉淀RNA。
[0029] 作為優(yōu)選，步驟(2)和(5)中，離屯、的條件為18~25°C。
[0030] 第二離屯、沉淀經(jīng)75%乙醇洗涂、室溫干燥后加入RNase free水溶解即得高質(zhì)量的 RNA。
[0031] 本發(fā)明具備的有益效果：（1)本發(fā)明對提取緩沖液進(jìn)行預(yù)熱，緩沖液中各組分充分 溶解，有助于植物細(xì)胞的裂解和RNA釋放；（2)本發(fā)明一次性加入足量的氯仿-酪，有效去除 蛋白等雜質(zhì)，減少抽提次數(shù)，減少RNA在提取過程中的損失；（3)本發(fā)明所述方法的離屯、在室 溫條件下進(jìn)行，有助于分相，提高RNA產(chǎn)量；（4)本發(fā)明方法操作時間短，重復(fù)性好，提取的擬 南芥種子的RNA純度好、質(zhì)量高，為其他高油、高脂、W及多糖多酪植物組織的提取提供技術(shù) 參考。
【附圖說明】
[0032] 圖1為實(shí)施例1提取的野生型擬南芥成熟種子總RNA的電泳圖，其中L為RNAmarker; 1-6為6個擬南芥成熟種子樣品。
【具體實(shí)施方式】
[0033] 下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，但下述實(shí)施例僅僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施 例，并非全部。基于實(shí)施方式中的實(shí)施例，本領(lǐng)域技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動的前提下 所獲得其它實(shí)施例，都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0034] 實(shí)施例中所用實(shí)驗用品處理及試劑配制說明：
[0035] RNA提取過程中所使用的槍頭、離屯、管等塑料器皿應(yīng)使用0.1%DEPC水浸泡后高壓 蒸汽滅菌，烘干。