[0036] 研鉢等工具用ImL無水乙醇燃燒滅菌。
[0037] 提取Buffer:100mM Tris-HCl(P朋.5)，10mM 抓TA(PH = 8.0)，2%(W/V)十二烷基 硫酸裡，0.6M NaCl，0.4M巧樣酸Ξ鋼，高壓滅菌。
[0038] β-琉基乙醇(Bio Basic Inc)、水飽和酪(北京鼎國）、0.1%DEPC(Biosha巧）水、異 丙醇、氯仿、均為普通分析純有機(jī)試劑。
[0039] 8M LiCl，LiCl為分析純無機(jī)試劑，力郵EPC水溶解。
[0040] 3M乙酸鋼(P冊(cè).2)，分析純乙酸鋼粉末，力郵EPC水溶解，利用冰醋酸調(diào)PH至5.2。
[0041 ] 75%乙醇用0.1%DEPC水配制。
[0042] 實(shí)施例1
[0043] 1、一種提取擬南芥種子中總RNA的方法，步驟如下：
[0044] l)擬南芥成熟種子約100mg，液氮研磨，加入60°C提前預(yù)熱的提取Buffe;rlmL，β- 琉基乙醇 50uL，滿旋 Imin，13000巧m、20°C 離屯、lOmin;
[0045] 2)吸取上清液(約1血），分裝在Ξ個(gè)1.5mL Eppendorf管，每管加入1倍體積氯仿，1 倍體積水飽和酪，滿旋15s，13000巧m、20 °C離屯、1 Omin;
[0046] 3)每管吸取上清液（約300uL)于1個(gè)1.5mL EppendoW管內(nèi)，加入1/3體積的8M LiCl，-80°C沉淀化，溶解，13000巧m，4°C 離屯、3min;
[0047] 4)去上清，加入500uL DEPC水溶解，加入1/10體積3M乙酸鋼(PH=5.2)和等體積異 丙醇，室溫靜置3min，13000巧m、20 °C離屯、5min，獲得沉淀；
[004引 5)沉淀經(jīng)75%乙醇洗涂，13000巧111、20°(：離屯、5111111，室溫干燥后加入30~40化 RNAase打ee水溶解，-80°C保存。
[0049] 2、擬南芥種子總RNA質(zhì)量檢測(cè)
[0050] 1)利用上述方法，對(duì)擬南芥成熟種子(6個(gè)樣品）進(jìn)行RNA提取，獲得RNA樣品。電泳 分析結(jié)果如圖1所示，5s、18s、28s條帶清晰、整齊，28s條帶亮度接近是18s條帶亮度的兩倍， 說明所提取的擬南芥種子總RNA具有完整性較好。
[0051 ] 2)將上述制得的擬南芥種子總RNA樣品，W滅菌的0.1 %DEPC水為空白對(duì)照，利用 Nano化op測(cè)得A260/28日和A230/26日值，檢測(cè)結(jié)果表明，所提取的擬南芥種子RNA的A260/28日在1.9~ 2.1之間，A230/260> 1.8，說明RNA純度較好；（RNA integarity number)RIN > 7，說明RNA完整 性好;具體純度及產(chǎn)率參見表1。
[0052]表1.擬南芥種子RNA純度及濃度檢測(cè)
[0化3]
[0化4]
[0化5] 實(shí)施例2
[0056] 提取流程參照實(shí)施例1，步驟（1)中提取緩沖液預(yù)熱溫度及步驟(3)中-80°C沉淀時(shí) 間見表2，其他參數(shù)同實(shí)施例1。
[0057] 提取得到的擬南芥種子總RNA樣品進(jìn)行純度、產(chǎn)率檢測(cè)，結(jié)果見表2。
[0058] 表2.不同提取條件下RNA樣品純度及產(chǎn)率檢測(cè)
[0化9]
[0060] 對(duì)比例1
[0061] 1、一種提取擬南芥種子中總RNA的方法，步驟如下：
[0062] l)擬南芥成熟種子約100mg，液氮研磨，加入60°C提前預(yù)熱的提取Buffe;rlmL，β- 琉基乙醇50uL，滿旋Imin，13000巧m、4°C離屯、lOmin;
[0063] 2)吸取上清液(約ImL)，分裝在Ξ個(gè)1.5mL Eppendorf管，每管加入1倍體積CIA(氯 仿:異戊醇=24:1)，1倍體積水飽和酪，上下顛倒混勻15次，13000巧m、4°C離屯、1 Omin;
[0064] 3)吸取上清液，平均分裝在兩個(gè)化pendorpf管內(nèi)，每管加入等體積的水飽和酪，顛 倒混勻;室溫靜置3111111，加入1/^2體積口4，劇烈搖晃混勻153，13000巧111，4°(：離屯、10111111;
[00化]4)吸取上清液于1個(gè)1.5mL E卵endorf·管內(nèi)，加入體積8M LiCl，-8(TC沉淀地， 溶解，13000巧m，4°C 離屯、5min;
[0066] 5)去上清，加入500uL DEPC水溶解，加入1/10體積3M乙酸鋼(PH=5.2)和等體積異 丙醇，室溫靜置3min，13000巧m、4°C離屯、5min，獲得沉淀；
[0067] 6)沉淀經(jīng)75%乙醇洗涂，13000巧111，4°(：離屯、5111111，室溫干燥后加入30~40化 RNAase打ee水溶解，-80°C保存。
[006引 2、擬南芥種子總RNA質(zhì)量檢測(cè)
[0069] 1)利用上述方法，對(duì)擬南芥成熟種子(6個(gè)樣品)進(jìn)行RNA提取，獲得RNA樣品。
[0070] 2)將上述制得的擬南芥種子總RNA樣品，W滅菌的0.1 %DEPC水為空白對(duì)照，利用 Nano化op測(cè)得A260/28日和A230/26日值，結(jié)果如表3所示。
[0071 ]表3.擬南芥種子RNA純度及產(chǎn)率檢測(cè)
[0072]
[0073] 由表3數(shù)據(jù)分析可知，對(duì)比例1的方法中在低溫條件下離屯、，其RNA的產(chǎn)率較室溫條 件離屯、的方法低。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種提取擬南芥種子中總RNA的方法，其特征在于，包括以下步驟： (1) 在液氮冷卻條件下研磨擬南芥種子，得擬南芥種子凍干粉； (2) 將擬南芥種子凍干粉加入到預(yù)熱的提取緩沖液中，再加入β-巰基乙醇，渦旋混合， 離心，吸取上清液，得第一離心上清液； (3) 第一離心上清液中加入氯仿和水飽和酚，渦旋混勻，18~25 °C條件下離心，吸取上 清液，得第二離心上清液； (4) 第二離心上清液中加入氯化鋰，靜置，離心，得第一離心沉淀； (5) 用DEPC水溶解第一離心沉淀，加乙酸鈉和異丙醇，靜置，離心，得第二離心沉淀； (6) 將第二離心沉淀經(jīng)醇洗，干燥，復(fù)溶即得所述擬南芥種子總RNA。2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述提取緩沖液的成分為：lOOmM Tris-HCl， 10mM EDTA，2%十二烷基硫酸鋰，0.6M NaCl，0.4M梓檬酸三鈉。3. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(2)中，每百毫克擬南芥種子凍干粉中加 入提取緩沖液1~3mL，β-巰基乙醇50~150yL。4. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(2)中，提取緩沖液的預(yù)熱溫度為40~60 Γ。5. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(2)中，渦旋振蕩1~2min。6. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(3)中，氯仿添加量為1倍體積的第一離 心上清液，水飽和酚添加量為1倍體積的第一離心上清液。7. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(4)中，所述氯化鋰的終濃度為2~3M。8. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(4)中，-80°C條件下靜置15min~2h。9. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(5)中，所述乙酸鈉的終濃度為0.15~ 0.3M〇10. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(2)和(5)中，離心的條件為18~25°C。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種提取擬南芥種子中總RNA的方法，包括：(1)在液氮冷卻條件下研磨擬南芥種子，得擬南芥種子凍干粉；(2)加入到預(yù)熱的提取緩沖液中，再加入β-巰基乙醇，渦旋混合，離心，吸取上清液；(3)加入氯仿和水飽和酚，渦旋混勻，18～25℃條件下離心，吸取上清液；(4)加入氯化鋰，靜置，離心，得第一離心沉淀；(5)用DEPC水溶解第一離心沉淀，加乙酸鈉和異丙醇，靜置，離心，得第二離心沉淀；(6)將第二離心沉淀經(jīng)醇洗，干燥，復(fù)溶即得所述擬南芥種子總RNA。本發(fā)明方法操作時(shí)間短，重復(fù)性好，提取的擬南芥種子的RNA純度好、質(zhì)量高，為其他高油、高脂、以及多糖多酚植物組織的提取提供技術(shù)參考。
【IPC分類】C12N15/10
【公開號(hào)】CN105671032
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201610201835
【發(fā)明人】甘銀波, 吳敏潔, 顏安, 盛喆承, 于濤
【申請(qǐng)人】浙江大學(xué)
【公開日】2016年6月15日
【申請(qǐng)日】2016年3月31日