(3)得到的上清液旋蒸濃縮至原體積的8%，然后按體積比1:4加入質(zhì)量濃度為95%的乙醇，攪拌后放入10°C條件下靜置24 h，8000rpm離心20min，取上清液減壓濃縮、冷凍干燥得滸苔功能性寡糖的固體，粉末后過100目篩；
(5)將步驟(4)中滸苔寡糖粗品粉末加蒸餾水溶解，粉末質(zhì)量與水體積比(g/mL)為1:50，溶液用截留分子量2000D透析袋處理，收集透析液，在40°(:及轉(zhuǎn)速為80 r/min條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，濃縮至原體積的1/5;濃縮液采用截留分子量500D透析袋處理，將截留液冷凍干燥，制備得到未糖基化滸苔寡糖精制品；
(6)步驟(5)得到的滸苔寡糖精制品按質(zhì)量與體積比(mg/mL)l:2溶解于蒸餾水中，將商品化巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶加入到反應(yīng)體系中進(jìn)行生物反應(yīng)，巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶用量與反應(yīng)體系按質(zhì)量與體積比(mg/mL)l: 5，反應(yīng)體系中消1笞寡糖與二磷酸鳥苷-巖藻糖濃度比(mM)l:1.5,MgCl2終濃度為20禮，？!18.0，置于40°(:溫度，100 r/min搖床條件下反應(yīng)36 h。
[0014](7)將步驟(6)反應(yīng)體系按體積比1:1添加95%乙醇，終止反應(yīng)并沉淀蛋白，10000r/min離心20min去除沉淀，收集上清濃縮，真空冷凍干燥后得到糖基化滸苔活性寡糖粗品。
[0015](8)將步驟(7)所得粗品溶解后過B1-Gel P_2聚丙烯酰胺凝膠，蒸餾水洗脫，經(jīng)3，5-二硝基水楊酸法測(cè)定收集寡糖組分，濃縮后真空冷凍干燥得到糖基化滸苔活性寡糖。
[0016]實(shí)施例3
(I)取干燥、超微粉碎、過90目篩的滸苔粉末，按重量體積比(g/mL)l: 26加入質(zhì)量濃度為75%的乙醇溶液，75°C下300W超聲提取1.3小時(shí)，提取結(jié)束后，進(jìn)行過濾，將濾渣重復(fù)上述步驟進(jìn)行3次提取，合并提取液，將獲得的濾液混合后進(jìn)行減壓濃縮至原體積的5%，真空冷凍干燥后粉碎，過70目篩；
(2 )向步驟(I)所得粉末中加入蒸餾水，其中粉末質(zhì)量與蒸餾水體積比為(g/mL) 1: 16，進(jìn)行攪拌復(fù)溶，用三氯乙酸法除蛋白4次；
(3)將步驟(2)所得到的溶液，通過HPD-826大孔吸附樹脂填充柱，洗脫液進(jìn)一步過非極性吸附劑活性炭，活性炭使用量與洗脫液按重量體積比(g/mL)l:40去除色素，于搖床中70!■/111；[11振蕩1.5 h，6000rpm離心20 min，收集上清液。
[0017](4)將步驟(3)得到的上清液旋蒸濃縮至原體積的6%，然后按體積比1: 3加入質(zhì)量濃度為95%的乙醇，攪拌后放入50C條件下靜置24 h，7000rpm離心17min，取上清液減壓濃縮、冷凍干燥得滸苔功能性寡糖的固體，粉末后過70目篩；
(5)將步驟(4)中滸苔寡糖粗品粉末加蒸餾水溶解，粉末質(zhì)量與水體積比(g/mL)為1:40，溶液用截留分子量2000D透析袋處理，收集透析液，在38°C及轉(zhuǎn)速為70 r/min條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，濃縮至原體積的1/10;濃縮液采用截留分子量500D透析袋處理，將截留液冷凍干燥，制備得到未糖基化滸苔寡糖精制品；
(6)步驟(5)得到的滸苔寡糖精制品按質(zhì)量與體積比(mg/mL)l:1.5溶解于蒸餾水中，將商品化巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶加入到反應(yīng)體系中進(jìn)行生物反應(yīng)，巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶用量與反應(yīng)體系按質(zhì)量與體積比(mg/mL)l: 4，反應(yīng)體系中消1笞寡糖與二磷酸鳥苷-巖藻糖濃度比(mM)l:1.2,MgCl2終濃度為18 mM，pH7，置于37°C溫度，90 r/min搖床條件下反應(yīng)30h。
[0018](7)將步驟(6)反應(yīng)體系按體積比1:1添加95%乙醇，終止反應(yīng)并沉淀蛋白，9000 r/min離心ISmin去除沉淀，收集上清濃縮，真空冷凍干燥后得到糖基化滸苔活性寡糖粗品。
[0019](8)將步驟(7)所得粗品溶解后過B1-Gel P_2聚丙烯酰胺凝膠，蒸餾水洗脫，經(jīng)3，5-二硝基水楊酸法測(cè)定收集寡糖組分，濃縮后真空冷凍干燥得到糖基化滸苔活性寡糖。
[0020]本發(fā)明制備的滸苔活性寡糖對(duì);?-葡萄糖苷酶具有強(qiáng)抑制活性，其IC50值為1.36mg/mL，且呈現(xiàn)劑量依賴性(圖1)。
[0021 ] 將嬰兒雙歧桿菌Bifidobacterium infantis接種至商品化BBL培養(yǎng)基中(BBL培養(yǎng)基配方:蛋白胨15g/L，酵母膏粉2g/L，葡萄糖20g/L，可溶性淀粉0.5g/L，氯化鈉5g/L，半胱氨酸0.5g/L，吐溫-80 lmL/L，肝粉0.3g/L，瓊脂15g/L，pH6.8±0.2)，同時(shí)糖基化寡糖替換葡萄糖作為受試樣品組，置于厭氧培養(yǎng)箱37°C培養(yǎng)84 h，每隔12h測(cè)定培養(yǎng)液0D600值以監(jiān)測(cè)雙歧桿菌增殖情況。由圖2可見，糖基化寡糖能顯著提高腸道益生菌雙歧桿菌數(shù)量。
[0022]以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，凡依本發(fā)明申請(qǐng)專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應(yīng)屬本發(fā)明的涵蓋范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種降血糖及調(diào)節(jié)腸道菌群的糖基化滸苔寡糖制備方法，其特征在于:所述方法包括如下: (1)取干燥、超微粉碎、過80-100目篩的滸苔粉末，按重量g與體積mL之比1:20-30加入質(zhì)量濃度為60%-80%的乙醇溶液，60-900C下200-400W超聲提取1-1.5小時(shí)，提取結(jié)束后，進(jìn)行過濾，將濾渣重復(fù)上述步驟進(jìn)行2-3次提取，合并提取液，將獲得的濾液混合后進(jìn)行減壓濃縮至原體積的3-8%，真空冷凍干燥后粉碎，過50-80目篩； (2)向步驟(I)所得粉末中加入蒸餾水，其中粉末質(zhì)量g與蒸餾水mL體積比為1:10-20，進(jìn)行攬摔復(fù)溶，用Sevag法、二氣二氯乙燒法、二氯乙酸法中一種或幾種除蛋白3_5次； (3)將步驟(2)所得到的溶液，通過HPD-826大孔吸附樹脂填充柱，洗脫液進(jìn)一步過非極性吸附劑活性炭，活性炭使用量與洗脫液按重量體積比1:30-50去除色素，于搖床中60-80r/min振蕩 I_2h，4000-6000rpm離心 15-20 min，收集上清液； (4)將步驟(3)得到的上清液旋蒸濃縮至原體積的3-8%，然后按體積比1:3-4加入質(zhì)量濃度為95%的乙醇，攪拌后放入4-10°C條件下靜置24 h，6000-8000rpm離心15-20min，取上清液減壓濃縮、冷凍干燥得滸苔功能性寡糖的固體，粉末后過50-80目篩； (5 )將步驟(4)中滸苔寡糖粗品粉末加蒸餾水溶解，粉末質(zhì)量g與水mL體積比為1: 20-50，溶液用截留分子量2000D透析袋處理，收集透析液，在37-40°C及轉(zhuǎn)速為60-80 r/min條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，濃縮至原體積的1/10-1/5;濃縮液采用截留分子量500D透析袋處理，將截留液冷凍干燥，制備得到未糖基化滸苔寡糖精制品； (6)步驟(5)得到的滸苔寡糖精制品按質(zhì)量mg與體積mL之比1:1-2溶解于蒸餾水中，將巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶加入到反應(yīng)體系中進(jìn)行生物反應(yīng)，巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶用量與反應(yīng)體系按質(zhì)量mg與體積mL比1:3-5，反應(yīng)體系中滸苔寡糖與二磷酸鳥苷-巖藻糖濃度比1:1.0-1.5 ,MgCl2終濃度為15-20 mM、pH6.5-8.0，置于35-40°C溫度，80-100 r/min搖床條件下反應(yīng)24-36 h； (7)將步驟(6)反應(yīng)體系按體積比1:1添加95%乙醇，終止反應(yīng)并沉淀蛋白，8000-10000r/min離心15-20min去除沉淀，收集上清濃縮，真空冷凍干燥后得到糖基化滸苔活性寡糖粗品; (8)將步驟(7)所得粗品溶解后過B1-GelP_2聚丙烯酰胺凝膠，蒸餾水洗脫，經(jīng)3，5-二硝基水楊酸法測(cè)定收集寡糖組分，濃縮后真空冷凍干燥得到糖基化滸苔活性寡糖。2.一種如權(quán)利要求1所述的制備方法制得的糖基化滸苔活性寡糖。3.如權(quán)利要求2所述的糖基化滸苔活性寡糖在制備防治糖尿病改善腸道菌群代謝性疾病的藥品或保健品中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明公開一種降血糖及調(diào)節(jié)腸道菌群的糖基化滸苔寡糖制備方法，其制備方法為：滸苔干燥后超微粉碎，經(jīng)乙醇回流提取工藝，濃縮、干燥粉碎后得到脫脂的滸苔粉末，經(jīng)脫蛋白、去除多糖及色素后，再將巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶加入含有滸苔寡糖的反應(yīng)體系中，進(jìn)行巖藻糖基化反應(yīng)，制備得到所述的巖藻糖基化滸苔寡糖。經(jīng)證實(shí)糖基化滸苔寡糖對(duì)α-葡萄糖苷酶具有強(qiáng)抑制活性，顯著提高腸道益生菌數(shù)量，可用于制備防治糖尿病改善腸道菌群等代謝性疾病的藥品或保健品。
【IPC分類】C12P19/04, A61K31/702, A61P3/10, C12P19/18, A23L33/125, A61P1/00, A61P3/00
【公開號(hào)】CN105695537
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201610110627
【發(fā)明人】趙超, 吳一晶, 劉斌, 李秋哲, 楊成鳳, 陳玉青
【申請(qǐng)人】福建農(nóng)林大學(xué)
【公開日】2016年6月22日
【申請(qǐng)日】2016年2月29日