一種微滴式數(shù)字pcr專用生物芯片的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及生物檢測(cè)分析設(shè)備領(lǐng)域，特別是設(shè)及一種微滴式數(shù)字PCR專用生物忍 片。
【背景技術(shù)】
[0002] 微滴式數(shù)字PCR(droplet digital PCR，ddPCR)是近年來新出現(xiàn)的一種PCR技術(shù)。 在原有PCR技術(shù)的基礎(chǔ)上，該技術(shù)進(jìn)行了大幅革新。該技術(shù)將傳統(tǒng)PCR中的每一份樣品反應(yīng) 體系均分為20000個(gè)獨(dú)立微滴，然后再進(jìn)行PCR反應(yīng)。在制作微滴時(shí)，只有部分微滴可W包裹 到目的基因。PCR反應(yīng)結(jié)束后用設(shè)備檢測(cè)所有微滴的巧光信號(hào)值。再根據(jù)巧光信號(hào)的闊值來 區(qū)分每一個(gè)微滴的信號(hào)值，高于闊值的微滴信號(hào)值判定為該微滴包裹到了目的基因，稱為 陽性微滴。低于闊值的微滴信號(hào)，判定為該微滴沒包裹到目的基因，稱為陰性微滴。含有巧 光信號(hào)的微滴判讀為1，沒有巧光信號(hào)的微滴判讀為0,根據(jù)泊松分布原理及陽性微滴的個(gè) 數(shù)與比例，計(jì)算得出祀分子的起始拷貝數(shù)。
[0003] 與經(jīng)典的巧光定量PCR相比，ddPCR可對(duì)DNA或RNA分子采用絕對(duì)定量的方式進(jìn)行分 析，具有無可比擬的精確性，不再需要標(biāo)準(zhǔn)曲線。ddPC財(cái)是供了獨(dú)立互不干擾的極微小的密 閉反應(yīng)微孔，能夠使得模板分子真正成為W單一分子為模板開始，進(jìn)行PCR擴(kuò)增的過程，能 夠區(qū)分混樣模板中的極低含量祀核酸分子。ddPCR已經(jīng)被用于癌癥分子標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)、傳染 病研究、基因組結(jié)構(gòu)變異分析、基因表達(dá)分析等領(lǐng)域。
[0004] CN105132571A公開了一種利用微滴式數(shù)字化PCR檢測(cè)外周血游離線粒體DNA含量 的方法。所述方法包括重組質(zhì)粒的構(gòu)建、樣本制備、提取血漿DNA和Exosome DNA、對(duì)血漿進(jìn) 行預(yù)處理，W及使用微滴式數(shù)字化PCR分析重組質(zhì)粒mtDNA拷貝數(shù)等步驟。所述方法不僅具 備優(yōu)于qPCR的高靈敏度、特異性和重復(fù)性的特點(diǎn)，且其對(duì)干擾物(如抗凝劑等)耐受能力高 于qPCR。此外，本發(fā)明在建立檢測(cè)方法的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步利用血漿樣本直接作為ddPCR的模 板，進(jìn)行血漿mtDNA的分析，不僅消除由于提取所帶來檢測(cè)不確定性，更加便于臨床檢驗(yàn)。
[0005] CN105296663A公開了一種基于巧光染料法數(shù)字微滴PCR檢測(cè)血液中結(jié)核桿菌的方 法，在于，包括W下步驟:步驟（1)采集血液，提取血液中的總DNA;步驟(2)將總DNA進(jìn)行數(shù)字 微滴PCR反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，檢測(cè)所有微滴的巧光信號(hào)值并設(shè)定闊值，根據(jù)巧光信號(hào)的闊值 確定微滴是否包裹結(jié)核桿菌DNA，高于闊值的微滴包裹結(jié)核桿菌DNA，為陽性微滴，低于闊值 的微滴不包裹結(jié)核桿菌為陰性微滴;步驟(3)統(tǒng)計(jì)陽性微滴數(shù)，計(jì)算得出結(jié)核桿菌DNA的拷 貝數(shù)，繼而得到血液中結(jié)核桿菌DNA的總拷貝數(shù)。本發(fā)明提供的方法取樣方便快捷，僅需采 集微量血液即可檢測(cè)出微量結(jié)核菌的存在，靈敏度高，檢測(cè)快速，僅需2小時(shí)就可完成檢測(cè) 過程。
[0006] 現(xiàn)有微滴式數(shù)字PCR專用生物忍片的微孔陣列片與基片正面的凹槽底部粘合，微 孔陣列片上的微孔不是通孔，每張忍片的微孔陣列包含20000個(gè)微孔，用于一個(gè)樣本的檢 ，每個(gè)微孔可W容納一個(gè)微滴在里面，水相反應(yīng)液配置完成后，即加入油相，先形成油包 水結(jié)構(gòu)，然后進(jìn)入到反應(yīng)器中進(jìn)行PCR。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了一種溫控更加精確的微滴式數(shù)字PCR專用生 物忍片。
[0008] 一種微滴式數(shù)字PCR專用生物忍片，包括基片、微孔陣列片和蓋片，所述基片正面 設(shè)有容納所述微孔陣列片的凹槽，所述蓋片與基片的正面配合將所述凹槽包圍形成密封的 腔體，所述凹槽底面設(shè)有固定支撐微孔陣列片的凸腳，所述微孔陣列片上的微孔為通孔。
[0009] 每個(gè)微孔陣列片上包含20000個(gè)微孔，用于一個(gè)樣本的檢測(cè)，每個(gè)微孔可W容納一 個(gè)微滴。
[0010] 優(yōu)選的，所述凹槽底面設(shè)有與所述微孔陣列片角部配合的限位凸腳。優(yōu)選的，限位 凸腳為4對(duì)，微孔陣列片的每個(gè)角設(shè)置一對(duì)限位凸腳。
[0011] 優(yōu)選的，所述微孔陣列片與凸腳通過粘結(jié)劑粘結(jié)固定。所述粘結(jié)劑為環(huán)氧樹脂保 密膠或硅膠粘合劑。
[0012] 優(yōu)選的，所述基片的背面設(shè)有限位凹槽。所述限位凹槽設(shè)置于基片背面的邊緣，用 于將本發(fā)明微滴式數(shù)字PCR專用生物忍片固定到微滴式數(shù)字PCR反應(yīng)儀器上。
[0013] 優(yōu)選的，所述蓋片的背面設(shè)有伸入凹槽的凸臺(tái)。所述凸臺(tái)的設(shè)置有利于蓋片的定 位和固定。
[0014] 優(yōu)選的，所述蓋片上帶有加液排氣孔。反應(yīng)液加完后，先加入部分油相介質(zhì)，然后 蓋上蓋片，通過加液排氣孔再加入油相介質(zhì)，直至加滿油相介質(zhì)并將空氣排盡，加完油相介 質(zhì)后，將加液排氣孔密封。加液排氣孔的設(shè)置方便排盡空氣。所述的油相介質(zhì)可W是:燒控 類、硅油、氣化油。
[0015] 優(yōu)選的，所述凸腳設(shè)于微孔陣列片的邊緣，頂端設(shè)有與微孔陣列片邊緣配合的臺(tái) 階結(jié)構(gòu)。所述凸腳數(shù)量為4個(gè)，每個(gè)凸腳固定支撐微孔陣列片的一邊，微孔陣列片架設(shè)于所 述臺(tái)階結(jié)構(gòu)內(nèi)側(cè)的較低一級(jí)臺(tái)階上，微孔陣列片的側(cè)邊抵住較高一級(jí)臺(tái)階的側(cè)邊。
[0016] 優(yōu)選的，所述微孔陣列片表面經(jīng)親水處理。所述親水處理的方法為:在高溫?zé)嵘L 表面氧化膜后，用親水試劑進(jìn)行清洗。所述的親水試劑可W是：丙酬、乙醇、乙二醇、。優(yōu)選 的，所述的親水試劑為丙酬。微孔陣列片表面經(jīng)親水處理使得水溶性的微滴通過親水作用 進(jìn)入微孔內(nèi)，同時(shí)因?yàn)槲⒌误w積足夠小，所W微滴能夠通過表面張力懸停于微孔中，而不會(huì) 從微孔的下端流出。
[0017] 所述微孔陣列片可選材料主要有娃片、玻璃、石英及聚甲基丙締酸甲醋一類的高 分子聚合物。優(yōu)選的，所述微孔陣列片為娃片。娃片相對(duì)其他材質(zhì)的微孔陣列片具有價(jià)格便 宜、加工簡單等優(yōu)點(diǎn)。
[0018] 所述娃片的制備方法包括W下步驟：
[0019] (1)取娃原片，清洗后吹干；
[0020] (2)在娃原片雙面涂覆光刻膠，烘干后進(jìn)行光刻，顯影；
[0021] (3)在經(jīng)光刻的娃原片雙面沉積若干層貴金屬；
[0022] (4)將沉積貴金屬的娃原片置于腐蝕液中，反應(yīng)形成通孔；
[0023] (5)清洗，吹干。
[0024] 所述的娃原片為單晶娃，所述的單晶娃為n型娃原片或P型娃原片。
[00巧]所述烘干溫度為90~120°C，烘干時(shí)間為30s~2min。優(yōu)選的，烘干溫度為100~110 °C，烘干時(shí)間為45s~90s。最優(yōu)選的，烘干溫度為105°C，烘干時(shí)間為Imin。
[00%]所述步驟(3)中，先沉積一層銀，再沉積一層金;銀層厚度為3~lOnm，金層厚度為5 ~20nm。優(yōu)選的，銀層厚度為3~7皿，金層厚度為7~15皿。最優(yōu)選的，銀層厚度為5皿，金層 厚度為lOnm。
[0027] 所述腐蝕液配置方法為:配置濃度為4.0~8. Omol/L的氨氣酸溶液和濃度為0.3~ 〇.7mol/L的過氧化氨溶液，兩者再W體積比10:1混合。優(yōu)選的，所述腐蝕液配置方法為:配 置濃度為5.0~6.5mol/L的氨氣酸溶液和濃度為0.4~0.55mol/L的過氧化氨溶液，兩者再 W體積比10:1混合。最優(yōu)選的，所述腐蝕液配置方法為:配置濃度為5.74mol/L的氨氣酸溶 液和濃度為0.46mol/L的過氧化氨溶液，兩者再W體積比10:1混合。
[0028] 所述微滴式數(shù)字PCR專用生物忍片使用前已經(jīng)將微孔陣列片固定于基片的凹槽中 的凸腳上。所述微滴式數(shù)字PCR專用生物忍片使用方法如下：
[0029] (1)將固定有微孔陣列片的基片和蓋片分別置于加樣器指定加樣槽和蓋片槽中；
[0030] (2)在樣品加載葉片中加入所需體積的反應(yīng)液；
[0031] (3)啟動(dòng)加樣器將加載葉片中的反應(yīng)液涂掃于微孔陣列片表面；
[0032] (4)加樣完成后，用微量注射器滴加油相介質(zhì)，使油相介質(zhì)將微孔陣列片包圍；
[0033] (5)將蓋片蓋于基片上，通過粘合劑將兩者粘連在一起；
[0034] (6)通過蓋片上的加液排氣孔繼續(xù)注入油相介質(zhì)，W排凈忍片內(nèi)的空氣；
[0035] (7)在加液排氣孔滴加適量密封膠，用紫外線活化使膠凝固。
[0036] 本發(fā)明微滴式數(shù)字PCR專用生物忍片通過在基片正面的凹槽底面設(shè)有固定支撐微 孔陣列片的凸腳，微孔陣列片上的微孔為通孔，在使用時(shí)，微孔陣列片架空于基片的凹槽 內(nèi)，使得反應(yīng)時(shí)的微滴溶液上下都被油相介質(zhì)包裹，有利于精確控制反應(yīng)的溫度。
【附圖說明】
[0037] 圖1為本發(fā)明微滴式數(shù)字PCR專用生物忍片的蓋片正視圖；
[0038] 圖2為本發(fā)明微滴式數(shù)字PCR專用生物忍片的基片正視圖；
[0039] 圖3為本發(fā)明微滴式數(shù)字PCR專用生物忍片的基片后視圖；
[0040] 圖4為圖帥A向剖視圖；
[0041] 圖5為本發(fā)明微滴式數(shù)字PCR專用生物忍片的微孔陣列片置于基片凹槽內(nèi)示意圖；
[0042] 圖6為本發(fā)明微滴式數(shù)字PCR專用生物忍片的微孔陣列片、基片和蓋片組合示意 圖；
[0043] 圖7為本發(fā)明娃片制備工藝流程圖；
[0044] 圖8為本發(fā)明娃片的微孔顯微圖；
[0045] 圖9為實(shí)施例4中本發(fā)明微滴式數(shù)字PCR專用生物忍片用于分析低拷貝核酸的信號(hào) 強(qiáng)度散點(diǎn)圖。
【具體實(shí)施方式】