回輸臨床治療用人胎盤葉狀絨毛膜來源的間充質(zhì)干細(xì)胞體外三維分離培養(yǎng)保存方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物干細(xì)胞技術(shù)，組織工程領(lǐng)域。設(shè)及一種體外構(gòu)建高模擬體內(nèi)貼附 環(huán)境分離篩選，hCDMSC的無血清培養(yǎng)、擴(kuò)增、儲(chǔ)存技術(shù)。組織構(gòu)建和細(xì)胞體外培養(yǎng)是再生醫(yī) 學(xué)干細(xì)胞治療領(lǐng)域的至關(guān)重要的熱口科技領(lǐng)域?；剌斉R床治療用細(xì)胞是一種前瞻性的醫(yī)療 手段，本發(fā)明特征是采用人胎盤葉狀絨毛膜來源的間充質(zhì)干細(xì)胞體外=維分離培養(yǎng)保存方 法，獲取高純度的臨床治療用hCDMSC，采用細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular ma化ix，ECM)理論 指導(dǎo)設(shè)計(jì)開發(fā)一種從未公開的報(bào)道的，葉狀絨毛膜高擬體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)，篩選貼附培養(yǎng)技 術(shù)。該培養(yǎng)體系保持原始未分化干性細(xì)胞，獲取符合細(xì)胞協(xié)會(huì)（ISCT)標(biāo)準(zhǔn)的干細(xì)胞其活性 與傳代能力極強(qiáng)，無血清多組合培養(yǎng)液梯度馴化培養(yǎng)理論，使得hCDMSC具備回輸治療應(yīng)用 的安全性穩(wěn)定性保障，是臨床藥物設(shè)計(jì)開發(fā)醫(yī)療機(jī)構(gòu)開展干細(xì)胞治療科技基礎(chǔ)，同時(shí)也是 組織工程領(lǐng)域具備前景的種子干細(xì)胞。
【背景技術(shù)】
[0002] 近年來，國(guó)際國(guó)內(nèi)對(duì)干細(xì)胞再生醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域越來越重視，細(xì)胞治療再生醫(yī)學(xué)得 到了前所未有推進(jìn)，科研領(lǐng)域沐浴在時(shí)代的朝陽(yáng)下得W蓬勃發(fā)展。尤其是間充質(zhì)干細(xì)胞已 經(jīng)成為一種新的治療手段，廣泛應(yīng)用修復(fù)受損或病變的組織器官，治療屯、、腦血管疾病、神 經(jīng)系統(tǒng)疾病、臨床骨修復(fù)、軟骨修復(fù)、骨髓再生、肌肉再生、脂肪形成、肌腫修復(fù)、基因治療、 血管支持、角膜損傷、燒傷燙傷創(chuàng)面修復(fù)等多種疾病。經(jīng)過體外培養(yǎng)擴(kuò)增后的干細(xì)胞在組織 工程再生和多種組織修復(fù)中展示出令科研工作者印象深刻的治療廣泛性潛能，運(yùn)種潛能是 科研領(lǐng)域毋庸置疑的發(fā)展方向。
[0003] 間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem Cells MSCs)是一類自我更新和多向分化的能 力。來源于胚胎發(fā)育早期中胚層的一類多能干細(xì)胞。是一種非血源性的多功能干細(xì)胞，廣泛 存在于人體不同組織中，如骨髓、脂肪、牙周膜及廝帶，胎盤組織等。近幾年來有學(xué)者發(fā)現(xiàn)其 主要來源骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stemcells,BMSc)可W自體移植， 避免了移植后的免疫排斥。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的體外擴(kuò)增比較容易，而且具有跨系或跨胚 層分化為不同組織來源細(xì)胞的潛能，所W在臨床已經(jīng)應(yīng)用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)、屯、血管及免疫 系統(tǒng)等多系統(tǒng)疾病的治療，在癌癥和遺傳性疾病研究中也有設(shè)及。BMSc可體外誘導(dǎo)分化為 成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、肌母細(xì)胞、并在一定的條件下誘導(dǎo)可分化為神經(jīng)細(xì)胞，而且 可進(jìn)行自體移植，避免免疫排斥，被認(rèn)為是治療多種疾病的良好細(xì)胞來源。也有研究者發(fā)現(xiàn) 在胎盤組織中也含有豐富的間充質(zhì)干細(xì)胞，提示可W將其提取作為干細(xì)胞移植治療的備選 細(xì)胞。胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞具有采集方便、易于體外培養(yǎng)、擴(kuò)增和誘導(dǎo)等特性，被認(rèn)為是干細(xì) 胞研究的一種理想種子細(xì)胞。
[0004] 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，在美國(guó)FDA已批準(zhǔn)在屯、肌干細(xì)胞移植方面進(jìn)入一期臨床試驗(yàn)， 國(guó)內(nèi)也開展多個(gè)二期臨床試驗(yàn)，運(yùn)充分展示了 MSCs的巨大應(yīng)用前景。不過骨髓間充質(zhì)干細(xì) 胞在骨髓中的含量較少，而且隨著年齡的增加，在骨髓中的含量逐漸減少，其增殖分化能力 也逐漸減弱；同時(shí)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的取材是有創(chuàng)侵入性操作，增加了捐獻(xiàn)者的痛苦和感 染的機(jī)會(huì)，所W骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的臨床應(yīng)用受到了一定的限制;并且病患嚴(yán)重感染、骨髓 惡性腫瘤隨著年齡的增長(zhǎng)骨髓細(xì)胞數(shù)及增殖、分化能力均明顯下降等情況下，患者就無法 順利獲得足量可用于治療的BMSCs,為此很有必要尋找新的MSCs來源。
[0005] 足月胎盤是分娩的廢棄物，取材容易，對(duì)供者不造成損傷，無倫理問題，而且胎盤 體積大，獲得干細(xì)胞相對(duì)較多，所W胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞更方便適用于臨床。有學(xué)者在葉狀絨 毛膜組織成功分離培養(yǎng)出胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞，并觀察其生物學(xué)特性和抗調(diào)亡細(xì)胞因子血管 內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子、膜島素樣生長(zhǎng)因子、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子的分泌水平，結(jié)果證實(shí)葉狀絨毛膜 間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞相似，并能分泌血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子、 膜島素樣生長(zhǎng)因子和肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子。已有研究證實(shí)胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞具有與骨髓間充質(zhì) 干細(xì)胞類似的功能和特性，兩者的多向分化潛能也類似。胎盤起源于胚胎發(fā)育期胚外中胚 層，由間質(zhì)、血管、滋養(yǎng)細(xì)胞組成，含有大量的間充質(zhì)成分，也含大量的干細(xì)胞。葉狀絨毛膜 含有MSCs,在胎兒出生后多作為廢物與一起被丟棄的葉狀絨毛膜也含有與骨髓間充質(zhì)干細(xì) 胞相似特性的細(xì)胞，葉狀絨毛膜組織中確含有運(yùn)些前體細(xì)胞，可W極大程度上地解決了干 細(xì)胞的來源問題。
[0006] 胎盤來源的間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖能力更強(qiáng)。國(guó)內(nèi)外很多研究者發(fā)現(xiàn)，胎盤來源間 充質(zhì)干細(xì)胞在體外實(shí)驗(yàn)中可被誘導(dǎo)分化為中胚層的屯、肌細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、成骨細(xì)胞、脂肪 細(xì)胞、內(nèi)胚層的膜島細(xì)胞、肝細(xì)胞W及外胚層的神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞，軟骨細(xì)胞;而且運(yùn)些 結(jié)果同樣在屯、肌梗死、帕金森大鼠模型、糖尿病小鼠模型和脊髓損傷靈長(zhǎng)類動(dòng)物模型等體 內(nèi)模型中治療顯效得到了證實(shí)。也有報(bào)道稱，胎盤來源間充質(zhì)干細(xì)胞將來可進(jìn)一步應(yīng)用于 修復(fù)人膝關(guān)節(jié)退行性改變或膝關(guān)節(jié)半月板損傷科研實(shí)驗(yàn)。
[0007] 間充質(zhì)干細(xì)胞是目前組織工程的主要種子細(xì)胞，經(jīng)過多年多學(xué)者的研究后，雖然 組織工程已經(jīng)獲得了很大進(jìn)展。然而，但由于目前缺乏理想篩選方法，間充質(zhì)干細(xì)胞不易獲 取、體外擴(kuò)增困難等限制，使其在臨床級(jí)別回輸?shù)膽?yīng)用受到限制。因此，尋找一種易于獲得、 免疫原性低、易于體外擴(kuò)增的臨床治療級(jí)別的種子細(xì)胞是目前組織工程迫切需要解決的問 題之一。本發(fā)明嘗試直接從胎盤葉狀絨毛膜組織中分離間充質(zhì)干細(xì)胞的發(fā)明專利，并對(duì)所 得細(xì)胞的生物學(xué)特性進(jìn)行鑒定，為研究間充質(zhì)干細(xì)胞分化能力，將其作為種子細(xì)胞開展臨 床應(yīng)用研究提供獨(dú)特的思路獲取體系依據(jù)，進(jìn)行了間充質(zhì)干細(xì)胞臨床治療W及基礎(chǔ)研究奠 定科研基礎(chǔ)。
[000引再生組織工程細(xì)胞建立工作始于本世紀(jì)巧arrison 1907,化rrel 1912)，指導(dǎo)引 領(lǐng)著生物學(xué)，臨床醫(yī)學(xué)材料等各大銜接領(lǐng)域，被稱為重要的基礎(chǔ)科學(xué)之一。組織構(gòu)建和細(xì)胞 體外培養(yǎng)是至關(guān)重要的課題。從供體捐獻(xiàn)者活體取組織，模擬體內(nèi)生理環(huán)境等系列特定體 外微環(huán)境體系，進(jìn)行解化培養(yǎng)，使得組織細(xì)胞健康生長(zhǎng)。由于間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的 黏附強(qiáng)快速特性，使得體外篩選培養(yǎng)的人來源的間充質(zhì)干細(xì)胞得W在國(guó)內(nèi)外方法特異性發(fā) 展。而干細(xì)胞生物學(xué)性能，可W做到增進(jìn)功能，避免潛在有害基因?qū)Ω杉?xì)胞控制分化時(shí)間與 控制不同分化方向等的影響，在基礎(chǔ)科研、臨床治療、干細(xì)胞治療研究方向等均有歷史時(shí)期 的重要不可取代的指導(dǎo)意義。
[0009]細(xì)胞外基質(zhì)(extracelIular matrix，ECM)廣泛存在于細(xì)胞間隙的基本填充成分， 是細(xì)胞新陳代謝、生長(zhǎng)、繁殖、分化、表達(dá)、傳遞、互惠所依賴的極其重要場(chǎng)所。早期研究學(xué)者 認(rèn)為，夕F介質(zhì)只是一種組織內(nèi)、細(xì)胞外的單純的支持結(jié)構(gòu)?；痷schka和Konigsberg在1966年 研究發(fā)現(xiàn)填充組織間隙的膠原與促進(jìn)成肌細(xì)胞轉(zhuǎn)化肌管的現(xiàn)象，并在兩年之后得W證明， 學(xué)者們才對(duì)運(yùn)種穩(wěn)定外物質(zhì)微環(huán)境有了新的認(rèn)識(shí)和思考。
[0010]化y在11年后報(bào)道了 ECM對(duì)胚胎發(fā)育過程具有重要的誘導(dǎo)作用。ECM影響細(xì)胞行為 的現(xiàn)象得W關(guān)注并進(jìn)行廣泛的研究，但是并沒有成型的理論基礎(chǔ)來佐證ECM與細(xì)胞的密切 關(guān)系。直到1982年有學(xué)者提出證明并建立ECM與細(xì)胞骨架和核基質(zhì)之間"動(dòng)態(tài)互惠"的模型。 在運(yùn)個(gè)模中，ECM分子與細(xì)胞表面受體互相作用，然后把信號(hào)通過細(xì)胞膜傳導(dǎo)進(jìn)入細(xì)胞漿 中，引起從細(xì)胞骨架到細(xì)胞核的一系列變化，從而引起某些特定基因的表達(dá)。
[0011] 并證明運(yùn)些基因的表達(dá)產(chǎn)物又可W反過來對(duì)ECM發(fā)生作用，今天的許多研究證實(shí) 了運(yùn)個(gè)模型的合理性，并且證明細(xì)胞和ECM相互作用，直接參與了細(xì)胞的黏附、生長(zhǎng)、游走、 分化和程序性死亡(調(diào)亡）的過程。外介質(zhì)參與調(diào)節(jié)細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子的活性，還能夠直接 激活、啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制。由于運(yùn)種對(duì)細(xì)胞的調(diào)節(jié)和對(duì)信號(hào)的傳導(dǎo)作用，因此，我們 必須充分了解細(xì)胞外介質(zhì)的化學(xué)的、物理的、生物學(xué)性質(zhì)和功能及其在組織的形成和修復(fù) 中的作用，才能更好地應(yīng)用運(yùn)些生物材料構(gòu)建成為組織接受，乃至模擬組織完善再生的"生 物構(gòu)架"。我們建立的高擬細(xì)胞外基質(zhì)材料利用的恰是反向理論，指導(dǎo)我們深入開展對(duì)ECM 的認(rèn)識(shí)，同時(shí)也反作用得到我們可利用的干細(xì)胞，運(yùn)種研究模式促進(jìn)學(xué)科前行及發(fā)展。胎盤 葉狀絨毛膜來源的間充質(zhì)干細(xì)胞化uman chorion-derived mesenchymaIstemcelIs hCDMSC)作為新的獲取MSC的來源，因其取材方便，不受倫理學(xué)限制等優(yōu)點(diǎn)，受到了越來越多 學(xué)者的關(guān)注。與骨髓相比，具有來源充足、免疫原性低、病毒污染率較低、且無社會(huì)倫理爭(zhēng)議 等方面的優(yōu)點(diǎn)。由于hCDMSC在組織工程、干細(xì)胞移植、基因治療等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前 景，相信會(huì)成為今后干細(xì)胞研究的熱點(diǎn)。但是國(guó)內(nèi)外有關(guān)hCDMSC的報(bào)道較少，因此對(duì)hCDMSC 的分離技術(shù)、生物學(xué)特性認(rèn)識(shí)很有限，很大程度上限制了 hCDMSC的廣泛應(yīng)用和推廣。本發(fā)明 通過對(duì)hCDMSC進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)、胎盤絨毛膜的分離方法及其生物學(xué)特性，成骨、成脂誘導(dǎo)分化 研究，為此來源的細(xì)胞更廣泛的臨床應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。也為今后優(yōu)選絨毛膜來源的MSC 用于治療移植物抗宿主病和自身免疫系統(tǒng)疾病提供科研依據(jù)。
[0012] 最常規(guī)的一種培養(yǎng)hCDMSC干細(xì)胞的培養(yǎng)基就是添加有動(dòng)物血清的培養(yǎng)基。然而， 采用運(yùn)種培養(yǎng)基培養(yǎng)的hCDMSC干細(xì)胞，不僅因添加量問題出現(xiàn)生長(zhǎng)過快或比較緩慢現(xiàn)象， 且超過幾代之后其分化成功能細(xì)胞的潛能大大降低，而且動(dòng)物血清培養(yǎng)技術(shù)綜合增殖能 力、免疫調(diào)節(jié)能力、分泌細(xì)胞因子的能力運(yùn)=方面均會(huì)受到不可控方向變化。國(guó)外不同地域 廠商來源的動(dòng)物源血清批次存在潛在的不重復(fù)性，也影響了細(xì)胞擴(kuò)增規(guī)?；a(chǎn)的技術(shù)瓶 頸；另一方面，相對(duì)于人是異源性，異種蛋白混入潛在細(xì)胞治療具有不確定性，從而限制了 其在臨床上的應(yīng)用。因此，探索快速擴(kuò)增hCDMSC干細(xì)胞而又不影響其潛能的培養(yǎng)條件及其 培養(yǎng)基組成的優(yōu)化組合是非常重要的研究?jī)?nèi)容。
[0013] 多組合培養(yǎng)體系模擬體內(nèi)hCDMSC細(xì)胞環(huán)境的無血清培養(yǎng)方案與傳統(tǒng)的含動(dòng)物血 清培養(yǎng)基相比