紙基微流控芯片陽極電流檢測水污染物生物毒性的方法
【專利摘要】紙基微流控芯片陽極電流檢測水污染物生物毒性的方法，先制作紙基微流控芯片，再利用紙基微流控芯片測定水污染物生物毒性，基于微生物呼吸鏈-對BQ體系電化學檢測原理，在絲網(wǎng)印刷PDMS親水微通道和碳漿三電極系統(tǒng)的紙基微流控芯片上，采用小片纖維素膜導通親水微通道上的疏水閥來控制液流釋放和流動時間，實現(xiàn)培養(yǎng)液與細胞分離、清洗和污染物孵育細胞等環(huán)節(jié)，從而降低在采用電流信號檢測裝置的陽極電流定量測定污染物毒性時的干擾，具有質(zhì)量輕、便攜、低成本、一次性分析、所需樣品的體積小、分析速度快，適用于偏遠地區(qū)、野外現(xiàn)場水污染、土壤污染、食品安全以及空間搭載等場合的生物毒性檢測。
【專利說明】紙基微流控芯片陽極電流檢測水污染物生物毒性的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及微流控分析應用于微生物檢測污染毒性【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及紙基微流 控芯片陽極電流檢測水污染物生物毒性的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 微流控芯片作為從九十年代提出的微全分析系統(tǒng)的核心技術(shù)，是當前發(fā)展最迅速 的領(lǐng)域之一，而紙質(zhì)微流控芯片是近期發(fā)展起來的一種新的微流控芯片形式。紙基微流控 以色譜紙作為芯片材料，使用光刻、等離子體氧化、噴墨印刷、蠟印刷和打印PDMS等技術(shù)制 作而成（Xu Li，et al.，2012, 6, 1932-1058)。以試紙和側(cè)向流動的應用為特征的紙基微流 控芯片，由于其便攜、批量印刷、制備工藝簡單、無需復雜外圍設(shè)備、可一次性使用、低成本、 樣品和試劑用量小、分析速度快和同時檢測多種成份等優(yōu)點，可以促使在家庭、資源匱乏的 偏遠地區(qū)、野外現(xiàn)場以及空間飛行器等場合使用，當然也就適合在消費市場迅速普及（Ali Kemal Yetisen, et al.，Lab Chip, 2013, 13, 2210-2251)。多種類型和廣泛的應用場合使紙 基微流控芯片在化學、生物、醫(yī)學、環(huán)境保護和空間生命科學等領(lǐng)域有著廣闊發(fā)展前景。
[0003] 用微生物測定樣品溶液毒性試驗是基于微生物的光學性質(zhì)（如發(fā)光細菌）、呼吸 鏈活性（如氧化還原介質(zhì)〇 2和8〇等）或毒物誘導微生物形態(tài)變化等類型的基本原理。 就以細菌呼吸鏈活性測量污染物毒性而言，2008年Wang等用凍干大腸桿菌的生物傳感 器經(jīng)復蘇并加入氧化還原介質(zhì)BQ后，用CellSense軟件記錄傳感器電流（Hong Wang，et al.，Chinese Chemical Letters, 2008, 19, 211-214)，成為 申請人:所見到的最初采用氧化 還原介質(zhì)BQ反映污染物影響大腸桿菌呼吸鏈活性的電化學方法。Li等采用明膠包埋大腸 桿菌細胞于玻碳電極表面，仍以BQ作為氧化還原介質(zhì)測定了混合重金屬離子溶液的生物 毒性（Jiuming Li，et al.，Electrochimica Acta，2013,97,52_57)。Yu 等仍米用 BQ 作為 氧化還原介質(zhì)并與污染物孵育大腸桿菌后，用微玻碳陣列電極測定反映重金屬離子毒性的 陽極電流（Dengbin Yu, et al·，Analyst, 2013, 138, 3297-3302)。上述三篇 Wang、Li 和 Yu 的文獻，都是基于污染物影響微生物呼吸鏈活性原理，用電化學方法通過氧化還原介質(zhì)BQ 檢測污染物毒性。但是，它們都沒有將樣品預處理和電化學檢測兩類不同的操作單元集成 在一個微流控芯片（特別是廉價可以批量印刷的紙基微流控芯片）上。實現(xiàn)這類原理方法 的檢測過程還涉及細菌懸浮液離心和細胞清洗等步驟和相應外圍設(shè)備（超聲震蕩器、離心 機和電化學工作站等）。因此，若能夠在紙基微流控芯片上實現(xiàn)樣品預處理和電化學檢測兩 個單元的恰當集成，全面地減少污染物的生物毒性檢測成本，顯著減少試劑用量和操作時 間，大幅降低操作難度，這對基于這類原理檢測污染物生物毒性在多個領(lǐng)域的應用，具有重 要的現(xiàn)實意義。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明的目的在于提供紙基微流控芯片陽極電 流檢測水污染物生物毒性的方法，基于微生物呼吸鏈-對BQ體系電化學檢測原理，在絲網(wǎng) 印刷PDMS親水微通道和碳漿三電極系統(tǒng)的紙基微流控芯片上，采用小片纖維素膜導通親 水微通道上的疏水閥來控制液流釋放和流動時間，實現(xiàn)培養(yǎng)液與細胞分離、清洗和污染物 孵育細胞等環(huán)節(jié)，從而降低在采用電流信號檢測裝置的陽極電流定量測定污染物毒性時的 干擾，克服了傳統(tǒng)方法的缺陷，具有質(zhì)量輕、便攜、低成本、一次性分析、所需樣品的體積小、 分析速度快，適用于偏遠地區(qū)、野外現(xiàn)場水污染、土壤污染、食品安全以及空間搭載等場合 的生物毒性檢測，從而為在環(huán)境保護、生命科學、醫(yī)學和生物化學等領(lǐng)域的生物毒性測定提 供了 一種新類型設(shè)備和新方法。
[0005] 為了達到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣實現(xiàn)的：
[0006] 紙基微流控芯片陽極電流檢測水污染物生物毒性的方法，包括如下步驟，
[0007] 步驟一、先制作紙基微流控芯片
[0008] (1. 1)、先用繪圖軟件設(shè)計包含對電極4、工作電極5和參比電極6的三電極，將三 電極加工成第一網(wǎng)板21，在色譜紙22正面用碳漿絲網(wǎng)印刷，烘箱中150°C烘1小時，得到包 含三電極的色譜紙；
[0009] (1.2)、再用繪圖軟件設(shè)計包括五個微通道和進樣區(qū)3,五個微通道為上微通道 13、下微通道15、左微通道14、右第一微通道12、右第二微通道11，以及與右第二微通道11 連通的電化學檢測區(qū)7、與上微通道13連通的A廢液區(qū)8、與左微通道14連通的B廢液區(qū) 9、與下微通道15連通的C廢液區(qū)10的微流控芯片構(gòu)型，將微流控芯片構(gòu)型加工成第二網(wǎng) 板23,在包含三電極的色譜紙的背面對應位置用聚二甲基硅氧烷PDMS與正硅酸乙酯TE0S 液態(tài)膠混合物絲網(wǎng)印刷，PDMS與TE0S液態(tài)膠混合物質(zhì)量比8:1，保證三電極對應在電化學 檢測區(qū)7,烘箱中75°C烘1小時；
[0010] (1. 3)、在色譜紙正面的A廢液區(qū)8、B廢液區(qū)9和C廢液區(qū)10以及電化學檢測區(qū) 7分別粘貼與對應區(qū)域尺寸相同的吸收墊；
[0011] (1. 4)、再在步驟1. 3所得的色譜紙的背面粘貼硬質(zhì)紙質(zhì)底片2,得到紙基微流控 芯片，將紙基微流控芯片加固、平整，用高密度打孔機沿紙基微流控芯片上的虛線MN加工 虛線劃痕20,加工虛線劃痕20將紙基微流控芯片三個廢液區(qū)8、9、10所在的A區(qū)和電化學 檢測區(qū)7所在的B區(qū)分開，以便在完成細胞樣品預處理后使A區(qū)和B區(qū)容易分離；
[0012] 步驟二、利用紙基微流控芯片測定水污染物生物毒性
[0013] (2. 1)、在上述紙基微流控芯片的進樣區(qū)3滴加培養(yǎng)12小時的含有大腸桿菌混合 液，用與左疏水閥18尺寸相同的纖維素膜導通親水左微通道14上的左疏水閥18,使得左微 通道14與進樣區(qū)3相連通，使培養(yǎng)液沿左微通道14與大腸桿菌細胞分離；
[0014] (2. 2)、用與上疏水閥17和下疏水閥19尺寸相同的纖維素膜導通親水上微通道13 和下微通道15上的上疏水閥17和下疏水閥19,在上述包含大腸桿菌的紙基微流控芯片進 樣區(qū)3滴加中性磷酸鹽緩沖液清洗大腸桿菌兩次，使兩次清洗廢液依次沿上微通道13和下 微通道15與大腸桿菌細胞分離；
[0015] (2. 3)、再在進樣區(qū)3滴加混合液，混合液為濃度1. 25mM的苯醌溶液與已知濃度的 重金屬離子溶液以及中性磷酸鹽緩沖液，三者體積比為5:1:4,并37°C孵育60分鐘反應，再 用纖維素膜導通親水右第一微通道12上的右疏水閥16,使反應后含氫醌成分的混合液經(jīng) 過親水右第一微通道12和右第二微通道11與細胞分離進入連通三電極的電化學檢測區(qū) 7 ；
[0016] (2. 4)、沿紙基微流控芯片上的虛線麗使B區(qū)與A區(qū)分離，把B區(qū)的三電極連接到 外部設(shè)備電流信號檢測裝置，記錄陽極電流，根據(jù)電流計算呼吸鏈活性抑制比：
[0017]

【權(quán)利要求】
1. 紙基微流控芯片陽極電流檢測水污染物生物毒性的方法，其特征在于，包括如下步 驟， 步驟一、先制作紙基微流控芯片 (1. 1)、先用繪圖軟件設(shè)計包含對電極⑷、工作電極（5)和參比電極（6)的三電極，將 三電極加工成第一網(wǎng)板（21)，在色譜紙（22)正面用碳漿絲網(wǎng)印刷，烘箱中150°C烘1小時； 得到包含三電極的色譜紙； (1.2) 、再用繪圖軟件設(shè)計包括五個微通道和進樣區(qū)（3)，五個微通道為上微通道 (13)、下微通道（15)、左微通道（14)、右第一微通道（12)、右第二微通道（11)，以及與右第 二微通道（11)連通的電化學檢測區(qū)（7)、與上微通道（13)連通的A廢液區(qū)（8)、與左微通 道（14)連通的B廢液區(qū)（9)、與下微通道（15)連通的C廢液區(qū)（10)的微流控芯片構(gòu)型，將 微流控芯片構(gòu)型加工成第二網(wǎng)板（23)，在包含三電極的色譜紙的背面對應位置用聚二甲基 硅氧烷PDMS與正硅酸乙酯TEOS液態(tài)膠混合物絲網(wǎng)印刷，PDMS與TEOS液態(tài)膠混合物質(zhì)量 比8:1，保證三電極對應在電化學檢測區(qū)（7)，烘箱中75°C烘1小時； (1. 3)、在色譜紙正面的A廢液區(qū)（8)、B廢液區(qū)（9)和C廢液區(qū)（10)以及電化學檢測 區(qū)（7)分別粘貼與對應區(qū)域尺寸相同的吸收墊； (1. 4)、再在步驟1. 3所得的色譜紙的背面粘貼硬質(zhì)紙質(zhì)底片（2)，得到紙基微流控芯 片，將紙基微流控芯片加固、平整，用高密度打孔機沿紙基微流控芯片上的虛線MN加工虛 線劃痕（20)，加工虛線劃痕（20)將紙基微流控芯片三個廢液區(qū)（8、9、10)所在的A區(qū)和電 化學檢測區(qū)（7)所在的B區(qū)分開，以便在完成細胞樣品預處理后使A區(qū)和B區(qū)容易分離； 步驟二、利用紙基微流控芯片測定水污染物生物毒性 (2. 1)、在上述紙基微流控芯片的進樣區(qū)（3)滴加培養(yǎng)12小時的含有大腸桿菌混合液， 用與左疏水閥（18)尺寸相同的纖維素膜導通親水左微通道（14)上的左疏水閥（18)，使得 左微通道（14)與進樣區(qū)（3)相連通，使培養(yǎng)液沿左微通道（14)與大腸桿菌細胞分離； (2. 2)、用與上疏水閥（17)和下疏水閥（19)尺寸相同的纖維素膜導通親水上微通道 (13)和下微通道（15)上的上疏水閥（17)和下疏水閥（19)，在上述包含大腸桿菌的紙基微 流控芯片進樣區(qū)（3)滴加中性磷酸鹽緩沖液清洗大腸桿菌兩次，使兩次清洗廢液依次沿上 微通道（13)和下微通道（15)與大腸桿菌細胞分離； (2.3) 、再在進樣區(qū)（3)滴加混合液，混合液為濃度1.25mM的苯醌溶液與已知濃度的重 金屬離子溶液以及中性磷酸鹽緩沖液，三者體積比為5:1:4,并37°C孵育60分鐘反應，再用 纖維素膜導通親水右第一微通道（12)上的右疏水閥（16)，使反應后含氫醌成分的混合液 經(jīng)過親水右第一微通道（12)和右第二微通道（11)與細胞分離進入連通三電極的電化學檢 測區(qū)（7); (2. 4)、沿紙基微流控芯片上的虛線MN使B區(qū)與A區(qū)分離，把B區(qū)的三電極連接到外部 設(shè)備電流信號檢測裝置，記錄陽極電流，根據(jù)電流計算呼吸鏈活性抑制比：
式中i和L分別表示水污染物存在與不存在時所記錄的電流。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的紙基微流控芯片陽極電流檢測水污染物生物毒性的方法，其 特征在于，所述的大腸桿菌混合液中的大腸桿菌能夠用酵母菌、亞硝化單胞菌以及它們的
【文檔編號】G01N27/26GK104267073SQ201410392974
【公開日】2015年1月7日 申請日期:2014年8月11日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月11日
【發(fā)明者】梁恒, 許朝萍, 楊崢崢, 劉倩, 歐陽良飛, 孫歡, 楊水云, 徐文 申請人:西安交通大學