具有抗白色念珠菌活性的化合物及其制備方法和應用
【專利摘要】本發(fā)明公開了具有抗白色念珠菌活性的化合物及其制備方法和應用，所述化合物的結構式如式(Ⅰ)或式(Ⅱ)所示：本發(fā)明不僅提供了新的化合物，而且該化合物可用于制備抗白色念珠菌感染的藥物，因而具有廣泛的開發(fā)應用前景。CGMCC NO.1024920141229
【專利說明】
具有抗白色念珠菌活性的化合物及其制備方法和應用
技術領域
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術領域，具體涉及具有抗白色念珠菌活性的化合物及其制 備方法和應用。
【背景技術】
[0002] 白色念珠菌是常見的深部感染的條件致病性真菌。近年來，隨著放療、化療、免疫 抑制劑及廣譜抗菌素的廣泛應用，極易造成免疫功能低下者體內(nèi)環(huán)境平衡紊亂、菌群失調(diào)， 使白色念珠菌感染呈上升趨勢，已經(jīng)成為了主要的真菌感染疾病之一。目前，用于臨床治療 的白色念珠菌抗生素和化學合成藥物極為有限，且毒副作用較大、價格昂貴，在臨床上應用 受到限制。微生物是許多重要藥物的重要來源之一，也是許多藥物的先導化合物重要來源。 因此，從微生物中尋找新的抗感染的藥物是一個主要的方向。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 目前關于Streptomyces lavenduligriseus代謝產(chǎn)物的研究報道較少， 本申請的發(fā)明人從自然環(huán)境中分離獲得了一株熏衣草灰色鏈霉菌（Streptomyces lavenduligriseus)HCCB11368菌株（保藏號CGMCC No. 10249)，并從該鏈霉菌中分離鑒定 到了新型的具有抗白色念珠菌活性的化合物，具有制備抗白色念珠菌感染的臨床藥物的應 用前景。
[0004] 因此，本發(fā)明的第一個目的在于提供具有抗白色念珠菌活性的化合物。
[0005] 本發(fā)明的第二個目的在于提供所述化合物的制備方法。
[0006] 本發(fā)明的第三個目的在于提供所述化合物的應用。
[0007] 本發(fā)明的第四個目的在于提供一種熏衣草灰色鏈霉菌（Streptomyces lavenduligriseus) 〇
[0008] 本發(fā)明的第五個目的在于提供一種藥物組合物或抗白色念珠菌感染的藥物。
[0009] 為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下的技術方案：
[0010] 根據(jù)本發(fā)明的第一個方面，具有抗白色念珠菌活性的化合物，所述化合物的結構 式如式（I )或式（II )所示：
[0011]
[0012]
[0013] 根據(jù)本發(fā)明的第二個方面，所述的具有抗白色念珠菌活性的化合物的制備方法， 其特征在于，通過發(fā)酵熏衣草灰色鏈霉菌（Streptomyces lavenduligriseus)菌株CGMCC No. 10249,并對發(fā)酵產(chǎn)物進行分離純化而得到。
[0014] 根據(jù)本發(fā)明，所述發(fā)酵的條件如下：
[0015] 種子培養(yǎng)基的組成如下：葡萄糖20g/L，甘油20g/L，可溶性淀粉20g/L，黃豆餅粉 30g/L, KH2P040 . 2g/L, MgS04 · 7H20 0. 2g/L ；
[0016] 發(fā)酵培養(yǎng)基的組成如下：葡萄糖8g/L，黃豆餅粉22g/L，玉米淀粉40g/L， MgS04 · 7H20 lg/L, KH2P040 . 2g/L, NaCl 2g/L ；
[0017] 發(fā)酵溫度為26~28°C，發(fā)酵時間為5~7天。
[0018] 根據(jù)本發(fā)明，所述分離純化包括以下步驟：
[0019] A)將發(fā)酵產(chǎn)物用有機溶劑萃取，減壓蒸餾得到萃取物；
[0020] B)將步驟A)中所述萃取物用硅膠柱進行層析分離，并用洗脫溶劑進行梯度洗脫 分離；
[0021] C)將步驟B)中所述梯度洗脫分離的產(chǎn)物用半制備液相進行色譜分離，并用洗脫 溶劑進行梯度洗脫分離。
[0022] 根據(jù)本發(fā)明，所述步驟A)中所述有機溶劑為甲醇和/或正丁醇，所述步驟B)中所 述洗脫溶劑為氯仿和甲醇，所述步驟C)中所述洗脫溶劑為甲醇和水。
[0023] 根據(jù)本發(fā)明，所述步驟B)中所述硅膠柱為200~300目的硅膠柱。
[0024] 根據(jù)本發(fā)明的第三個方面，所述的具有抗白色念珠菌活性的化合物可用于制備抗 白色念珠菌感染的藥物。
[0025] 根據(jù)本發(fā)明的第四個方面，一種熏衣草灰色鏈霉菌（Streptomyces lavenduligriseus)菌株，保藏編號為 CGMCC No. 10249。
[0026] 根據(jù)本發(fā)明的第五個方面，一種藥物組合物或抗白色念珠菌感染的藥物，含有所 述的具有抗白色念珠菌活性的化合物中的一種或兩種。
[0027] 根據(jù)本發(fā)明，所述藥物組合物或抗白色念珠菌感染的藥物還包括藥學上可接受的 載體或賦形劑。
[0028] 本發(fā)明不僅提供了新的化合物，而且該化合物可用于制備抗白色念珠菌感染的藥 物，因而具有廣泛的開發(fā)應用前景。
【附圖說明】
[0029] 圖1為本發(fā)明化合物1的質(zhì)譜圖。
[0030] 圖2為本發(fā)明化合物1的Η譜圖。
[0031] 圖3為本發(fā)明化合物1的C譜圖。
[0032] 圖4為本發(fā)明化合物1的HSQC譜圖。
[0033] 圖5為本發(fā)明化合物1的COSY譜圖。
[0034] 圖6為本發(fā)明化合物1的HMBC譜圖。
[0035] 圖7為本發(fā)明化合物2的質(zhì)譜圖。
[0036] 圖8為本發(fā)明化合物2的Η譜圖。
[0037] 圖9為本發(fā)明化合物2的C譜圖。
[0038] 圖10為本發(fā)明化合物2的HSQC譜圖。
[0039] 圖11為本發(fā)明化合物2的COSY譜圖。
[0040] 圖12為本發(fā)明化合物2的HMBC譜圖。
【具體實施方式】
[0041] 以下結合具體實施例，對本發(fā)明做進一步說明。應理解，以下實施例僅用于說明本 發(fā)明而非用于限制本發(fā)明的范圍。
[0042] 本申請的發(fā)明人通過自然篩選的方法獲得了一株熏衣草灰色鏈霉菌 (Streptomyces lavenduligriseus)菌株，命名為 HCCB11368,于 2014 年 12 月 29 日保藏于 中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（CGMCC)，保藏地址為北京朝陽區(qū)北辰西 路1號院3號中國科學院微生物研究所，保藏號CGMCC No. 10249。
[0043] 以下實施例中，所述種子培養(yǎng)基的組成如下：葡萄糖20g/L，甘油20g/L，可溶性淀 粉20g/L，黃豆餅粉30g/L，KH2P040 . 2g/L，MgS04 ·7Η20 0. 2g/L ;所述發(fā)酵培養(yǎng)基的組成如下：葡萄糖 8g/L，黃豆餅粉 22g/L，玉米淀粉 40g/L，MgS04 · 7H20 lg/L，ΚΗ2Ρ040· 2g/L，NaCl 2g/ L;所述改良的馬丁培養(yǎng)基（Martin Broth，MB)的組成如下：蛋白胨5g/L，酵母浸出粉2g/ L，葡萄糖20g/L，磷酸氫二鉀lg/L，硫酸鎂0· 5g/L，ρΗ6· 4。
[0044] 實施例1、化合物的制各
[0045] 1. 1、發(fā)酵
[0046] 將熏衣草灰色鏈霉菌（Streptomyces lavenduligriseus)CGMCC No. 10249接種于 種子培養(yǎng)基中，于28°C、220r/min下?lián)u床培養(yǎng)2天，再將培養(yǎng)好的種子以8%的接種量接種 于5L發(fā)酵罐中的發(fā)酵培養(yǎng)基中，于26~28°C下培養(yǎng)5~7天。
[0047] 1.2、分離純化
[0048] 將實施例1. 1中獲得的發(fā)酵產(chǎn)物用甲醇提取，減壓蒸餾得到提取物。將獲得的提 取物用正丁醇進行萃取，減壓蒸餾得到萃取物。將獲得的萃取物再用200~300目的硅膠 柱進行硅膠柱層析分離，采用氯仿和甲醇為洗脫溶劑進行梯度洗脫，其中，甲醇所占百分 比分別為0%、10%、20%、30%、40%、50%和100%，分別進行減壓濃縮獲得餾分1~7。 將餾分5(40%甲醇）進一步進行半制備液相色譜分離，層析柱為￥1(：-003(：-18(1(^111， 2〇1111]1\25〇1111]1)，采用甲醇和水為洗脫溶劑進行梯度洗脫分離，0~6〇1]1；[11采用38~50%的 甲醇洗脫，流速8ml/min，收集39. 5~41. 3min饋分為化合物1，收集46. 6~48. 2min的饋 分為化合物2。
[0049] 實施例2、化合物1的結構鑒定
[0050] 將實施例1. 2中所獲得的化合物1經(jīng)正離子電噴霧質(zhì)譜檢測，其圖譜如圖1所 示，顯示其準分子離子峰為：m/z 671.4010[M+H]+，分子式為C35H5S012，采用Bruker Avance 11-400型超導核磁共振儀測定了樣品的氫譜（圖2)、碳譜（圖3)及相關二維譜（HMQC譜、 H-H COSY譜、HMBC譜，圖4~6)，其核磁數(shù)據(jù)如表1所示。
[0051] 表 1、化合物 1 的 NMR 數(shù)據(jù)表（CD30D,，400MHz)
[0052]
[0053]
[0054] 通過上述檢測解析，確定了化合物1的所有碳原子和氫原子的歸屬，得到了化合 物1的結構如式（I)所示：
[0055]
[0056] 上述式（I )所示的化合物為一種新化合物，其化學名稱為：（2E，4E，6E，8E)-1 0, 15, 17, 19, 21，23, 25, 27-八羥基-14(1-羥己基）-11,28-二甲基-12, 29-二氧雜二環(huán) [26. 1. 0]二十九-2, 4, 6, 8-四烯-13-酮，即（2E, 4E, 6E, 8E) -10, 15, 17, 19, 21，23, 25, 27 -〇ctahydroxy-14-(1-hydroxyhexyl) -11, 28-di methyl-12, 29-dioxabicyclo[26. 1. 0] nonacosa-2, 4, 6, 8-tetraen_13-〇ne〇
[0057] 實施例3、化合物2的結構鑒定
[0058] 將實施例1. 2中所獲得的化合物2經(jīng)正離子電噴霧質(zhì)譜檢測，其圖譜如圖7所 示，顯示其準分子離子峰為：m/z 751.4241[M+Na]+，分子式為C3SH64013，采用Bruker Avance 11-400型超導核磁共振儀測定了樣品的氫譜（圖8)、碳譜（圖9)及相關二維譜（HMQC譜、 H-H COSY譜、HMBC譜，圖10~12)，其核磁數(shù)據(jù)如表2所示。
[0059] 表 2、化合物 2 的 NMR 數(shù)據(jù)表（CD30D,，400MHz)
[0060]


[0061]
[0062]
[0063] 通過上述檢測解析，確定了化合物2的所有碳原子和氫原子的歸屬，得到了化合 物2的結構如式（II )所示：
[0064]
[0065] 上述式（II)所示的化合物為一種新化合物，其化學名稱為： (17E, 19E, 21E, 23E, 25E)-16-(2, 3-二羥基丙氧基）-4, 6, 8, 10, 12, 14, 27-七羥基-3-(1-羥 己基）-17, 28-二甲基氧雜環(huán)二十八-17, 19, 21，23, 25-五烯-2-酮，即（17E, 19E, 21E, 23E ,25E)-16-(2,3-dihydroxypropoxy)-4, 6, 8, 10, 12, 14, 27-heptahydrox y-3-(1-hydroxyh exyl)-17, 28-dimethyloxacyclooctacosa_17, 19, 21, 23, 25-pentaen_2-〇 ne〇
[0066] 實施例4、化合物1和2的生物活性檢測
[0067] 在美國臨床實驗室標準化委員會（NCCLS)準則下，使用常量稀釋液體培養(yǎng)法 (macrondilution broth procedure)測定化合物對于白色念珠菌ATCC 10231的最小抑菌 濃度（MIC)，具體過程如下。
[0068] 采用白色念珠菌生長方法，用接種環(huán)挑取待檢菌落接種于4~5mL滅菌的改良的 馬丁培養(yǎng)基中，于37°C下培養(yǎng)48h。將菌液用生理鹽水或MB培養(yǎng)基稀釋備用。
[0069] 將實施例1. 2中獲得的化合物用MB培養(yǎng)基分別依次梯度稀釋，并加入上述稀釋的 菌液，使每管最終菌液濃度約為5 X 105CFU/mL，化合物濃度每管分別為256 μ g/mL、128 μ g/ mL、64 μ g/mL、32 μ g/mL、16 μ g/mL、8 μ g/mL、4 μ g/mL、2 μ g/mL、1 μ g/mL、0. 5 μ g/mL〇 同時 以不含化合物和菌液的空白MB培養(yǎng)基作為陰性對照，以含有同樣濃度的兩性霉素 B作為陽 性對照。
[0070] 將上述接種好的稀釋管于37°C培養(yǎng)2天，次日以肉眼觀察，藥物最低濃度管無白 色念珠菌生長者，即為受試菌的MIC，實驗重復3次。結果如表3所示。
[0071] 表3、化合物1和2對白色念珠菌的抑制活性
[0072]
[0073] 由表3的結果可知，本發(fā)明分離鑒定獲得的化合物1和2均具有抗白色念珠菌的 活性，因而可以用于制備抗白色念珠菌感染的藥物，這對于本領域的技術人員來說是顯而 易見的。
[0074] 以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理、主要特征和本發(fā)明的優(yōu)點。本行業(yè)的技術 人員應該了解，本發(fā)明不受上述實施例的限制，上述實施例和說明書中描述的只是說明本 發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下本發(fā)明還會有各種變化和改進，這些變 化和改進都落入要求保護的本發(fā)明范圍內(nèi)。本發(fā)明要求保護范圍由所附的權利要求書及其 等同物界定。
【主權項】
1. 具有抗白色念珠菌活性的化合物，其特征在于，所述化合物的結構式如式（I )或式 (II )所示：2. 如權利要求1所述的具有抗白色念珠菌活性的化合物的制備方法，其特征在于，通 過發(fā)酵熏衣草灰色鏈霉菌（Streptomyces lavenduligriseus)菌株CGMCC No. 10249,并對 發(fā)酵產(chǎn)物進行分離純化而得到。3. 如權利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述發(fā)酵的條件如下： 種子培養(yǎng)基的組成如下：葡萄糖20g/l，甘油20g/l，可溶性淀粉20g/l，黃豆餅粉30g/ L，KH2PO4O. 2g/L，Μ拆〇4 · 7&0 0. 2g/L ; 發(fā)酵培養(yǎng)基的組成如下；葡萄糖8g/l，黃豆餅粉22g/l，玉米淀粉40g/l，1拆〇4 · 7&0 Ig/L，KH2PO4O. 2g/L，化C1 2g/L ; 發(fā)酵溫度為26~28°C，發(fā)酵時間為5~7天。4. 如權利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述分離純化包括W下步驟： A) 將發(fā)酵產(chǎn)物用有機溶劑萃取，減壓蒸傭得到萃取物； B) 將步驟A)中所述萃取物用硅膠柱進行層析分離，并用洗脫溶劑進行梯度洗脫分離； C) 將步驟B)中所述梯度洗脫分離的產(chǎn)物用半制備液相進行色譜分離，并用洗脫溶劑 進行梯度洗脫分離。5. 如權利要求4所述的制備方法，其特征在于，所述步驟A)中所述有機溶劑為甲醇和 /或正了醇，所述步驟B)中所述洗脫溶劑為氯仿和甲醇，所述步驟C)中所述洗脫溶劑為甲 醇和水。6. 如權利要求4所述的制備方法，其特征在于，所述步驟B)中所述硅膠柱為200~300 目的硅膠柱。7. 如權利要求1所述的具有抗白色念珠菌活性的化合物的應用，其特征在于，用于制 備抗白色念珠菌感染的藥物。8. 一種熏衣草灰色鏈霉菌（S化巧tomyces laven化ligriseus)菌株，其特征在于，保 藏編號為 CGMCC No. 10249。9. 一種藥物組合物或抗白色念珠菌感染的藥物，其特征在于，含有如權利要求1所述 的具有抗白色念珠菌活性的化合物中的一種或兩種。10. 如權利要求9所述的藥物組合物或抗白色念珠菌感染的藥物，其特征在于，還包括 藥學上可接受的載體或賦形劑。
【文檔編號】C12N1/20GK105837590SQ201510024135
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2015年1月16日
【發(fā)明人】楊甲月, 楊志鈞, 羅敏玉, 殷瑜, 楊天, 戈梅
【申請人】上海來益生物藥物研究開發(fā)中心有限責任公司