一種乙酰唑胺的藥物組合物及其醫(yī)藥用圖
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種乙酰唑胺的藥物組合物及其醫(yī)藥用途，本發(fā)明提供的乙酰唑胺的藥物組合物中含有乙酰唑胺和一種從虎杖的干燥根中分離得到的結構新穎的天然產物化合物（Ⅰ），乙酰唑胺和該天然產物化合物（Ⅰ）單獨作用時，對帕金森病的防治效果較弱；二者聯(lián)合作用時，對帕金森病的防治效果顯著提高，可以開發(fā)成防治帕金森病的藥物，與現(xiàn)有技術相比具有突出的實質性特點和顯著的進步。
【技術領域】
[0001 ]本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領域，涉及帕金森病的防治，具體涉及一種乙酰唑胺的藥物 組合物及其防治帕金森病的醫(yī)藥用途。 一種乙酰唑胺的藥物組合物及其醫(yī)藥用途
【背景技術】
[0002]乙酰唑胺的化學名稱為N-(5-氨磺酰基-1，3,4_噻二唑-2-基）乙酰胺，目前臨床常 用于防治青光眼、心臟性水腫、腦水腫，亦用于癲癇小發(fā)作。
[0003]乙酰唑胺為碳酸酐酶抑制劑。在腎小管上皮細胞、胃黏膜、胰腺細胞、眼睫狀體上 皮細胞、紅細胞和中樞神經細胞中均有碳酸酐酶的分布。該酶的主要功能是促進COdPH2O結 合為碳酸，并使碳酸再解離為H +與HCO3'當碳酸酐酶的功能被抑制時，任何需要礦和大量而 連續(xù)供應的功能活動均受到影響，如:①腎小管近曲小管內的碳酸酐酶被抑制，H +的產生減 少，H+與Na+的交換減慢，Na+重吸收減少，Na+、H 20與重碳酸鹽排出增加，因而產生利尿作用， 排出堿性尿。但利尿作用很弱，且長期服用會導致耐受性的發(fā)生，故目前很少單獨用于利 尿，然而，它對于伴有水腫的子癇患者則有良好的利尿降壓作用;②眼內各部組織(如睫狀 體、視網膜、晶體)均有碳酸酐酶的存在，患青光眼時，睫狀體上皮內碳酸酐酶的活性增高， 眼壓上升。本品抑制睫狀體上皮細胞內碳酸酐酶的活性，使眼壓下降。本品具有類似磺胺 結構，口服吸收良好。服藥后30分鐘即能影響尿液的pH，l~1.5小時開始降低眼壓，t max為2~4 小時，作用持續(xù)8~12小時。t1/2約為3~6小時。絕大部分藥以原形由腎小管分泌，服用量的80% 在8~12小時內排出，24小時可完全排盡。
[0004] 帕金森病(Parkinson's disease，PD)是一種常見的神經系統(tǒng)變性疾病，老年人多 見，平均發(fā)病年齡為60歲左右，40歲以下起病的青年帕金森病較少見。我國65歲以上人群 的患病率大約是1.7%。大部分帕金森病患者為散發(fā)病例，僅有不到10%的患者有家族史。帕 金森病最主要的病理改變是中腦黑質多巴胺(dopamine, DA)能神經元的變性死亡，由此而 引起紋狀體DA含量顯著性減少而致病。導致這一病理改變的確切病因目前仍不清楚，遺傳 因素、環(huán)境因素、年齡老化、氧化應激等均可能參與ro多巴胺能神經元的變性死亡過程。
[0005] 迄今為止，尚未見乙酰唑胺的藥物組合物與帕金森病防治的相關性報道。

【發(fā)明內容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種乙酰唑胺的藥物組合物，該藥物組合物中含有乙酰唑 胺和一種從草本中分離得到的結構新穎的天然產物，乙酰唑胺和該天然產物可以協(xié)同防治 帕金森病。
[0007] 本發(fā)明的上述目的是通過下面的技術方案得以實現(xiàn)的： 一種具有下述結構式的化合物（I)，
[0008] -種乙酰唑胺的藥物組合物，包括乙酰唑胺、如上所述的化合物（I)和藥學上可以 接受的載體。
[0009] 如上所述的化合物（I)的制備方法，包含以下操作步驟：（a)將虎杖的干燥根粉碎， 用7 5~85%乙醇熱回流提取，合并提取液，濃縮至無醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯和水飽和 的正丁醇萃取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；（b)步驟(a)中正 丁醇取物用大孔樹脂除雜，先用1 〇%乙醇洗脫8個柱體積，再用70%乙醇洗脫10個柱體積，收 集70%洗脫液，減壓濃縮得70%乙醇洗脫濃縮物；（c)步驟(b)中70%乙醇洗脫濃縮物用正相硅 膠分離，依次用體積比為60:1、30:1、15:1和5:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到4個組分； (d)步驟(c)中組分4用正相硅膠進一步分離，依次用體積比為10:1、5:1和2:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到3個組分；（e)步驟(d)中組分2用十八烷基硅烷鍵合的反相硅膠分離，用 體積百分濃度為75%的甲醇水溶液等度洗脫，收集10~15個柱體積洗脫液，洗脫液減壓濃縮 得到化合物(I)。
[0010] 進一步地，步驟(a)中，用80%乙醇熱回流提取，合并提取液。
[0011] 進一步地，所述大孔樹脂為DlOl型大孔吸附樹脂。
[0012] 如上所述的化合物(I)在制備防治帕金森病的藥物中的應用。
[0013]如上所述的乙酰唑胺的藥物組合物在制備防治帕金森病的藥物中的應用。
[0014] 本發(fā)明的優(yōu)點： 本發(fā)明提供的乙酰唑胺的藥物組合物中含有乙酰唑胺和一種從虎杖中分離得到的結 構新穎的天然產物，乙酰唑胺和該天然產物單獨作用時，對帕金森病的防治效果較弱;二者 聯(lián)合作用時，對帕金森病的防治效果顯著提高，可以開發(fā)成防治帕金森病的藥物。本發(fā)明與 現(xiàn)有技術相比具有突出的實質性特點和顯著的進步。
【具體實施方式】
[0015] 下面結合實施例進一步說明本發(fā)明的實質性內容，但并不以此限定本發(fā)明保護范 圍。盡管參照較佳實施例對本發(fā)明作了詳細說明，本領域的普通技術人員應當理解，可以對 本發(fā)明的技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術方案的實質和范圍。
[0016] 實施例1:化合物(I)分離制備及結構確證 試劑來源：乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、二氯甲烷為分析純，購自上海凌峰化學試 劑有限公司，甲醇，分析純，購自江蘇漢邦化學試劑有限公司。
[0017]分離方法：（a)將虎杖的干燥根(2kg)粉碎，用80%乙醇熱回流提?。?5L X 3次），合 并提取液，濃縮至無醇味(3L)，依次用石油醚(3L X 3次）、乙酸乙酯(3L X 3次)和水飽和的正 丁醇（3LX 3次）萃取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；（b)步驟 (a )中乙酸乙酯萃取物用D101型大孔樹脂除雜，先用10%乙醇洗脫8個柱體積，再用70%乙醇 洗脫10個柱體積，收集70%洗脫液，減壓濃縮得70%乙醇洗脫濃縮物；（c)步驟(b)中70%乙醇 洗脫濃縮物用正相硅膠分離，依次用體積比為60:1 (10個柱體積）、30:1 (8個柱體積）、15:1 (10個柱體積)和5:1(8個柱體積)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到4個組分;（d)步驟(c)中組 分4用正相硅膠進一步分離，依次用體積比為10:1(10個柱體積）、5:1 (8個柱體積)和2:1 (6 個柱體積)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到3個組分;（e)步驟(d)中組分2用十八烷基硅烷鍵 合的反相硅膠分離，用體積百分濃度為75%的甲醇水溶液等度洗脫，收集10~15個柱體積洗 脫液，洗脫液減壓濃縮得到化合物（I) (435mg，HPLC歸一化純度大于98%)。
[0018] 結構確證:黃色無定形固體;HRESMS給出的準分子離子峰m/z 413.1698[M+H] +， 表明化合物分子式為C22H24N2O6,不飽和度為12。1!1-匪1?譜（口74(1丨116-(15,5001?。┲?，!1-1 (11.86，s)，H-3(3.66，d，J=10.6Hz)，H- 6(6.44，s)，H-9(7.53，d，J=2.3Hz)，H-ll(7.24，dd， J=8.5,2.3Hz)，H-12(7.46，d，J=8.5Hz)，H-14a(2.72，d，J=12.2Hz)，H-14b(2.04，ddd，J= 12.2，12.7，10.6Hz)，H-15(2.16，m)，H-16(3.15，m)，H-17(9.77，d，J=4.9Hz)，H-18(0.93，t， J=7.5Hz)，H-19a(l.59，m)，H-19b(l.24，m)，H-20(2.10，m)，H-21a(3.83，dd，J=10.6， 2.5Hz)，H-21b(2.26，d，J=IO. 6Hz)，22-0Me(3.65, s); 13C-NMR 譜（pyridine-ds，125MHz)中， C-2(135.7，C)，C-3(56.3，CH)，C-5(147.5，C)，C-6(108.6，CH)，C-7(105.4，C)，C-8(127.1， C)，C-9(103.5，CH)，C-10(152.3，C)，C-11(112.4，CH)，C-12(112.0，CH)，C-13(131.4，C)，C-14(32.6，CH2)，C-15(38.1，CH)，C-16(60.2，CH)，C-17(201.8，CH)，C-18(11.3，CH 3)，C-19 (23.7，CH2)，C-20(39.9，CH)，C-21(55.2，CH2)，C-22(173.8，C)，C-23(175.3，C)，22-0Me (51.7,013)。紅外波譜表明該化合物含有羰基（1725〇^1與1625(^1)基團；紫外波譜表明該 化合物含有吲哚（最大吸收205nm，276nm與311nm)基團。 1H-NMR譜顯示存在1，2,4-三取代苯 基質子信號3!17.53(1!1，(1，了=2.3抱，!1-9)，7.24(1!1，(1(1，了=8.5,2.3泡，!1-11)與7.46(1!1，(1，了= 8.5Hz，H-12); -個烯烴質子信號δΗ6.44( 1H，s，H-6);三組亞甲基質子信號δΗ2.72( lH，d，J= 12.2抱，!1-14&)與2.04(1!1，(1(1(1，了=12.2，12.7，10.6!^，!1-1413)、1.59(1!1，111，!1-19&)與1.24 (1!1，111，!1-1%)、3.83(1!1，(1(1，了=10.6,2.5!^，!1-21&)與2.26(1!1，(1，了=10.6抱，!1-2113) ;四組次 甲基質子信號3!13.66(1!1，(1，了=10.6泡，!1-3)、2.16(1!1，111，!1-15)、3.15(1!1，111，!1-16)與2.10 (lH，m，H-20);-個醛基質子信號6!19.77(3!1，(1，>4.9他，!1-17) ;-個連氧甲基質子信號6 !13.65(3!1，8,22-016);-個甲基質子信號5!10.93(3!1，扒>7.5抱，!1-18) ;-個連氮質子信號 δΗΙ 1.86( 1H，s，H-I)。13C-NMR譜與DEPT譜顯示有兩組雙鍵;兩個羰基；一個醛基;兩個甲基； 三個亞甲基；四個次甲基。 1H-1H⑶SY譜中，證明存在明顯的Η-3/Η2-14/Η-15/Η-16/Η-17， Η3-18/Η2-19/Η-20/Η2-21，Η-15/Η-20 與 Η-11/Η-12信號相關。據HMBC譜分析可知，甲氧基H 與C-22存在信號相關說明OMe與C-22位相連;進一步通過2D-INADEQUAR分析δ(：120-180范圍 內的碳碳直接相關信號可知，C-5與C-23存在相關信號，證明羧基與C-5位相連。在這類生物 堿骨架中，Η-15總是處在構型的α位；另外，H-3、H-14b與Η-15三者之間的偶合常數J 3a4b與 Ji4b,i5 為 10.6與12.7，表明!1-3、!1-1413與!1-15為同軸順式構型。1?(^3￥譜中，!1-3與!1-15，!1-3與 H-20以及H-15與H-20的相關性表明H-3與H-20為α構型。綜合氫譜、碳譜、HMBC譜和ROESY譜， 以及文獻關于相關類型核磁數據，可基本確定該化合物如下所示，立體構型進一步通過ECD 試驗確定，理論值與實驗值基本一致。
[0019]
[0020] 實施例2:對帕金森病模型的防治作用 本實施例使用MPTP(1-甲基-4-苯基-1，2,3,6-四氫吡啶）制備帕金森病(PD)小鼠模型， 觀察藥物改善動物肢體協(xié)調能力、調節(jié)腦內神經遞質失衡、恢復D A能神經元功能等方面的 抗ro作用。
[0021] 1、材料與方法 1.1動物 C57BL/6小鼠72只，Λ 7~8周齡，體質量18~22g，購自中國醫(yī)學科學院實驗動物研究所， 合格證號：SCXK(京）2014-0001。動物飼養(yǎng)在溫度（22 ± I) °C、相對濕度55%~65%、12h光照周 期的通風干燥環(huán)境中，采用大小鼠維持料1022飼養(yǎng)。
[0022] 1.2試劑與樣品 乙酰唑胺購自上海極威生物科技有限公司?；衔?I)自制，制備方法見實施例1。美多 巴片（上海羅氏制藥有限公司生產，批號：SH0502 ) jPTPJA、二羥基苯乙酸 (dioxyphenylacetic acid，D0PAC)、高香草酸（homovanil ic acid，HVA)、5_輕色胺（5_ hydroxytryptamine，5-HT)和5-輕吲噪乙酸（5-hydroxyindoleacetic acid，5_HIAA)均購 自Sigma_aldrich公司；酪氨酸輕化酶（trysine hydroxylase，TH)抗體購自Chemicon公司； 多巴胺轉運體（dopamine transporter，DAT)、膠質源性纖維蛋白（glial f ibriIIary acidic protein，GFAP)抗體購自Santa Cruz公司；卵白素-生物素過氧化物酶復合物 (avidin biotin-peroxidase (：〇111卩16叉，八13〇試齊丨」盒、二氨基耳關苯胺（(11&111；[110匕61^(1;[116， DAB)顯色劑購自北京中杉金橋生物技術有限公司。乙酰唑胺、化合物（I)及其組合物先用少 量DMSO超聲溶解，再用純化水溶解稀釋灌胃。
[0023] 1.3 儀器 小鼠爬桿實驗裝置(XPS-2,中國醫(yī)學科學院藥物研究所），小鼠懸掛實驗裝置（自制）， 冰凍切片機(SM900,美國Leica公司），高速低溫離心機(5810R，美國Eppendorf公司），熒光 顯微鏡(X71，日本OLYPUS公司），高效液相色譜庫侖電化學分析系統(tǒng)(HPLC-ECD Coulchem m，ESA，美國）。
[0024] 1.4小鼠分組及模型制備 C57BL/6小鼠隨機分為6組，每組12只，分別為正常對照組、模型對照組、陽性對照組(美 多巴組，50mg · kg-3和乙酰唑胺組（280mg · kg-1X化合物（I)組（280mg · kg-1X乙酰唑胺與 化合物（I)組合物組【140mg · kg-1乙酰唑胺+140mg · kg-1化合物（I)】。適應環(huán)境1周后，連續(xù) 灌胃給藥7d，正常對照組與模型對照組小鼠灌胃給予純化水;第8天開始，于每天灌胃給藥 45min后除正常對照組給予等體積0.9%氯化鈉溶液外，其余各組均腹腔注射MPTP(30mg · kg+1)，連續(xù)5d。在每次注射MPTP后立即觀察小鼠的各種急性表現(xiàn)，進行行為學檢測。
[0025] 1.5爬桿實驗 采用XPS-2小鼠爬桿實驗裝置，引導小鼠從桿頂爬到桿底，每只訓練4次，記錄小鼠爬到 桿底所需要的時間，超過60s的以60s計。在末次腹腔注射MPTP后lh，再次測定其爬桿時間， 每只小鼠測3次取平均值。衡量小鼠因 MPTP引起肢體協(xié)調能力下降程度。
[0026] 1.6懸掛實驗 將受試小鼠兩前爪懸掛于一根水平金屬線上（直徑1mm，距地面30cm)停留10s，每天2 次。于小鼠末次腹腔注射MPTP后1.5h進行測試。小鼠懸掛能力評分標準:在前IOs內，小鼠用 2個后爪抓住金屬線記3分，用1個后爪抓住金屬線記2分，2個后爪均抓不住金屬線記1分，最 后計算得分情況并記錄小鼠從金屬線上掉下的時間，超過60s以60s計。
[0027] 1.7統(tǒng)計學方法 實驗數據用均數土標準差(X土S)表示，應用SPSS 18.0版統(tǒng)計軟件進行單因素方差分 析和t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
[0028] 2、實驗結果 2.1對ro模型小鼠運動協(xié)調能力的影響 小鼠給予MPTP 3~5min后，可以觀察到小鼠震顫、運動減少、肌張力減退、呼吸急促、后 肢張開、步態(tài)不穩(wěn)、弓背、流涎、豎尾、豎毛等。個別出現(xiàn)癲樣發(fā)作，這些癥狀常常在30~60min 內消失，24h后基本恢復正常。連續(xù)5d腹腔注射MPTP后，模型對照組小鼠出現(xiàn)不同程度的運 動障礙，表現(xiàn)為肌肉僵直、攀爬時四肢協(xié)調能力降低、不能控制肢體平衡等，導致爬桿能力 下降，爬桿所需時間顯著延長(P<〇.01);與模型對照組比較，乙酰唑胺與化合物（I)組合物 組和美多巴組爬桿時間顯著縮短(P<〇. 01或P<〇. 05)，小鼠的肢體協(xié)調能力顯著改善；與 模型對照組比較，乙酰唑胺組、化合物（I)組爬桿時間縮短(P<〇.05)，小鼠的肢體協(xié)調能力 改善。結果見表1。
[0029] 2.2對ro模型小鼠懸掛行為的影響 與正常對照組比較，模型對照組小鼠的懸掛能力明顯降低，表現(xiàn)為懸掛評分顯著下降 (P<0.01)，懸掛時間明顯縮短(P<0.05)。與模型對照組比較，乙酰唑胺與化合物（I)組合 物組和美多巴組懸掛評分顯著提高(P<〇.01)，懸掛時間顯著延長(P<〇.01);與模型對照 組比較，乙酰唑胺組、化合物（I)組懸掛評分提高(P<〇.05)，懸掛時間延長(P<0.05)。結果 見下表。
[0030] 上述結果表明，乙酰唑胺和本發(fā)明提供的化合物（I)單獨作用時，對帕金森病的防 治效果較弱；乙酰唑胺和本發(fā)明提供的化合物(I)聯(lián)合作用時，對帕金森病的防治效果顯著 提高，可以開發(fā)成防治帕金森病的藥物。
[0031]上述實施例的作用在于說明本發(fā)明的實質性內容，但并不以此限定本發(fā)明的保護 范圍。本領域的普通技術人員應當理解，可以對本發(fā)明的技術方案進行修改或者等同替換， 而不脫離本發(fā)明技術方案的實質和保護范圍。
【主權項】
1. 一種具有下述結構式的化合物α)，2. -種乙酰唑胺的藥物組合物，其特征在于:包括乙酰唑胺、如權利要求1所述的化合 物(I)和藥學上可以接受的載體。3. 權利要求1所述的化合物（I)的制備方法，其特征在于，包含以下操作步驟：（a)將虎 杖的干燥根粉碎，用75~85%乙醇熱回流提取，合并提取液，濃縮至無醇味，依次用石油醚、乙 酸乙酯和水飽和的正丁醇萃取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物； (b)步驟(a)中正丁醇取物用大孔樹脂除雜，先用10%乙醇洗脫8個柱體積，再用70%乙醇洗脫 10個柱體積，收集70%洗脫液，減壓濃縮得70%乙醇洗脫濃縮物；（c)步驟(b)中70%乙醇洗脫 濃縮物用正相硅膠分離，依次用體積比為60:1、30:1、15:1和5:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫 得到4個組分;（d)步驟(c)中組分4用正相硅膠進一步分離，依次用體積比為10:1、5:1和2:1 的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到3個組分；（e)步驟(d)中組分2用十八烷基硅烷鍵合的反相 硅膠分離，用體積百分濃度為75%的甲醇水溶液等度洗脫，收集10~15個柱體積洗脫液，洗脫 液減壓濃縮得到化合物(I)。4. 根據權利要求3所述的化合物（I)的制備方法，其特征在于:步驟(a)中，用80%乙醇熱 回流提取，合并提取液。5. 根據權利要求3所述的化合物（I)的制備方法，其特征在于:所述大孔樹脂為D101型 大孔吸附樹脂。6. 權利要求1所述的化合物（I)在制備防治帕金森病的藥物中的應用。7. 權利要求2所述的乙酰唑胺的藥物組合物在制備防治帕金森病的藥物中的應用。
【文檔編號】C07D471/14GK105859717SQ201610321672
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年5月16日
【發(fā)明人】徐珍
【申請人】蘇州畢諾佳醫(yī)藥技術有限公司