一種抗hpv感染的抗體的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及生物制藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種抗HPV感染的抗體的制備方法，包括如下步驟：將HPV致病性的亞型的衣殼蛋白轉(zhuǎn)化到293TT細(xì)胞中，進(jìn)行假病毒的包裝，制備得到病毒樣顆粒，使用所述病毒樣顆粒作為抗原的一部分來(lái)免疫動(dòng)物得到抗HPV感染的抗體。本發(fā)明的抗HPV感染的抗體的制備方法所得抗體，為通過(guò)將HPV感染過(guò)程中入侵的關(guān)鍵蛋白：HPV L?1/L2(17?36短肽)、弗林蛋白酶、硫酸肝素類(lèi)蛋白多糖加上適當(dāng)?shù)淖魟﹣?lái)免疫蛋雞(或其他禽類(lèi))，再通過(guò)抗體工程技術(shù)，獲得的一定純度和濃度的多克隆特異性抗體，能夠快速中和HPV及阻斷HPV入侵的通道，起到防止高危型HPV的感染作用。
【專利說(shuō)明】
一種抗HPV感染的抗體的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及生物制藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種抗HPV感染的抗體的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 人乳頭瘤病毒(Human Papillomavirus，HPV)主要引起皮膚、黏膜的疣狀病變。根 據(jù)其與腫瘤發(fā)生的關(guān)系，HPV可分為高危型與低危型，其中高危型的HPV感染被證實(shí)是誘發(fā) 包括女性宮頸癌在內(nèi)的生殖器癌癥主要原因；低危型則主要引起尖銳濕疣。宮頸癌被稱作 "紅顏殺手"，在25-45歲的女性中，宮頸癌死亡率高居第二。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，全球每 年有52.9萬(wàn)新發(fā)宮頸癌病例，約有25萬(wàn)人死于宮頸癌，其中90%以上來(lái)自發(fā)展中國(guó)家。
[0003] 隨著對(duì)HPV感染方面的分子生物學(xué)、免疫學(xué)及病毒學(xué)研究的深入，通過(guò)主動(dòng)免疫和 被動(dòng)免疫治療可有效阻斷HPV的感染。主動(dòng)免疫:通過(guò)制備HPV的疫苗，以此免疫人體來(lái)激活 體內(nèi)的免疫系統(tǒng)，產(chǎn)生特異性抗體以及分泌此類(lèi)抗體的記憶淋巴細(xì)胞，預(yù)防后續(xù)入侵HPV的 感染。國(guó)外的一些大型生物制藥公司已開(kāi)發(fā)出了預(yù)防HPV感染的疫苗。其原理是使用HPV的 衣殼蛋白作為抗原，再加上佐劑制輔助，來(lái)免疫人體，使機(jī)體產(chǎn)生抗HPV的抗體以及相應(yīng)的 記憶免疫細(xì)胞，來(lái)應(yīng)預(yù)防續(xù)野生型HPV的感染。被動(dòng)免疫:通過(guò)體外產(chǎn)生大量抗體，再經(jīng)過(guò)分 離純化得到具有較高濃度、純度的特異性抗體。在皮膚黏膜層使用時(shí)能夠快速中和、包裹 HPV防止HPV的感染，但該方案中抗體的用量一般較大，而目前生產(chǎn)制備抗體的主要途徑是 通過(guò)雜交瘤細(xì)胞發(fā)酵產(chǎn)生或通過(guò)老鼠血清提取得到的抗體，此技術(shù)遠(yuǎn)不能滿足抗體體外使 用的需求;此外現(xiàn)有的技術(shù)水平停留在【抗體-病毒】治療模式，此模式雖可以快速中和體外 的病毒，但不能對(duì)黏膜表層形成一層持久的預(yù)防機(jī)制，即當(dāng)黏膜表層抗體數(shù)量下降時(shí)，就會(huì) 給HPV病毒乘虛而入的機(jī)會(huì)，仍會(huì)引起病毒的感染。所以該種治療方案雖在國(guó)外已有報(bào)道， 但未開(kāi)始產(chǎn)業(yè)化。
[0004] 根據(jù)目前的技術(shù)發(fā)展，主動(dòng)免疫和被動(dòng)免疫抗原制備上的一些技術(shù)瓶頸，如:抗原 表達(dá)菌株的遺傳不穩(wěn)定、發(fā)酵過(guò)程中異源微生物的污染、純化得率的不穩(wěn)定，抗體制備產(chǎn)量 低等。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是：提供一種新型的抗HPV感染的雞卵黃免疫球蛋白 (抗體)的制備方法。
[0006] 本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：提供一種抗HPV感染的抗體的制備方法，包括如下步 驟:提供一種抗HPV感染的抗體的制備方法，包括如下步驟:將HPV致病性的亞型的衣殼蛋白 轉(zhuǎn)化到293TT細(xì)胞中，進(jìn)行假病毒的包裝，制備得到病毒樣顆粒，以及通過(guò)原核或真核表達(dá) 制備得到HPV感染受體蛋白和協(xié)助蛋白酶，使用所述病毒樣顆粒、受體蛋白和協(xié)助蛋白作為 抗原來(lái)免疫動(dòng)物得到抗HPV感染的抗體。
[0007] 優(yōu)選的，上述的抗HPV感染的抗體的制備方法中，所述HPV致病性的亞型為HPV type-6/11/16/18/31/33/45/52/58。
[0008] 優(yōu)選的，上述的抗HPV感染的抗體的制備方法中，所述HPV致病性的亞型的衣殼蛋 白通過(guò)原核表達(dá)、酵母或CHO表達(dá)制備，或通過(guò)克隆到具有SV40啟動(dòng)子的真核質(zhì)粒中，轉(zhuǎn)化 到293TT細(xì)胞中。
[0009] 優(yōu)選的，上述的抗HPV感染的抗體的制備方法中，所述衣殼蛋白包括HPV-6/11/16/ 18/31/33/45/52/58衣殼蛋白LI、L2,所述HPV衣殼蛋白1^2的1^端17-36短肽，通過(guò)furin-PC5/ 6蛋白酶消化得到暴露，或通過(guò)多肽合成獲得短肽，再通過(guò)與大分子量蛋白偶聯(lián)以得到具有 免疫原性的抗原;最終將衣殼蛋白類(lèi)抗原與受體蛋白以及協(xié)助蛋白酶聯(lián)合得到混合抗原。 [0010]優(yōu)選的，上述的受體蛋白以及協(xié)助蛋白酶分別為:硫酸類(lèi)肝素蛋白多糖和弗林蛋 白酉每urin〇
[0011]優(yōu)選的，上述的抗HPV感染的抗體的制備方法中，所述抗原在免疫時(shí)添加的佐劑包 括:氫氧化錯(cuò)佐劑、3-〇-Desacyl Monophosphoryl lipid A和激動(dòng)劑。
[0012]優(yōu)選的，上述的抗HPV感染的抗體的制備方法中，所述動(dòng)物為蛋雞。
[0013]優(yōu)選的，上述的抗HPV感染的抗體的制備方法中，所述動(dòng)物為蛋雞。
[0014] 本發(fā)明的有益效果在于:本發(fā)明的抗HPV感染的抗體的制備方法所得抗體，其為通 過(guò)HPV感染過(guò)程中入侵的關(guān)鍵蛋白，如:硫酸肝素類(lèi)蛋白多糖受體蛋白、弗林蛋白酶-furin 及HPV(-6/ll/16/18/31/33/45/52/58)L-l/L2(17-36短肽）作為抗原免疫蛋雞(或其他禽 類(lèi)），再通過(guò)抗體工程技術(shù)，獲得特異性抗體，能夠快速中和HPV及阻斷HPV入侵的通道，起到 防止高危型HPV的感染作用。
【附圖說(shuō)明】
[0015] 圖1為本發(fā)明【具體實(shí)施方式】實(shí)施例1的效價(jià)曲線圖；
[0016] 圖2為本發(fā)明【具體實(shí)施方式】實(shí)施例1的中和曲線圖。
【具體實(shí)施方式】
[0017] 為詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容、構(gòu)造特征、所實(shí)現(xiàn)目的及效果，以下結(jié)合實(shí)施方式 并配合附圖詳予說(shuō)明。
[0018] 本發(fā)明最關(guān)鍵的構(gòu)思在于:利用蛋雞作為生物反應(yīng)器，用硫酸肝素類(lèi)蛋白多糖、弗 林蛋白酶-furin及HPV(致病亞性)L-l/L2(17-36短肽)作為抗原對(duì)蛋雞進(jìn)行程序免疫。然后 蛋雞會(huì)得到產(chǎn)生抗以上抗原的特異性抗體，并且在其卵黃中大量富集。再經(jīng)過(guò)提取技術(shù)從 雞卵黃中得到特異性抗體，使其能夠中和包裹HPV(致病亞型)-Ll&L2(17-36肽段)及封閉宿 主細(xì)胞表面受體相關(guān)蛋白的多克隆特異性抗體，防止HPV對(duì)黏膜層的入侵。
[0019] 關(guān)于高危型HPV感染的路徑目前已較為清晰：高危型HPV結(jié)合在陰道黏膜層破損部 位的基底膜細(xì)胞表面，與其結(jié)合的細(xì)胞表面受體為硫酸類(lèi)肝素蛋白多糖(heparan sulfate pro teg Iy can，HSPGs)，同時(shí)HPV的L2的N端被周?chē)腇ur in-PC5/6 (前體蛋白轉(zhuǎn)化酶)水解并 暴露出17-36的短肽，然后從HSPGs受體上脫落轉(zhuǎn)移，被附近鱗狀上皮細(xì)胞上的non-HSPGs受 體結(jié)合，啟動(dòng)入侵程序，感染上皮細(xì)胞。
[0020] 針對(duì)高危型HPV感染機(jī)制，本項(xiàng)目本發(fā)明在被動(dòng)免疫【抗體-病毒】模式的基礎(chǔ)之上 加上了【抗體-病毒受體】&【抗體-協(xié)助蛋白酶】（協(xié)助蛋白即弗林蛋白酶-furin)的預(yù)防模 式，其【抗體-病毒受體】治療模式的應(yīng)用，即特異性抗體與HPV受體結(jié)合起到封閉的作用，可 以使得HPV入侵的大門(mén)持久性的關(guān)閉，規(guī)避了因黏膜表層抗HPV抗體數(shù)量的減少引起HPV入 侵的風(fēng)險(xiǎn)，大大提高了抗HPV感染的效率。為得實(shí)現(xiàn)【抗體-病毒】、【抗體-病毒受體】、【抗體-協(xié)助蛋白酶】三種抗HPV感染預(yù)防模式聯(lián)合應(yīng)用，本項(xiàng)目將HPV感染過(guò)程中的關(guān)鍵受體蛋白 (硫酸肝素類(lèi)蛋白多糖）、協(xié)助蛋白酶(弗林蛋白酶）以及HPV-6/11/16/18/31/33亞型的LU L2(N端短肽)作為主要抗原再輔助相應(yīng)的佐劑，對(duì)蛋雞進(jìn)行免疫，產(chǎn)生多克隆的特異性抗體 并在蛋雞卵黃中富集。再經(jīng)過(guò)提取工藝進(jìn)行分離純化，得到純度較高的多克隆特異性雞卵 黃免疫球蛋白（抗體）。與預(yù)防性HPV疫苗相比較，具有作用時(shí)間短、起效快、不受到年齡段的 限制等優(yōu)點(diǎn)。在已感染HPV的人群中使用時(shí)具有防止交叉感染的作用，這一點(diǎn)是預(yù)防性HPV 疫苗所不具備的。
[0021]本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：提供一種抗HPV感染的抗體的制備方法，包括如下步 驟:將人硫酸肝素類(lèi)蛋白多糖、弗林蛋白酶-furin及HPV致病性的亞型的衣殼蛋白通過(guò)原核 表達(dá)、酵母或CHO表達(dá)制備，或通過(guò)制備得到病毒樣顆粒，將上述病毒感染關(guān)鍵蛋白包括病 毒受體、協(xié)助蛋白酶及病毒衣殼蛋白作為抗原來(lái)免疫動(dòng)物得到抗HPV感染的抗體。
[0022]優(yōu)選的，上述的抗HPV感染的抗體的制備方法中，所述動(dòng)物為蛋雞。
[0023]優(yōu)選的，上述的抗HPV感染的抗體的制備方法，所述的硫酸肝素類(lèi)蛋白多糖，通過(guò) 原核表達(dá)、酵母/CHO表達(dá)制備獲得，在經(jīng)過(guò)分離純化步驟獲得較純的目的蛋白，作為免疫抗 原。
[0024 ]優(yōu)選的，上述的抗HPV感染的抗體的制備方法，所述弗林蛋白酶-f ur i η是通過(guò)原核 表達(dá)、酵母/CHO表達(dá)獲得，再通過(guò)分離純化步驟獲得較純的且具有一定酶活力的目的蛋白 酶，作為免疫抗原，或預(yù)先與HPV L2蛋白混合暴露出L2N端17-36短肽后再作為免疫抗原。 [0025]優(yōu)選的，上述的抗HPV感染的抗體的制備方法中，所述HPV致病性的亞型為HPV type-6/11/16/18/31/33/45/52/58。
[0026]優(yōu)選的，上述的抗HPV感染的抗體的制備方法中，所述HPV致病性的亞型的衣殼蛋 白通過(guò)原核表達(dá)、酵母/CHO表達(dá)制備，或通過(guò)制備假病毒顆粒獲得。
[0027]實(shí)施例一抗HPV-16感染的雞卵黃免疫球蛋白（抗體)制備 [0028] 1基因克隆及蛋白的分離純化
[0029] 1.1通過(guò)NCBI/Genebank查詢相關(guān)蛋白分子的基因序列，包括:HPV(低危型、高危 型)L1、L2的全序列、硫酸肝素類(lèi)蛋白多糖及弗林蛋白酶-furin，通過(guò)基因合成得到完整的 基因序列。
[0030] 其中：HPV type-16 Ll基因序列：（SEQ ID NO: 1)。
[0031] HPV type-16 L2基因序列：（SEQ ID N0:2)。
[0032] I. 2將上述硫酸肝素類(lèi)蛋白多糖、弗林蛋白酶-及HPV-16亞型的LI和L2通過(guò)基因合 成后，再利用基因工程技術(shù)克隆到原核表達(dá)載體、真核表達(dá)載體(或具有SV40啟動(dòng)子和真核 增強(qiáng)子，以及合適的報(bào)告基因如HRP、熒光蛋白等)上?；蚬こ滩襟E包括:根據(jù)基因序列設(shè) 計(jì)PCR引物，引物兩端加上適當(dāng)?shù)拿盖形稽c(diǎn)，并且要求基因片段中不存在上述酶切位點(diǎn)，酶 切位點(diǎn)位于表達(dá)載體上的MCS中；然后以cDNA母載體為模板進(jìn)行PCR等相關(guān)操作，將目的基 因通過(guò)基因克隆的手段連接到表達(dá)載體中，之后進(jìn)行轉(zhuǎn)化擴(kuò)增和基因測(cè)序鑒定。
[0033] 主要技術(shù)路線：cDNA制備 PCR 酶切連接 表達(dá)載體轉(zhuǎn)化擴(kuò)增 測(cè)序 鑒定一一表達(dá)載體大量制備一一轉(zhuǎn)化/儲(chǔ)存(-S(TC)。
[0034] 1.3硫酸肝素類(lèi)蛋白多糖受體、弗林蛋白酶及HPV-16衣殼蛋白的表達(dá)純化
[0035] 通過(guò)基因克隆技術(shù)將目的基因連接到原核或真核目的表達(dá)載體上，將目的表達(dá)載 體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌、酵母菌或CHO細(xì)胞中，進(jìn)行可溶性表達(dá)。然后通過(guò)親和層析色譜技術(shù)對(duì) 目的蛋白進(jìn)行分離純化，得到純度在85%以上的目的蛋白，用于后續(xù)的免疫步驟。
[0036] 2、HPV_16假病毒制備
[0037] 2.1試劑耗材以及操作環(huán)境的準(zhǔn)備
[0038]假病毒制備用的細(xì)胞株為239TT細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中需要細(xì)胞培養(yǎng)基、培養(yǎng)皿、 血清等試劑的購(gòu)買(mǎi)；病毒衣殼蛋白基因和報(bào)告基因轉(zhuǎn)入需要的試劑（脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染相關(guān)試 劑）；由于假病毒具有一定的感染性，所以需要在具有生物安全級(jí)別的實(shí)驗(yàn)室中完成病毒包 裝；以及后續(xù)收貨病毒以及分離純化的過(guò)程中需要用的超高速離心機(jī)；
[0039] 2.2細(xì)胞培養(yǎng)與傳代
[0040]在細(xì)胞獲得后，首先將293TT進(jìn)行傳代以用于后續(xù)轉(zhuǎn)染試驗(yàn)等，并且凍存一定量于 液氮罐(-196Γ)內(nèi)長(zhǎng)期儲(chǔ)存。
[0041 ] 2.3基因轉(zhuǎn)染
[0042]首先將293TT細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)，然后預(yù)先鋪在24孔/12孔培養(yǎng)板中進(jìn)行培養(yǎng)。待細(xì)胞 的匯合率達(dá)到約40%時(shí)方可進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染用1丨口(^6(^3111；[1162000(；[11￥；[1：1'(^611)相關(guān)試劑， 按照說(shuō)明書(shū)中的操作步驟完成轉(zhuǎn)染。（可通過(guò)與熒光蛋白基因共轉(zhuǎn)染，對(duì)轉(zhuǎn)染效率進(jìn)行預(yù)評(píng) 估)。
[0043] 2.4病毒收獲
[0044] 細(xì)胞轉(zhuǎn)然后進(jìn)行過(guò)夜培養(yǎng)，病毒衣殼蛋白Ll或L1/L2在細(xì)胞內(nèi)完成組裝，從細(xì)胞內(nèi) 釋放。然后通過(guò)裂解劑的加入使病毒子徹底釋放，并經(jīng)過(guò)處理使得假病毒子成熟。
[0045] 2.50ptiprep梯度密度超高速離心分離純化病毒子
[0046]初步裂解得到假病毒子后，制備optiprep的密度梯度（27%、33%、39% )，再加入 適量病毒子，在23400〇18、16"€的條件下離心3.5-4小時(shí)。然后用26號(hào)注射器吸出目的分離 組分，并將假病毒子放入硅化試管內(nèi)，用于檢測(cè)/存于_80°C(病毒子感染效力下降10%/凍 融一次）。
[0047] 2.6HPV-16病毒子的感染能力的測(cè)定
[0048]該步驟測(cè)定包裝后HPV-16假病毒子的感染效力，通過(guò)將含有的堿性磷酸酶基因的 假病毒子梯度稀釋轉(zhuǎn)染293TT細(xì)胞，然后被轉(zhuǎn)染的293TT細(xì)胞會(huì)表達(dá)堿性磷酸酶基因，再加 入該酶的底物進(jìn)行顯色，依據(jù)吸光值計(jì)算病毒子的轉(zhuǎn)染效力。
[0049] 3、HPV typel6與弗林蛋白酶的預(yù)處理
[0050]該步驟中使用弗林蛋白酶與一定滴度及純度的HPV typel6假病毒顆粒按照一定 比例的進(jìn)行混合。使其充分消化L2N端氨基酸，暴露出17-36的短肽。
[0051 ]為了制備HPV typel6N端17-36短肽的抗原，還可以通過(guò)多肽合成技術(shù)獲得。HPV typel6N 端 17-36 短肽為：QLYKTCKQAGTCPPDIIPKV。
[0052]①多肽合成、純化
[0053]通過(guò)固相合成法，進(jìn)行合成，參照多肽合成相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)protocol，再通過(guò)質(zhì)譜儀、 HPLC進(jìn)行多肽純度鑒定。
[0054]②多肽抗原的聯(lián)合
[0055] 由于小分子量肽段是不能激發(fā)機(jī)體免疫應(yīng)答，所以需要將該肽段與相應(yīng)不會(huì)引起 免疫物種免疫反應(yīng)的大分子蛋白質(zhì)進(jìn)行聯(lián)合(雞卵白蛋白、BSA等）。然后用聯(lián)合后的分子作 為免疫原。
[0056] 3.1預(yù)處理
[0057] 將純化得到的弗林蛋白酶-furin，與一定滴度和純度的HPV typel6進(jìn)行孵育，為 了確保弗林蛋白酶的最合適的消化體系，需要對(duì)孵育時(shí)間進(jìn)行確定。
[0058] 3.2將反應(yīng)后的混合液通過(guò)動(dòng)物體內(nèi)是感染試驗(yàn)。陰性組和實(shí)驗(yàn)組的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均 用弗林蛋白酶抑制劑處理(使未經(jīng)弗林蛋白酶消化處理的病毒不能感染陰道黏膜層），陰性 對(duì)照為HPV-16PsV，實(shí)驗(yàn)組為HPV-16PsV&弗林蛋白酶混合液(實(shí)驗(yàn)組內(nèi)根據(jù)不同的比例分為 不同的實(shí)驗(yàn)小組）；陽(yáng)性組的動(dòng)物未經(jīng)任何處理的小鼠，用HPV-16PsV進(jìn)行感染。通過(guò)免疫組 化對(duì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組進(jìn)行檢測(cè)，確定實(shí)驗(yàn)組中熒光強(qiáng)度最弱的的一組即為酶反應(yīng)比例最適 組。參考：Rhonda C.Kines,Cynthia D.Thompson,Douglas R.Lowy,John T.Schiller,and Patricia M.DaylThe initial steps leading to papillomavirus infectionoccur on the basement membrane prior to cell surface binding。
[0059] 3.3確定最佳酶反應(yīng)時(shí)間后，制備一定量的"HPV type 16&弗林蛋白酶"反應(yīng)物。將 反應(yīng)底物直接作為抗原免疫蛋雞，產(chǎn)生具有對(duì)弗林蛋白酶、L2N端（17-36)短肽、Ll的特異性 抗性的多克隆抗體。
[0060] 4、相關(guān)抗原的免疫
[0061] 4.1雞的選種與飼養(yǎng)
[0062] 根據(jù)以前實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)，選擇白來(lái)航雞作為首選雞種，在動(dòng)物房的SPF級(jí)別條件下飼 養(yǎng)，從6周開(kāi)始飼養(yǎng)，8周后開(kāi)始啟動(dòng)免疫程序。
[0063] 4.2免疫分組
[0064] 不同的免疫原分為不同的實(shí)驗(yàn)組，不同的實(shí)驗(yàn)組根據(jù)抗原劑量、佐劑及免疫間隔 的不同分為不同的實(shí)驗(yàn)小組，實(shí)驗(yàn)小組的雞的數(shù)量應(yīng)符合統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)要求。抗原在免疫時(shí) 添加的佐劑不限于：AS-1 :氫氧化錯(cuò)佐劑（amorphous aluminum hydroxyphosphate sulpahte，AAHS)、AS_2:3-〇-Desacyl Monophosphoryl lipid A、AS-3:TLR(toll_like receptor )-4激動(dòng)劑等。
[0065] 抗原(HPV-16衣殼蛋白&弗林蛋白酶混合液+硫酸類(lèi)肝素蛋白多糖)5-200微克/毫 升加上佐劑AS-I (0 % -50 % ) /AS-2 (1 % -50 % ) /AS-3 (0 % -50 % )。
[0066] 劑量分組如表1。
[0067]表 1
[0069] 免疫實(shí)施:從第15周開(kāi)始免疫。免疫量:1ml/雞，分點(diǎn)注射(雞胸脯、大腿、翅膀等）。 總共免疫5次，最后一次加強(qiáng)免疫的抗原劑量加倍。
[0070] 4.3免疫效果監(jiān)測(cè)
[0071] 每實(shí)驗(yàn)小組從第3次免疫后第2天開(kāi)始收集雞蛋，按照時(shí)間進(jìn)行標(biāo)記。雞蛋卵黃初 級(jí)分離后，通過(guò)間接ELISA或競(jìng)爭(zhēng)ELISA進(jìn)行檢測(cè)。
[0072]抗HPV-16感染特異性抗體ELISA檢測(cè)盤(pán)的制作方法：
[0073] ①取HPV-16復(fù)合抗原（劑量A)，IOOug，用標(biāo)準(zhǔn)I3BS稀釋80倍后為包被液，IOOul/孔； 4 °C靜置過(guò)夜;包被完成后洗板，排干；
[0074]②取2.5 %奶精稀釋液（10*二抗稀釋液)稀釋十倍，136ul/孔，37 °C靜置3小時(shí)；包 被完成后洗板，排干；
[0075] ③晾干后，用鋁箱袋真空塑封，并在鋁箱袋上貼上標(biāo)簽，用標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)，比較與舊 盤(pán)差異。
[0076] ④取新盤(pán)6條，用抗體提取原液稀釋適當(dāng)倍數(shù)，A-G每孔IOOul。OD值范圍1.5-2.2， 檢測(cè)其均一性，變異系數(shù)(CV)不得大于8%。
[0077] 將每組加強(qiáng)免疫后1 (與上次間隔> 6小時(shí)）、2、3、4、5、7次收的雞卵黃進(jìn)行效價(jià)測(cè) 定，發(fā)現(xiàn)效價(jià)第3次收集的雞蛋中達(dá)到最大值。
[0078] 選取上述免疫分組中加強(qiáng)免疫后得到較好效價(jià)且分組內(nèi)記得健康狀況最好的結(jié) 果統(tǒng)計(jì)如下表2。
[0079]表 2
[0081 ] 4.4 HPV-16復(fù)合疫苗的規(guī)?；庖?br>[0082] 1)免疫前準(zhǔn)備
[0083]選擇一種"b-4-3"分組的疫苗進(jìn)行免疫。合適蛋雞養(yǎng)殖基地，雙方協(xié)商簽訂合作協(xié) 議，預(yù)定健康10周齡的海蘭雞200只進(jìn)行飼養(yǎng)，19~20周齡進(jìn)入產(chǎn)蛋期，每籠飼養(yǎng)4只，分50 籠進(jìn)行飼養(yǎng)。
[0084] 2)疫苗注射
[0085]飼養(yǎng)蛋雞養(yǎng)至15周齡進(jìn)行首次接種，HPV-typel6復(fù)合疫苗，每?jī)芍茏⑸湟淮危B續(xù) 注射5次。第三次注射后每日收集雞蛋，注明產(chǎn)蛋日期，籠號(hào)，以便取樣檢測(cè)雞蛋中有效抗體 效價(jià)。
[0086] 3)第五次做一次加強(qiáng)免疫，劑量為之前免疫劑量的2倍。后續(xù)六周免疫一次，至淘 汰蛋雞。
[0087] 4)對(duì)第三次、四次、五次免疫后分別抽樣檢測(cè)平均效價(jià)如下（5th_l/3/40指的是第 五次免疫后第一次、第三次和第四十次收集的雞蛋樣品）。
[0088] 5)結(jié)果顯示如圖1，，規(guī)?；庖叩谖宕魏竽軌蚴沟玫半u的效價(jià)達(dá)到5000以上，并 維持近6周左右。
[0089] 5、特異性中和抗體體外活性檢測(cè)
[0090]體外試驗(yàn)是指將特異性的雞卵黃抗體HPV病毒假病毒顆粒(或用Furin-PC5/6消化 后的L1/L2假病毒子)進(jìn)行體外中和，然后將中和后的抗體-病毒混合物感染293TT細(xì)胞，通 過(guò)表達(dá)HRP的酶活水平或熒光強(qiáng)度來(lái)評(píng)價(jià)抗體的體外中和效力。
[0091] 5.1假病毒制備
[0092] 冊(cè)￥-16口8611(1〇￥；[1'118(?8\0假病毒以一種帶有表達(dá)外泌型堿性磷酸酶表達(dá)質(zhì)粒的 病毒樣顆粒，在制備過(guò)程中將攜帶HPV LI、L2以及堿性磷酸酶的表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293TT細(xì) 胞，最后收獲PsV，檢測(cè)見(jiàn)病毒滴度。
[0093] 參考 https: //home · ccr · cancer · gov/1 co/pseudovirusproduct ion · htm
[0094] 5.2抗體的中和試驗(yàn)
[0095] ①將293TT細(xì)胞用含有一定稀釋倍數(shù)中和抗體的DMEM-10培養(yǎng)基稀釋至3xl05/ml， 然后加入到無(wú)菌的96孔板內(nèi)（IOOul/孔）。
[0096] ②準(zhǔn)備無(wú)菌硅化離心管和槍頭，將一定滴度的HPV-16PsV稀釋到1:200到1:20000。 然后加入到無(wú)菌96孔板內(nèi)（80ul/孔）。
[0097] ③在向"②"中加入20ul的含有一定稀釋倍數(shù)中和抗體(是"①"中5倍）
[0098] 的DMEM-10培養(yǎng)基以及陽(yáng)性對(duì)照，混合均勻。
[0099] ④待陽(yáng)性對(duì)照毒中和完畢后，將板放入1°C環(huán)境中1小時(shí)。
[0100] ⑤將"④"中混合液全部加入"①"中，混合后，放回細(xì)胞培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)72小時(shí)。
[0101] 5.3檢測(cè)堿性磷酸酶活性
[0102] 用clontech公司的堿性磷酸酶檢測(cè)試劑盒，檢測(cè)。參照使用說(shuō)明書(shū)，若每組樣品相 對(duì)光強(qiáng)度(RLUs)的差異超過(guò)10%-15%，應(yīng)重新檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果如表3。
[0103] 表3
[0105]數(shù)據(jù)用prism5.0分析如圖2所示。中和滴度定義:待檢抗體中和效價(jià)為RLUsEC50所 對(duì)應(yīng)的病毒滴度即l〇gEC50，其值越低說(shuō)明抗體的中和能力越強(qiáng)。
[0106] 6、抗HPV-16感染的體內(nèi)試驗(yàn)
[0107]驗(yàn)證用HPV-16復(fù)合疫苗免疫獲得的特異性抗體，對(duì)抑制HPV-16感染的實(shí)際效果進(jìn) 行體內(nèi)試驗(yàn)驗(yàn)證。
[0108] 6.1材料
[0109] BALb/c小鼠（8周齡雌性，20~25g)，抗HPV-16感染的特異性抗體，肝素 III，PC抑制 劑，氯化鈉，氯化鉀，十二水合磷酸氫二鈉，磷酸二氫鉀，CMC，壬基酚聚氧乙烯醚，Anti-HPV-16 Ll 鼠源單抗、山羊抗鼠二抗。
[0110] 6.2實(shí)驗(yàn)實(shí)施
[0111] ① PBS配制:氯化鈉 8g，氯化鉀0.2g，十二水合磷酸氫二鈉 3.58g，磷酸二氫鉀0.27g 溶于IL蒸餾水中。
[0112] ②預(yù)處理液:CMC 2g，壬基酚聚氧乙烯醚4g，PBS定容至100mL。
[0113] ③小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)一周，根據(jù)體重隨機(jī)分成5組，每組15只，A組（空白組），B組（陰 性組），C組(肝素酶III)，D組(PC抑制劑組），E組(Ab抗體組）。
[0114] ④小鼠實(shí)驗(yàn)處理為向陰道灌注相應(yīng)溶液，具體操作如下：
[0115] A組:灌注30uL預(yù)處理液+6uLPBS混合液，4h后灌注30uL預(yù)處理液；
[0116] B組：灌注30uL預(yù)處理液+6UIJBS混合液，4h后灌注30uL HPV-16 Ll的預(yù)處理液溶 液；
[0117] C組：灌注30uL預(yù)處理液+6uLPC抑制劑（200uM)混合液，4h后灌注30uL HPV-16 Ll 的預(yù)處理液溶液；
[0118] D組：灌注30uL預(yù)處理液+5uL肝素酶III(1.7U)混合液，4h后灌注30uL HPV-16 Ll 的預(yù)處理液溶液；
[0119] E組：灌注30uL預(yù)處理液+6uL抗HPV-16感染的特異性抗體混合液，4h后灌注30uL HPV-16 LI的預(yù)處理液溶液。
[0120] ⑤各組進(jìn)行上述操作完后2h，每組取三只處死，解剖取陰道組織，用PBS清洗后， 10%福爾馬林固定，進(jìn)行免疫組化，并觀察熒光亮度。
[0121] ⑥剩余小鼠分別于611、1211、2411、3611處死，每次處死3只。制作免疫組化切片，觀察 熒光。
[0122] 參考Rhonda C.Kines,Cynthia D.Thompson,Douglas R.Lowy1John T.Schiller, and Patricia M.DaylThe initial steps leading to papillomavirus infectionoccur on the basement membrane prior to cell surface binding。
[0123] 6.3觀察結(jié)果
[0124] 各組熒光切片觀察結(jié)果如下表4，其中"+"表示熒光亮度，表示不顯熒光。
[0125] 表4
[0127] 6.4結(jié)論:根據(jù)結(jié)果得出，用HPV-16PSV復(fù)合疫苗免疫得到的特異性抗體，可有效地 抑制HPV-16的感染。
[0128]以上所述僅為本發(fā)明的實(shí)施例，并非因此限制本發(fā)明的專利范圍，凡是利用本發(fā) 明說(shuō)明書(shū)及附圖內(nèi)容所作的等效結(jié)構(gòu)或等效流程變換，或直接或間接運(yùn)用在其他相關(guān)的技 術(shù)領(lǐng)域，均同理包括在本發(fā)明的專利保護(hù)范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種抗HPV感染的抗體的制備方法，其特征在于，包括如下步驟:將HPV致病性的亞型 的衣殼蛋白轉(zhuǎn)化到293TT細(xì)胞中，進(jìn)行假病毒的包裝，制備得到病毒樣顆粒，以及通過(guò)原核 或真核表達(dá)制備得到HPV感染受體蛋白和協(xié)助蛋白酶，使用所述病毒樣顆粒、受體蛋白和協(xié) 助蛋白作為抗原來(lái)免疫動(dòng)物得到抗HPV感染的抗體。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗HPV感染的抗體的制備方法，其特征在于，所述HPV致病性的 亞型為HPV type-6/11/16/18/31/33/45/52/58。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的抗HPV感染的抗體的制備方法，其特征在于，所述HPV致病性的 亞型的衣殼蛋白通過(guò)原核表達(dá)、酵母或CHO表達(dá)制備，或通過(guò)克隆到具有SV40啟動(dòng)子的真核 質(zhì)粒中，轉(zhuǎn)化到293TT細(xì)胞中。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的抗HPV感染的抗體的制備方法，其特征在于，所述衣殼蛋白包 括 HPV-6/11/16/18/31/33/45/52/58衣殼蛋白 L1、L2,所述 HPV 衣殼蛋白 1^2的1^端17-36 短肽， 通過(guò)fur in-PC5/6蛋白酶消化得到暴露，或通過(guò)多肽合成獲得短肽，再通過(guò)與大分子量蛋白 聯(lián)合以得到具有免疫原性的抗原;最終將衣殼蛋白類(lèi)抗原與受體蛋白以及協(xié)助蛋白酶聯(lián)合 得到混合抗原。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的抗HPV感染的抗體的制備方法，其特征在于，所述的受體蛋白 以及協(xié)助蛋白酶分別為:硫酸類(lèi)肝素蛋白多糖和弗林蛋白酶-fur in。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗HPV感染的抗體的制備方法，其特征在于，所述抗原在免疫 時(shí)添加的佐劑包括:氫氧化錯(cuò)佐劑、3-〇-Desacyl Monophosphoryllipid A和激動(dòng)劑。7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗HPV感染的抗體的制備方法，其特征在于，所述動(dòng)物為蛋雞。
【文檔編號(hào)】C07K16/08GK105859878SQ201610383955
【公開(kāi)日】2016年8月17日
【申請(qǐng)日】2016年6月2日
【發(fā)明人】胡博志, 鄒潮, 蘭增金
【申請(qǐng)人】藍(lán)佳堂生物醫(yī)藥（福建）有限公司