一株莢膜紅細(xì)菌菌株及其篩選方法與應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一株莢膜紅細(xì)菌的篩選方法及其應(yīng)用。莢膜紅細(xì)菌（Rhodobacter capsulatus），其保藏登記號為：CGMCC No：11753。本發(fā)明利用莢膜紅細(xì)菌為飼料添加劑制作對蝦食用飼料，飼喂結(jié)果顯示食用添加莢膜紅細(xì)菌飼料的對蝦相對于食用普通飼料的對蝦生長速度大幅提高且免疫力增加明顯，利用莢膜紅細(xì)菌制作飼料，生產(chǎn)周期短，生產(chǎn)成本低，易于控制生長條件，抗菌活性高且可明顯增強免疫力等諸多優(yōu)點，完全具有工業(yè)化生產(chǎn)的潛力，具有較好的生產(chǎn)應(yīng)用前景。CGMCC No：1175320151127
【專利說明】
一株莢膜紅細(xì)菌菌株及其篩選方法與應(yīng)用
[0001] 本發(fā)明得到973項目"對蝦白斑綜合征防治的免疫學(xué)途徑和關(guān)鍵技術(shù)原理"，項目 號2012CB114405以及天津師范大學(xué)生物學(xué)優(yōu)秀青年教師資助項目，項目號ZX110QN008的資 助。
技術(shù)領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明涉及一株莢膜紅細(xì)菌菌株及其篩選方法與應(yīng)用，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0003] 凡納濱對奸(1^1:〇口6仙6118 vannamei)，又稱南美白對奸(班1；^6 Prawn)，凡納濱對 蝦肉質(zhì)鮮美，并且與中國明對蝦和斑節(jié)對蝦并稱為世界三大蝦，在我國的對蝦養(yǎng)殖業(yè)中占 有極其重要的作用。但是隨著凡納濱對蝦集約化養(yǎng)殖的發(fā)展，對蝦疾病的爆發(fā)已經(jīng)對凡納 濱對蝦的養(yǎng)殖構(gòu)成嚴(yán)重的危害。為解決這一問題，人們最初采用抗生素來控制對蝦疾病，但 是抗生素的使用只能起到暫時控制，隨著使用時間的增長，大量病原菌產(chǎn)生了抗藥性，更加 難以控制?？股氐氖褂眠€會對凡納濱對蝦腸道及周圍水環(huán)境中的的有些微生物造成損 害，破環(huán)微生態(tài)的平衡，而且會產(chǎn)生由抗生素殘留導(dǎo)致的食品安全問題，從而對人類造成潛 在的危害。鑒于細(xì)菌在自然界生物類群中的地位和作用，許多學(xué)者開始相關(guān)的研究，將細(xì)菌 以活的微生物添加劑即益生菌添加到飼料中，通過改善與動物相關(guān)的或其周圍的微生物群 落，確保增加飼料的利用或增強其營養(yǎng)價值，增強動物對疾病的應(yīng)答或改善其周圍環(huán)境的 水質(zhì)從而有益于動物生長，并有望替代抗生素成為一個重要的研究方向。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明為了解決現(xiàn)有的水產(chǎn)高密度養(yǎng)殖模式容易導(dǎo)致養(yǎng)殖病害頻發(fā)及養(yǎng)殖水體 嚴(yán)重惡化等諸多問題，提供一株具有抗菌及產(chǎn)消化酶活性的菌株及其篩選方法和應(yīng)用，該 菌株是從凡納賓對蝦腸道分離篩選的一株新的菌株，具有抗菌活性及產(chǎn)生蛋白酶、淀粉酶 及脂肪酶活性。
[0005] 本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案得以實現(xiàn)： 一株具有抗菌及產(chǎn)消化酶活性的菌株，所述的菌株為Rhodobacter capsulatus R3菌 株，該菌株保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No: 11753。保藏時間2015年11月27日，地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，郵編100101。本 發(fā)明的菌株是從凡納賓對蝦腸道中分離并篩選得到的微生物，具有較強的抗菌活性及產(chǎn)消 化酶活性。
[0006] 本發(fā)明的菌株為Rhodobacter屬的莢膜紅細(xì)菌(Rhodobacter capsulatus)，命名 為Rhodobacter capsulatus R3,已于2015年11月27日保藏于中國微生物菌種保藏管理委 員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No: 11753。
[0007] 本發(fā)明的Rhodobacter capsulatus R3菌株的生物學(xué)特性如下： 莢膜紅細(xì)菌(Rhodobacter capsulatus)，命名為Rhodobacter capsulatus R3的菌落 不透明，表面濕潤粘稠，呈橘黃色，正反面顏色一致，菌落輪廓清晰，菌體易挑起，其菌落形 態(tài)見圖1，顯微鏡下菌體呈球狀，有固定形態(tài)的莢膜，細(xì)胞形態(tài)見圖2 Ihodobacter capsulatus菌株屬于革蘭氏陰性菌，最適生長溫度28°C，最適生長pH值在7-8之間。其生理 生化特性如下:能分解葡萄糖、果糖、蔗糖、甘露醇，不分解木糖及阿拉伯糖，不利用尿素、丙 二酸鹽，能液化明膠，硝酸鹽還原酶及過氧化氫酶陽性，鳥氨酸脫羧酶、賴氨酸脫羧酶、氧化 酶、吲哚試驗均為陰性。不產(chǎn)溶血毒素。對常用抗生素美洛西林、阿洛西林、頭孢噻肟、桿菌 肽、慶大霉素、四環(huán)素、羅美沙星、氯霉素呋喃妥因、利福平等敏感，藥敏試驗采用紙片瓊脂 擴散法，抗菌藥物紙片購于杭州微生物試劑有限公司。
[0008]本發(fā)明所述Rhodobacter capsulatus R3菌株的 16S rRNA序列如SEQ. NOl所不。 [0009] CGGTGGCGCAGCTACACATGCAAGTCGAGCGGAACGAGTTATCTGAACCTTCGGGGAACGATAACGGCGTCGAGCGG CGGACGGGTGAGTAATGCCTAGGAAATTGCCCTGATGTGGGGGATAACCATTGGAAACGATGGCTAATACCGCATGA TGCCTACGGGCCAAAGAGGGGGACCTTCGGGCCTCTCGCGTCAGGATATGCCTAGGTGGGATTAGCTAGTTGGTGAG GTAAGGGCTCACCAAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCA GACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAG AAGGCCTTCGGGTTGTAAAGCACTTTCAGTCGTGAGGAAGGTGGGGACGTTAATAGCGGCTTCATTTGACGTTAGCG ACAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCGAGCGTTAATCGGAATTACTGG GCGTAAAGCGCATGCAGGTGGTTTGTTAAGTCAGATGTGAAAGCCCGGGGCTCAACCTCGGAATAGCATTTGAAACT GGCAGACTAGAGTACTGTAGAGGGGGGTAGAATTTCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGAAGGAATACCG GTGGCGAAGGCGGCCCCCTGGACAGATACTGACACTCAGATGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCT GGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCTACTTGGAGGTTGTGGCCTTGAGCCGTGGCTTTCGGAGCTAACGCGTTAAGT AGACCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGT GGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTACTCTTGACATCCAGAGAACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCT TCGGGAACTCTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAG CGCAACCCTTATCCTTGTTTGCCAGCGAGTAATGTCGGGAACTCCAGGGAGACTGCCGGTGATAAACCGGAGGAAGG TGGGGACGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGAGTAGGGCTACACACGTGCTACAATGGCGCATACAGAGGGCGGC CAACTTGCGAAAGTGAGCGAATCCCAAAAAGTGCGTCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTC GGAATCGCTAGTAATCGTGGATCAGAATGCCACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCA TGGGAGTGGGCTGCAAAAGAAGTAGGTAGTTTAACCTTCGGGGGGACGCTTACCACTTGTGGTCAGG 所述Rhodobacter capsulatus R3菌株具有抗菌活性的能力。本發(fā)明的菌株對暢弧菌 (Vibrio anguiIlarum)具有較好的抑制效果，抑菌效果見圖3。
[0010] 另外，本發(fā)明所述菌株Rhodobacter capsulatus R3還具有較強的產(chǎn)消化酶的活 性，其中蛋白酶、淀粉酶及脂肪酶的活性均較高，其三種消化酶活性見圖4。
[0011]本發(fā)明進(jìn)一步公開了具有抗菌及產(chǎn)消化酶活性的菌株的篩選方法，所述的菌株為 Rhodobacter capsulatus R3菌株，該方法包括以下步驟： A、無菌條件下取對蝦的全腸于勻漿器中，冰浴研磨，用九鹽溶液進(jìn)行梯度稀釋，將各稀 釋液取O.lmL涂布在2216E培養(yǎng)基上，28°C恒溫培養(yǎng)后，挑取單菌落于2216E固體培養(yǎng)基上反 復(fù)劃線進(jìn)行純化獲得單菌落純培養(yǎng)物。
[0012] B、將得到的單菌落純培養(yǎng)物接種在含有指示菌的2216E培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，篩選， 得到具有抗菌活性的Rhodobacter capsulatus R3菌株。
[0013] C、在上述的具有抗菌活性的菌株的篩選方法中，所述的2216E培養(yǎng)基采用海水配 制。采用海水配置培養(yǎng)基因滲透壓沒有發(fā)生變化，從而保證了海源微生物菌株在篩選中不 會丟失。
[0014] D、將得到的單菌落分別點種于脂肪培養(yǎng)基、脫脂牛乳瓊脂培養(yǎng)基和淀粉培養(yǎng)基 上，根據(jù)菌落能否產(chǎn)生紅斑、蛋白水解圈以及淀粉水解圈篩選能分泌脂肪酶、蛋白酶及淀粉 酶的Rhodobacter capsulatus R3菌株。
[0015] E、在上述的具有產(chǎn)消化酶活性的菌株的篩選方法中，所述的脂肪培養(yǎng)基、脫脂牛 乳瓊脂培養(yǎng)基和淀粉培養(yǎng)基均采用九鹽溶液配制。采用海水配制培養(yǎng)基因滲透壓沒有發(fā)生 變化，從而保證了海源微生物菌株在篩選中不會丟失。
[0016] 在上述的具有抗菌及消化酶活性的菌株的篩選方法中，所述的2216E培養(yǎng)基采用 常規(guī)的2216E培養(yǎng)基即可。作為優(yōu)選，所述2216E培養(yǎng)基采用九鹽溶液配制，且所述2216E培 養(yǎng)基包括以下成分的重量配比：蛋白胨5g/L，酵母提取物lg/L，磷酸鐵O.lg/L，瓊脂20g/L ρΗ7·6~7·8〇
[0017] 在上述的具有抗菌活性的菌株的篩選方法中，作為優(yōu)選，步驟B中所述指示菌為 Vibrio anguillarum (暢弧菌，購買于中國科學(xué)院微生物研究所，在天津師范大學(xué)水生生 物實驗室保存）。
[0018] 在上述的具有抗菌及消化酶活性的菌株的篩選方法中，步驟E中所述脂肪培養(yǎng)基 采用本領(lǐng)域常規(guī)的原料配比即可。作為優(yōu)選，所述的脂肪培養(yǎng)基采用九鹽溶液配制，且所述 脂肪培養(yǎng)基包括以下成分的重量配比：營養(yǎng)瓊脂1000ml，花生油10g，l.6%的中性紅lml。
[0019] 在上述的具有抗菌及消化酶活性的菌株的篩選方法中，步驟E中所述脫脂牛乳瓊 脂培養(yǎng)基采用本領(lǐng)域常規(guī)的原料配比即可。作為優(yōu)選，所述的脫脂牛乳瓊脂培養(yǎng)基采用九 鹽溶液配制，且所述脫脂牛乳瓊脂培養(yǎng)基包括以下成分的重量配比：營養(yǎng)瓊脂1000ml，脫脂 牛乳 100ml，pH7.4。
[0020] 在上述的具有抗菌及消化酶活性的菌株的篩選方法中，步驟E中所述淀粉培養(yǎng)基 采用本領(lǐng)域常規(guī)的原料配比即可。作為優(yōu)選，所述的淀粉培養(yǎng)基采用九鹽溶液配制，且所述 淀粉培養(yǎng)基包括以下成分的重量配比：可溶性淀粉l〇g/L，蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L， K2HPO4 lg/L，MgS〇4*7H20 0.2g/L，NaCl 10g/L，瓊月旨 18g/L〇
[0021] 本發(fā)明更進(jìn)一步公開了莢膜紅細(xì)菌菌株在制備抑菌活性方面的應(yīng)用;特別是莢膜 紅細(xì)菌Rhodobacter capsulatus R3菌株在制備用于提高水產(chǎn)動物生長性能增強免疫力方 面的應(yīng)用。所述的抑菌活性指的是對暢弧菌(Vibrio anguillarum)的抑制。以及莢膜紅細(xì) 菌菌株在制備產(chǎn)消化酶活性方面的應(yīng)用，其中所述的消化酶指的是:蛋白酶、淀粉酶及脂肪 酶。實驗結(jié)果顯示：本發(fā)明的菌株為Rhodobacter capsulatus R3菌株，所述Rhodobacter capsulatus R3菌株用于制備水產(chǎn)動物的微生物制劑。由于Rhodobacter capsulatus R3菌 株具有較強的抗菌活性及產(chǎn)脂肪酶、蛋白酶、淀粉酶的活性。因此，可以用于制備水產(chǎn)動物 養(yǎng)殖的飼料添加劑及改善養(yǎng)殖水體的微生態(tài)制劑。
[0022] 本發(fā)明公開的Rhodobacter capsulatus R3菌株與現(xiàn)有技術(shù)相比所具有的積極效 果在于： 本發(fā)明的具有抗菌活性的菌株，是本發(fā)明人從對蝦腸道中篩選的一株新的菌株，該菌 株為Rhodobacter capsulatus R3菌株，具有較強的抗菌活性及產(chǎn)消化酶活性，提供了一種 新的具有抗菌活性的海源動物腸道微生物，為利用動物內(nèi)源性活性菌株用于水產(chǎn)動物養(yǎng)殖 中的病害防治、提高水產(chǎn)動物對飼料的消化吸收率以及改善水質(zhì)等方面提供新方法，促進(jìn) 水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的良性發(fā)展。
[0023]【附圖說明】： 圖1是本發(fā)明莢膜紅細(xì)菌菌株的菌落形態(tài)圖； 圖2是本發(fā)明莢膜紅細(xì)菌菌株的顯微(100X)照片圖； 圖3是本發(fā)明莢膜紅細(xì)菌菌株的鰻弧菌拮抗圖； 圖4是本發(fā)明莢膜紅細(xì)菌菌株的3種消化酶活性圖；其中（a)蛋白酶陽性，（b)淀粉酶陽 性，（c)脂肪酶陽性； 圖5 (a-e)是對蝦血細(xì)胞中相關(guān)免疫基因的的定量測定結(jié)果;其中（a)超氧化物氣化酶 基因相對表達(dá)量圖，（b)酚氧化酶原基因相對表達(dá)量圖，（c)抗菌肽基因相對表達(dá)量圖，（d) 溶菌酶基因相對表達(dá)量圖，（e)細(xì)胞粘附因子基因相對表達(dá)量圖； 圖6(a_f)是對蝦血漿相關(guān)免疫相關(guān)酶活力測定結(jié)果;其中（a)酸性磷酸酶活力圖，（b) 過氧化氫酶活力圖，（c)溶菌酶活力圖，（d)過氧化物酶活力圖，（e)超氧化物歧化酶活力 圖，（f)酚氧化酶活力圖； 圖7(a_c)是對蝦腸道消化酶活力的測定結(jié)果;其中（a)蛋白酶活力圖，（b)淀粉酶活 力圖，（c)脂肪酶活力圖； 圖8對蝦體重增加率圖； 圖9是攻毒試驗后對蝦死亡率統(tǒng)計結(jié)果。
[0024]
【具體實施方式】
[0025] 下面通過具體的實施方案敘述本發(fā)明。除非特別說明，本發(fā)明中所用的技術(shù)手段 均為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的方法。另外，實施方案應(yīng)理解為說明性的，而非限制本發(fā)明的 范圍，本發(fā)明的實質(zhì)和范圍僅由權(quán)利要求書所限定。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，在不背離本 發(fā)明實質(zhì)和范圍的前提下，對這些實施方案中的物料成分和用量進(jìn)行的各種改變或改動也 屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0026]本發(fā)明所用到的原料來源如下： 買施例1
本實施例中所用的凡納濱對蝦取自天津市漢沽區(qū)鑫永豐對蝦養(yǎng)殖場； 本實施例中所用的2216E培養(yǎng)基采用九鹽溶液配制； 本實施例中所用的2216E培養(yǎng)基包括以下成分的重量配比：蛋白胨5g/L，酵母提取物 lg/L，磷酸鐵O · lg/L，瓊脂20g/L pH7 · 6~7 · 8。
[0027] 本實施例中所述的指示菌為暢弧菌(Vibrio anguillarum)，購買于中國科學(xué)院微 生物研究所，在天津師范大學(xué)水生生物實驗室保存。
[0028] 本實施例的Rhodobacter capsulatus R3菌株的篩選方法： 菌株的分離純化:無菌條件下取對蝦的全腸于勻漿器中，冰浴研磨，用九鹽溶液對研磨 液進(jìn)行10-1~10-8的梯度稀釋;選取梯度為HT3~HT7的稀釋液各0.1 mL涂布在2216E培養(yǎng) 基上；28 °C恒溫培養(yǎng)24~48h;取單菌落在2216E培養(yǎng)基上進(jìn)行3~5次連續(xù)劃線分離純化，獲 得的純化后的菌株分別在4°C及-80°C下進(jìn)行短期及長期保存。
[0029] 對純化后的菌株進(jìn)行抑菌活性試驗：將指示菌鰻弧菌接種于TSB液體培養(yǎng)基中， 37°C恒溫?fù)u床16~18h;將活化后的指示菌用分光光度計測定其0D600的值，當(dāng)OD值在0.6~ 0.8之間濃度為宜;取指示菌懸液150yL均勻涂布于TSA固體培養(yǎng)基中，將平板劃分成不同的 區(qū)域并標(biāo)記;將純化后的菌株轉(zhuǎn)接液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)過夜，用無菌的鑷子夾取無菌濾 紙片置于培養(yǎng)液中浸透菌液，放置在培養(yǎng)皿的相應(yīng)位置，28°C恒溫培養(yǎng)24h，觀察記錄拮抗 斑的產(chǎn)生情況對有抑菌活性的菌株進(jìn)行篩選，得到有抗菌活性的菌株Rhodobacter capsulatus R3,該菌株已于2015年11月27日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通 微生物中心，保藏編號為CGMCC No:11753。
[0030] 實施例2 本實施例具有產(chǎn)消化酶活性的Rhodobacter capsulatus R3菌株的篩選方法，其分離 純化方法同實施例1中，這里不再贅述。
[0031 ]對純化后的菌株進(jìn)行消化酶活性試驗： A、將純化后的菌株轉(zhuǎn)接液體培養(yǎng)基中28 °C恒溫振蕩培養(yǎng)過夜，用無菌的鑷子夾取無菌 濾紙片置于培養(yǎng)液中浸透菌液，放置在制備好的脫脂牛乳培養(yǎng)基的對應(yīng)位置上，28°C恒溫 培養(yǎng)24h，對能分解蛋白質(zhì)而產(chǎn)生透明圈的菌株進(jìn)行篩選。
[0032] B、將純化后的菌株轉(zhuǎn)接液體培養(yǎng)基中28°C恒溫振蕩培養(yǎng)過夜，用無菌的鑷子夾取 無菌濾紙片置于培養(yǎng)液中浸透菌液，放置在制備好的淀粉培養(yǎng)基的對應(yīng)位置上，28°C恒溫 培養(yǎng)24h，碘液覆蓋后對能分解淀粉而產(chǎn)生透明圈的菌株進(jìn)行篩選。
[0033] C、將純化后的菌株轉(zhuǎn)接液體培養(yǎng)基中28°C恒溫振蕩培養(yǎng)過夜，用無菌的鑷子夾取 無菌濾紙片置于培養(yǎng)液中浸透菌液，放置在制備好的脂肪培養(yǎng)基的對應(yīng)位置上，28°C恒溫 培養(yǎng)24h，對能分解脂肪而形成紅色的菌株進(jìn)行篩選。
[0034] 本實施例中所用的脫脂牛乳培養(yǎng)基包括以下成分的重量配比：營養(yǎng)瓊脂1000ml， 脫脂牛乳100ml，pH7.4。
[0035] 本實施例中所用的淀粉培養(yǎng)基包括以下成分的重量配比：可溶性淀粉10g/L，蛋白 胨 10g/L，酵母提取物5g/L，K2HP〇4 lg/L，MgS〇4.7H20 0.2g/L，NaCl 10g/L，瓊脂 18g/L。
[0036] 本實施例中所用的脂肪培養(yǎng)基包括以下成分的重量配比：營養(yǎng)瓊脂1000ml，花生 油10g，l.6%的中性紅lml。經(jīng)上述方法篩選，最終得到具有產(chǎn)三種消化酶活性的菌株 Rhodobacter capsulatus R3〇
[0037] 實施例3 選取上述實施例得到的本發(fā)明具有抗菌活性及產(chǎn)消化酶活性的R h o d o b a c t e r capsulatus R3菌株進(jìn)行鑒定和分析，具體鑒定和分析方法以及相應(yīng)的鑒定結(jié)果如下所示。 [0038]采用上述實施例的方法篩選得到的具有抑菌活性及產(chǎn)消化酶活性的Rhodobacter capsulatus R3菌株接種到2216E培養(yǎng)基平板上，在28°C條件下倒置培養(yǎng)24h，觀察其菌落的 生長狀態(tài)，菌株形態(tài)及生理生化試驗參照工業(yè)微生物試驗技術(shù)手冊(諸葛健、王正祥，工業(yè) 微生物試驗技術(shù)手冊[M]，中國輕工業(yè)出版社，1994年)和伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(R.E布坎南， N.E吉本斯，伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊[M]，科學(xué)出版社，北京，1984年）。在恒溫培養(yǎng)箱中觀察其 在4°O50°C間的生長情況。
[0039] 上述Rhodobacter capsulatus R3菌株形態(tài)學(xué)及生理生化特征的鑒定結(jié)果表明： 菌落不透明，表面濕潤粘稠，呈橘黃色，正反面顏色一致，菌落輪廓清晰，菌體易挑起， 其菌落形態(tài)見圖1，顯微鏡下菌體呈球狀，有固定形態(tài)的莢膜，細(xì)胞形態(tài)見圖2 Ahodobacter capsulatus菌株屬于革蘭氏陰性菌，最適生長溫度28°C，最適生長pH值在7-8之間。能分解 葡萄糖、果糖、蔗糖、甘露醇，不分解木糖及阿拉伯糖，不利用尿素、丙二酸鹽，能液化明膠， 硝酸鹽還原酶及過氧化氫酶陽性，鳥氨酸脫羧酶、賴氨酸脫羧酶、氧化酶、吲哚試驗均為陰 性。不產(chǎn)溶血毒素。對常用抗生素美洛西林、阿洛西林、頭孢噻肟、桿菌肽、慶大霉素、四環(huán) 素、羅美沙星、氯霉素呋喃妥因、利福平等敏感。
[0040] 實施例4 本發(fā)明的Rhodobacter capsulatus R3菌株的分子生物學(xué)研究，即本發(fā)明菌株的16s rRNA的PCR擴增采用本領(lǐng)域常規(guī)的方法即可，需要說明的是PCR反應(yīng)模版的獲得。
[0041] 模板的獲取：采用上述實施例的方法篩選得到的具有抗菌活性和消化酶活性的 Rhodobacter capsulatus R3菌株的純化培養(yǎng)物接種到2216E液體培養(yǎng)基中，28°C振蕩培養(yǎng) 24h，制備菌懸液。取30yL的菌懸液與70yL的超純水混勾，100°C加熱5min，2000rpm離心 IOmin，取上清作為PCR反應(yīng)的模板。
[0042] 上述實施例中PCR擴增采用的引物為通用引物，由華大基因公司合成，引序列如 下： 5，-ACAAGCCCTGGAAACGGGGT-3，； 5 '-CACCAGGAATTCCGATCT-3 '； PCR擴增反應(yīng)的條件為:94°C預(yù)變性4min，進(jìn)入循環(huán)，94°C變性30s，50 °C退火Imin，72 °C 延伸2min，30個循環(huán)，72°C延伸IOmin后保存4°C狀態(tài)。PCR產(chǎn)物由華大基因公司完成測序，測 序結(jié)果如SEQ ID NO: 1所示。將本發(fā)明的莢膜紅細(xì)菌菌株的16s rRNA基因序列進(jìn)行同源性 分析，該菌株與Rhodobacter capsulatus同源性最高，同源性可達(dá)99%。
[0043] 實施例5 本發(fā)明的Rhodobacter capsulatus R3菌株的生產(chǎn)應(yīng)用研究。
[0044] 所述Rhodobacter capsulatus R3菌株在生產(chǎn)中的應(yīng)用是Rhodobacter capsulatus R3菌株添加到飼料原粉中，喂食給凡納濱對奸一定時期，觀察并測定其生長狀 態(tài)和自身免疫力的相對變化。具體方法如下： 本發(fā)明的Rhodobacter capsulatus R3菌株于液體2216E培養(yǎng)基中進(jìn)行逐級擴大培養(yǎng)， 制備大量菌株的發(fā)酵液，同時測定發(fā)酵液的細(xì)胞濃度。
[0045] 將擴大培養(yǎng)的發(fā)酵液添加到對蝦飼料原粉中制作飼料，制作飼料的方法如下： 將制備的菌株的發(fā)酵液按照比例添加到飼料原粉中，其中每I OOg對蝦飼料中添加 I Og 海藻酸鈉，添加莢膜紅細(xì)菌菌株發(fā)酵液20mL，至終濃度為3~6X107CFU/g。使飼料原粉與菌 液和海藻酸鈉充分混合均勻。飼料加工。將混合好的飼料揉成團狀，用顆粒劑機制直徑為 2mm的顆粒。飼料每7天制備一次，制備量隨凡納濱對蝦的生長而不斷增加。
[0046] 飼喂： 將制備好的飼料喂食對蝦，分為試驗組和對照組，每組投放600尾重約3.5g的凡納濱對 蝦。按凡納濱對蝦體重的5%投放飼料，每天投喂4次。記錄水質(zhì)的變化，并及時換水，防治殘 餌在水中時間過長引起水質(zhì)變化影響凡納濱對蝦的生長和健康。
[0047] 取樣與處理:每7天為一個周期，進(jìn)行一次取樣，取樣時每組隨機取30~40尾凡納濱 對蝦并記錄凡納濱對蝦的體重;從凡納濱對蝦圍心腔處抽取血淋巴，按照1:1的比例加入抗 凝劑，并在4°C，800g離心10min，獲得血細(xì)胞和血清。將血細(xì)胞中加入ImL Trizol置于-80°C 保存，血清置于4°C待用;取凡納濱對蝦的腸道，去除糞便后用試劑盒中的酶提取緩沖液，研 磨制備組織樣品。
[0048] 本實施例中所用的抗凝劑包括以下成分的配比： KC1:10 mM;NaCl:450 mM;HEPES:10 mM;EDTA(Na2):10 mM;PH:7.45。
[0049] 喂食Rhodobacter capsulatus R3菌株對奸各項生理指標(biāo)的測定：用取樣所得的 血細(xì)胞提取RNA，反轉(zhuǎn)為cDNA，以其為模板運用實時熒光定量的方法測定對蝦相關(guān)免疫基因 酚氧化酶原基因、超氧化物歧化酶基因、溶菌酶基因、細(xì)胞黏附因子基因和抗菌肽基因的定 量表達(dá)，具體測定方法見實施例6。對喂食Rhodobacter capsulatus R3菌株組對奸及對照 組對蝦的血液及腸道進(jìn)行取樣，所得的血清和腸道組織研磨液，用試劑盒(蘇州科銘試生物 試劑有限公司）測定試驗組對蝦非特異性免疫相關(guān)酶活性，具體包括:酚氧化酶、過氧化物 酶、酸性磷酸酶、超氧化物歧化酶S0D、過氧化氫酶及溶菌酶活力的測定，測定方法見實施例 7。對喂食Rhodobacter capsulatus R3菌株組對奸及對照組對奸的腸道進(jìn)行取樣，所得的 腸道組織研磨液，用試劑盒(蘇州科銘試生物試劑有限公司）測定試驗組對蝦腸道蛋白酶、 淀粉酶及脂肪酶活力的變化，具體測定方法見實施例8。此外，還測定了喂食Rhodobacter capsulatus R3菌株組對蝦及對照組對蝦的體重變化差異，以及在受到病原菌刺激的情況 下死亡率的差異，具體測定方法分別見實施例9和實施例10。
[0050] 實施例6 喂食Rhodobacter capsulatus R3菌株后，對奸相關(guān)免疫基因表達(dá)量的變化： RNA的提取:將上述取樣的對蝦血細(xì)胞，加入ImL Trizol; 4°C，12000g離心10 min;取 上清，靜置5分鐘，使其完全裂解。然后加 200yL氯仿，劇烈振蕩15s，室溫靜置 12000g，離心15min，離心后分三相：下層淺紅色酸，氯仿相是蛋白質(zhì)，中間相是DNA，上層無 色水相是RNA。取無色水相，加 500yL異丙醇，輕輕混勻，靜置15min，沉淀1?祖。4°(：，120008離 心10 min，棄上清倒置控干；加入lmL75%的乙醇，用槍頭輕揉吹打使RNA漂浮起來；4°C、 7500g離心6 min，棄上清倒置控干約15 min;加入適量的DEPC水，在55°C中水浴5 min后置 于-80°C冰箱中保存。提取的血細(xì)胞總RNA經(jīng)1%甲醛瓊脂糖凝膠電泳與NAN0Drop2000進(jìn)行定 性和定量檢測，確認(rèn)RNA完整性后用于cDNA的合成。
[0051 ] 第一鏈CDNA的合成：以2yg凡納濱對蝦血細(xì)胞總RNA為反轉(zhuǎn)錄模板，AOLP (5'- GGCCACGCGTCGACTAGTAC(T) 16-3 '）為反轉(zhuǎn)引物，根據(jù)以下反應(yīng)合成第一鏈cDNA: 表1第一鏈cDNA反應(yīng)體系
相關(guān)免疫基因的定量測定:將上述得到的cDNA作為Real-time PCR的模板，以β-actin 作為內(nèi)參引物，Real-time PCR的反應(yīng)體系為:95°C預(yù)變性30s，一個循環(huán)；95°C變性5s，60 °C退火30s，40個循環(huán);最后經(jīng)60°C升溫到95°C，每個循環(huán)上升0.5°C進(jìn)行融解曲線分析。所 獲得的數(shù)據(jù)經(jīng)統(tǒng)計分析后使用2_AACt法計算，采用t檢驗分析目的基因顯著性差異，所用 不同免疫基因的引物序列如下。
[0052]表2實驗用引物
試驗結(jié)果顯示，喂食添加本發(fā)明的Rhodobacter capsulatus R3菌株飼料的對4下的免 疫基因的表達(dá)量呈上調(diào)趨勢，同時試驗組比對照組的免疫基因表達(dá)量明顯增加，具體結(jié)果 見圖5,從分子的水平證明了喂食添加本發(fā)明的Rhodobacter capsulatus R3菌株飼料的對 蝦的免疫力明顯提高。
[0053] 實施例7 養(yǎng)殖對蝦相關(guān)免疫酶活的測定:所取樣本中蛋白含量測定用購于蘇州科銘試生物試劑 有限公司的考馬斯亮藍(lán)試劑盒。
[0054] 蛋白質(zhì)含量(yg/mL)=標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)濃度X (A測定-A空白）/(A標(biāo)準(zhǔn)-A空白）。
[0055] 酚氧化酶活力的測定：酚氧化酶活力的測定使用蘇州科銘生物有限公司的試劑 盒，按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。本試驗定義每mg蛋白在反應(yīng)體系中使525nm處吸光值變化 0.01為一個酶活力單位。
[0056] 酸氧化酶活力(U/mg prot)=反應(yīng)總體積/樣本體積/反應(yīng)時間/0.01 X (A測定-A對 照)/蛋白質(zhì)濃度(mg/mL )。
[0057]過氧化物酶活力的測定:過氧化物酶活力的測定使用蘇州科銘生物有限公司的試 劑盒，按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。本試驗定義每mL血清在反應(yīng)體系中沒分鐘A470變化 0.01為一個酶活力單位。
[0058]過氧化物酶活力(U/mL)=反應(yīng)總體積/樣本體積/0.01 X Δ A 酸性磷酸酶活力的測定：酸性磷酸酶活力的測定使用蘇州科銘生物有限公司的試劑 盒，按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。本試驗定義37°C中每毫升血液每分鐘催化產(chǎn)生Ιμπιο?酚為 一個酶活力單位。
[0059] 酸性磷酸酶活力(U/mL)= [C標(biāo)準(zhǔn)品X (Α測定管-A對照管）+ (Α標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管） X V反總]+V樣XV樣總+ Τ。
[0060]超氧化物歧化酶SOD活力的測定:超氧化物歧化酶活力的測定使用蘇州科銘生物 有限公司的試劑盒，按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。本試驗定義在黃嘌呤氧化酶偶聯(lián)反應(yīng)體 系中抑制率為50%時，反應(yīng)中的SOD酶活力為一個酶活力單位。
[0061 ] 抑制百分率=(Α對照管-A測定管)/Α對照管X 100% SOD活性(U/mL )=抑制百分率八1 -抑制百分率） 過氧化氫酶活力的測定:過氧化氫酶活力的測定使用蘇州科銘生物有限公司的試劑 盒，按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。本試驗定義每毫升血清每秒分解lymol的過氧化氫的量為 一個活力單位。
[0062] 過氧化氫酶活力(U/mL)=(A對照-A測定）X 271/(60 X取樣量）X樣本測試前稀釋 倍數(shù)。
[0063] 溶菌酶活力的測定：以溶壁微球菌(Micrococcus Iysoleikticus)凍干粉(南京建 成生物工程研究所生產(chǎn)）為底物，用0.1 M pH6.4的磷酸鉀緩沖液配制底物懸液，使0D570nm ? 0.3~0.5。在96孔板中加入血清和菌懸液，血清：均血液=1:10，測定570nm出的吸光值即 為初始吸光值A(chǔ)O。37 °C水浴15min，冰浴3min，測定570nm出的吸光值即為A。溶菌酶活力(U/ mL)=(A0_A)/A〇
[0064] 試驗結(jié)果顯示，喂食添加本發(fā)明的Rhodobacter capsulatus R3菌株飼料對4下的 酚氧化酶、過氧化物酶、酸性磷酸酶、超氧化物歧化酶S0D、過氧化氫酶及溶菌酶活力等特異 及非特異免疫酶活相對于對照組對蝦均有不同程度的提高，具體結(jié)果見圖6,從酶活的水平 證明了喂食添加本發(fā)明的Rhodobacter capsulatus R3菌株飼料的對奸的免疫力明顯提 尚。
[0065] 實施例8 養(yǎng)殖對蝦腸道消化酶活力的測定方法如下： A、蛋白酶活力的測定:蛋白酶活力的測定使用蘇州科銘生物有限公司的試劑盒，按照 試劑盒說明書進(jìn)行操作。本試驗定義30°C每毫克蛋白每分鐘水解產(chǎn)生lwiiol酪氨酸為一個 活力單位。
[0066] 蛋白酶活力(U/mg prot)=C標(biāo)準(zhǔn)品X (A測定-A空白）/(A標(biāo)準(zhǔn)-A空白）X稀釋倍數(shù)/ (蛋白質(zhì)含量X待測物的體積）。
[0067] B、淀粉酶活力的測定:淀粉酶活力的測定使用蘇州科銘生物有限公司的試劑盒， 按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。本試驗定義每mg組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生Img還原糖為一個 酶活力單位。
[0068] 淀粉酶活力(U/mg prot)=89.4X(A測定管-A對照管+0.022)/蛋白質(zhì)含量 C、脂肪酶活力的測定:脂肪酶活力的測定使用蘇州科銘生物有限公司的試劑盒，按照 試劑盒說明書進(jìn)行操作。本試驗定義37°C中每毫克蛋白每分鐘水解橄欖油生成Ιμπιο?脂肪 酸為一個酶活力單位。
[0069] 脂肪酶活力(1]/11^口1'〇1:)=[(：標(biāo)準(zhǔn)品\￥標(biāo)準(zhǔn)品\(4測定管-4空白管)/(4標(biāo)準(zhǔn)關(guān)-八 空白管）V(蛋白含量X上清總體積/加入到反應(yīng)體系的上清體積)/反應(yīng)時間. 試驗結(jié)果顯示，喂食添加本發(fā)明的Rhodobacter capsulatus R3菌株飼料對奸腸道的 蛋白酶、淀粉酶及脂肪酶活力相對于對照組對蝦均有不同程度的提高，具體結(jié)果見圖7,表 明喂食添加本發(fā)明的Rhodobacter capsulatus R3菌株飼料的對4下對飼料的消化吸收能力 明顯提尚。
[0070] 實施例9 養(yǎng)殖對蝦體重增加率的測定:試驗開始前，每組養(yǎng)殖池中隨機取出50尾凡納濱對蝦，測 定其體重，并進(jìn)行記錄MO，飼喂試驗結(jié)束后，每組養(yǎng)殖池中隨機取50尾測定其體并進(jìn)行記錄 M。通過計算得出每組對蝦的體重增加率:體重增加率(WGR，％)=(M-M0)/M0X100%。
[0071 ] 試驗結(jié)果顯示，喂食添加本發(fā)明的Rhodobacter capsulatus R3菌株飼料的對奸 的體重與比對照組相比較顯著增加，表明Rhodobacter capsulatus R3菌株的添加對提高 對蝦對飼料的消化吸收能力進(jìn)而提高體重的增加量具有一定的促進(jìn)作用，具體結(jié)果見圖8。
[0072] 實施例10 養(yǎng)殖對蝦攻毒試驗后死亡率的測定:在飼喂試驗結(jié)束后，每組取90尾大小均勻的凡納 濱對蝦進(jìn)行攻毒試驗，每組的90尾對蝦隨機分成三個平行。將制備好的致病菌鰻弧菌，通過 在對蝦的第二腹節(jié)進(jìn)行肌肉注射進(jìn)行攻毒試驗，注射菌的濃度為3.58X 107 cell /mL，注 射量為15yL。攻毒完成后，觀察對蝦存活情況，記錄對蝦的死亡數(shù)量，計算出72h內(nèi)的對蝦死 亡率。
[0073] 試驗結(jié)果顯示:對經(jīng)過飼喂的對蝦隨機取樣測定其在受到病原菌鰻弧菌感染72h 內(nèi)的累計死亡率，結(jié)果見圖9所示，可以得出添加候Rhodobacter capsulatus R3菌株后，試 驗組對奸的累計死亡率明顯低于空白組，說明添加的Rhodobacter capsulatus R3菌株在 提高對奸免疫力進(jìn)而提高其對致病菌的抵抗能力起到一定的作用。
[0074] 實施例11 一種含有莢膜紅細(xì)菌菌株的對蝦飼料，它是由對蝦飼料、莢膜紅細(xì)菌菌株發(fā)酵液、海藻 酸鈉組成，其中每100g對蝦飼料中添加 IOg海藻酸鈉，添加莢膜紅細(xì)菌菌株發(fā)酵液20mL，至 終濃度為3 X IO7CFlVg;所述的莢膜紅細(xì)菌菌株為Rhodobacter capsulatus R3菌株，保藏 編號為CGMCC No: 11753。
[0075] 實施例12 一種含有莢膜紅細(xì)菌菌株的對蝦飼料，它是由對蝦飼料、莢膜紅細(xì)菌菌株發(fā)酵液、海藻 酸鈉組成，其中每100g對蝦飼料中添加 IOg海藻酸鈉，添加莢膜紅細(xì)菌菌株發(fā)酵液20mL，至 終濃度為6 X IO7CFlVg;所述的莢膜紅細(xì)菌菌株為Rhodobacter capsulatus R3菌株，保藏 編號為CGMCC No: 11753。
[0076] 本發(fā)明中所描述的具體實施例僅是對本發(fā)明精神做舉例說明，本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的 技術(shù)人員可以對所描述的具體實施例做相應(yīng)的修改和補充或采用類似的方式替代，但并不 會偏離本發(fā)明的精神或者超越所者所附權(quán)利要求書所定義的范圍。盡管本發(fā)明已作出詳細(xì) 的說明書并引證了一些具體實施例，但是對本領(lǐng)域所熟練技術(shù)人員來說，只要不離開本發(fā) 明的精神和范圍可做相應(yīng)變化或修正是顯然的。
【主權(quán)項】
1. 一株莢膜紅細(xì)菌菌株，其特征在于所述的菌株為Rhodobacter capsulatus R3菌株， 該菌株已于2015年11月27日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏 編號為CGMCC No: 11753。2. 權(quán)利要求1所述莢膜紅細(xì)菌菌株，其特征在于，所述Rhodobacter capsulatus R3菌 株的16S rRNA序列如SEQ. N01所示。3. 權(quán)利要求1所述莢膜紅細(xì)菌菌株在制備抑菌活性方面的應(yīng)用；所述的抑菌活性指的 是對暢弧菌(V i br i 〇 angu i 11 arum )的抑制。4. 權(quán)利要求1所述Rhodobacter capsulatus R3菌株在制備產(chǎn)消化酶活性方面的應(yīng)用， 其中所述的消化酶指的是:蛋白酶、淀粉酶及脂肪酶。5. 權(quán)利要求1所述莢膜紅細(xì)菌Rhodobacter capsulatus R3菌株在制備用于提高水產(chǎn) 動物生長性能增強免疫力方面的應(yīng)用。
【文檔編號】A61P31/04GK105861390SQ201610367222
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年5月30日
【發(fā)明人】左志晗, 孫金生, 竇春萌
【申請人】天津師范大學(xué)