具有抗血栓作用的方格星蟲(chóng)活性蛋白酶及其制備方法和應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種具有抗血栓作用的方格星蟲(chóng)活性蛋白酶及其制備方法和應(yīng)用，該活性蛋白酶的N端氨基酸序列為Pro?Phe?Pro?Val?Pro?Asp?Pro?Phe?Val?Trp?Asp?Thr?Ser?Phe?Gln。本發(fā)明通過(guò)大量試驗(yàn)篩選，采用硫酸銨沉淀結(jié)合疏水作用層析、離子交換層析和凝膠過(guò)濾層析的方法對(duì)活性蛋白酶進(jìn)行分離純化，制備得到純度高于95％以上的方格星蟲(chóng)活性蛋白酶。本發(fā)明首次采用纖維蛋白平板法的體外評(píng)價(jià)方法和FeCl3誘導(dǎo)的大鼠動(dòng)脈血栓模型的體內(nèi)評(píng)價(jià)方法對(duì)活性蛋白酶進(jìn)行活性評(píng)價(jià)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明制備得到的方格星蟲(chóng)活性蛋白酶具有很好的抗血栓性能，可用于制備抗血栓藥物，具有很好的應(yīng)用前景。
【專利說(shuō)明】
具有抗血栓作用的方格星蟲(chóng)活性蛋白酶及其制備方法和應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一種蛋白酶，具體涉及一種從方格星蟲(chóng)中分離得到的具有抗血栓活性 的活性蛋白酶，屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 星蟲(chóng)，亦稱沙蟲(chóng)、土筍、泥丁，世界分布廣泛，在我國(guó)資源也非常豐富。由于其顯著 的藥效作用和含量豐富的營(yíng)養(yǎng)成分，其在我國(guó)具有悠久的藥用、食用歷史。本草記載星蟲(chóng)味 咸、性寒，歸肺、腎經(jīng)，具有滋陰降火、清肺補(bǔ)虛、活血強(qiáng)身及補(bǔ)腎養(yǎng)顏之功效，主要用于治療 骨蒸潮熱、肺虛喘咳、胸悶痰多、陰虛盜汗以及婦女產(chǎn)后乳汁稀少等癥。
[0003] 自20世紀(jì)80年代末以來(lái)，由于市場(chǎng)價(jià)格的刺激，方格星蟲(chóng)遭到掠奪式采掘，再加上 海洋污染的加劇，其資源量急速下降，因此開(kāi)始發(fā)展人工養(yǎng)殖。但由于方格星蟲(chóng)在稚蟲(chóng)時(shí)期 遇到的蟲(chóng)害比較多，難以提高養(yǎng)殖的生產(chǎn)效益，從而浪費(fèi)了許多生產(chǎn)資源。
[0004] 據(jù)《中華本草》記載，其肉質(zhì)脆嫩，鮮美甘甜，東南沿海居民稱其為"海洋冬蟲(chóng)夏 草"，并將其作為一種海味珍品和高級(jí)補(bǔ)品?，F(xiàn)代研究結(jié)果顯示星蟲(chóng)含有豐富的氨基酸、微 量元素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)以及一些特殊的活性成分，具有多種藥理活性。自古星蟲(chóng)就有多種藥食 用法，比如曬干、水煎單用；去內(nèi)臟，以好酒浸，具有活血強(qiáng)身之功效;去內(nèi)臟，置于老鴨頭 部，加料、蒸爛、食之，達(dá)到治療病后體弱的作用。
[0005] 但是對(duì)方格星蟲(chóng)活性蛋白的深入研究較少，有待于進(jìn)一步開(kāi)發(fā)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 發(fā)明目的:本發(fā)明的目的是在方格星蟲(chóng)現(xiàn)有研究的基礎(chǔ)之上，通過(guò)大量實(shí)驗(yàn)篩選， 采用現(xiàn)代化技術(shù)手段，對(duì)方格星蟲(chóng)的活性蛋白成分進(jìn)行分離純化，本發(fā)明首次采用硫酸銨 沉淀結(jié)合疏水作用層析、離子交換層析和凝膠過(guò)濾層析的方法對(duì)星蟲(chóng)活性蛋白酶進(jìn)行分離 純化，制備得到的方格星蟲(chóng)活性蛋白酶，純度可達(dá)95%以上，抗血栓活性強(qiáng)，具有重要的應(yīng) 用價(jià)值。
[0007] 技術(shù)方案:為了實(shí)現(xiàn)以上目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案為:一種具有抗血栓作用的 方格星蟲(chóng)活性蛋白酶，其特征在于，該活性蛋白酶的N端氨基酸序列為?!·。-?]^-?!·。-^%]^-Pro-Asp-Pro-Phe-Va I-Trp-Asp-Thr-Ser-Phe-Gln (腫氛酸-苯丙氛酸-腫氛酸-繳氛酸-腫 氨酸-天冬氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-纈氨酸-色氨酸-天冬氨酸-蘇氨酸絲氨酸-苯丙氨酸-谷 氨酰胺）。
[0008] 作為優(yōu)選方案，以上所述的具有抗血栓作用的方格星蟲(chóng)活性蛋白酶，其特征在于， 方格星蟲(chóng)活性蛋白酶的相對(duì)分子質(zhì)量為28003.67D。
[0009] 本發(fā)明所述的具有抗血栓作用的方格星蟲(chóng)活性蛋白酶的制備方法，包括以下步 驟：
[0010] (1)活性蛋白酶粗水提物的制備
[0011] 取新鮮方格星蟲(chóng)，洗去雜質(zhì)和泥沙，解剖星蟲(chóng)，除去體內(nèi)泥沙，將其剪碎并且勻漿 后加入PBS緩沖液，攪拌均勻，于-10至-20 °C中冷凍12~24h后再置于4°C解凍，然后離心，取 上清液;沉淀部分加入PBS緩沖液繼續(xù)重復(fù)上述步驟;將上清液進(jìn)行冷凍干燥，-20°C保存?zhèn)?用；
[0012] (2)活性蛋白酶水提物的粗分離
[0013] 硫酸銨沉淀區(qū)間的確定及星蟲(chóng)水提物硫酸銨沉淀
[0014] 取步驟（1)制備得到的活性蛋白酶粗水提物，向其中分別一邊攪拌一邊加入硫酸 銨固體粉末至30%的百分飽和度，混勻后于(TC孵育30min，然后取鹽析液進(jìn)行離心，取上 清，再向上清液中繼續(xù)加入一定量的硫酸銨固體粉末至60%的百分飽和度，混勻后于(TC孵 育30min，再將鹽析液離心，收集活性蛋白酶沉淀；
[0015] 活性蛋白酶沉淀的透析脫鹽除雜
[0016] 將經(jīng)硫酸銨沉淀得到的活性蛋白酶沉淀，用PBS緩沖液進(jìn)行復(fù)溶后，加入到截留分 子量大于3500D的透析袋中，在4°C儲(chǔ)存柜中用I 3BS緩沖液磁力攪拌透析24~48h，除鹽除雜 后凍干，得到活性蛋白酶粗品，備用；
[0017] ⑶活性蛋白酶的精制
[0018] 采用美國(guó)GE公司的AKTAiMPure蛋白純化系統(tǒng)對(duì)活性蛋白酶進(jìn)行精制
[0019] (3.1)疏水作用層析
[0020] 樣品處理：用lm〇L/L(NH4)2S〇4溶液將活性蛋白酶粗品溶解，離心，并通過(guò)0 · 45μπι水 膜過(guò)濾除雜后備用；
[0021] 上樣洗脫：
[0022] 按柱體積的2 %上樣，流動(dòng)相:A相為I3BS緩沖液和B相為用PBS緩沖液溶解的lm〇L/L (NH4)2S〇4 溶液，梯度洗脫：100%B，3CV;100%-60%B，0.5CV;60%B，0.75CV;60%-40%B， 0.25CV；40%B,0.75CV；40%-20%B,0.25CV；20%B,0.75CV；20%-0B,0.25CV；100%A,2CV； 流速:3mL/min;紫外檢測(cè)波長(zhǎng):280nm;以9mL/管進(jìn)行收集，測(cè)定每管蛋白濃度和酶活力，計(jì) 算比活力，合并收集；
[0023] (3.2)活性蛋白酶活性組分的透析脫鹽除雜
[0024] 將經(jīng)步驟(3.1)疏水作用層析收集得到的活性蛋白酶活性組分用PBS緩沖液進(jìn)行 復(fù)溶后加入到截留分子量大于3500Da的透析袋中，在4°C儲(chǔ)存柜中用PBS緩沖液磁力攪拌透 析24~48h，凍干，-20°C保存?zhèn)溆茫?br>[0025] (3.3)Q Sepharose High Performance離子交換層析
[0026] 樣品處理
[0027]用PBS緩沖液將上步驟(3.2)得到的活性蛋白酶活性組分溶解，離心，并通過(guò)0.45μ m水膜過(guò)濾除雜后備用；
[0028]上樣洗脫
[0029]按柱體積的2 %上樣；流動(dòng)相：A相為PBS緩沖液和B相為用PBS緩沖液溶解的 0 · 8moL/LNaCl溶液，梯度洗脫：100 % A，2CV; 0-20 %B，0 · 25CV; 20 %B，2CV; 20 % -30 % B， 0.25CV；30%BaCV；30%-50%B,0.25CV；50%BaCV；50%-70%B,0.25CV；70%B,0.75CV； 70 % -100 %B，0 · 25CV; 100 %，2CV;流速：3mL/min;紫外檢測(cè)波長(zhǎng)：280nm;以9mL/管進(jìn)行收 集，測(cè)定每管蛋白濃度和酶活力，計(jì)算比活力進(jìn)行合并收集；
[0030]樣品脫鹽除雜
[0031] 采用Thermo Zeba脫鹽離心柱對(duì)經(jīng)離子交換層析收集得到的活性組分進(jìn)行脫鹽處 理;將活性組分上樣于脫鹽離心柱中，離心，收集樣品；
[0032] 采用Millipore Amicon Ultra 3K超濾管對(duì)經(jīng)離子交換層析并脫鹽的活性組分進(jìn) 行除雜濃縮，將脫鹽后的活性組分上樣于預(yù)先用去離子水預(yù)處理過(guò)的超濾管中，離心，收集 樣品，凍干，-20 °C保存?zhèn)溆茫?br>[0033] (3.4)Superdex prep grade G-75凝膠過(guò)濾層析
[0034] 樣品處理
[0035]用PBS緩沖液將上步驟得到的活性蛋白酶活性組分溶解，離心(8000r/min，30min， 4°C)并通過(guò)0.45μπι水膜過(guò)濾除雜后備用；
[0036]上樣洗脫
[0037]按柱體積的2%上樣，流動(dòng)相:PBS緩沖液;洗脫方式：5CV等度洗脫;流速:0.8mL/ min;紫外檢測(cè)波長(zhǎng):280nm;以9mL/管進(jìn)行收集，測(cè)定每管蛋白濃度和酶活力，計(jì)算比活力進(jìn) 行合并收集；
[0038] (3 ·5)樣品除雜
[0039] 采用聽(tīng)11丨口〇代4111；[00]/1]11:抑31(超濾管對(duì)經(jīng)步驟（3.4)凝膠過(guò)濾層析后的活性 組分進(jìn)行除雜濃縮;將活性組分上樣于預(yù)先用去離子水預(yù)處理過(guò)的超濾管中，離心，收集樣 品，凍干，得到精制的方格星蟲(chóng)活性蛋白酶。
[0040] 作為優(yōu)選方案，以上所述的具有抗血栓作用的方格星蟲(chóng)活性蛋白酶的制備方法， 所得方格星蟲(chóng)活性蛋白酶的純度大于95%。
[0041] 本發(fā)明所述的具有抗血栓作用的方格星蟲(chóng)活性蛋白酶具有很好的抗血栓性能，可 用于制備抗血栓藥物。
[0042] 有益效果:本發(fā)明提供的具有抗血栓作用的方格星蟲(chóng)活性蛋白酶和現(xiàn)有技術(shù)相比 具有以下優(yōu)點(diǎn)：
[0043] 本發(fā)明通過(guò)大量試驗(yàn)篩選，首次采用硫酸銨沉淀結(jié)合疏水作用層析、離子交換層 析和凝膠過(guò)濾層析的方法對(duì)活性蛋白酶進(jìn)行分離純化，得到純度高于95%以上的方格星蟲(chóng) 活性蛋白酶。并且本發(fā)明首次采用電泳方法結(jié)合凝膠過(guò)濾色譜法對(duì)活性蛋白酶進(jìn)行純度鑒 定;首次采用基質(zhì)輔助激光解吸附聯(lián)合飛行時(shí)間質(zhì)譜法(MALDI-T0F)對(duì)活性蛋白酶進(jìn)行分 子量測(cè)定;首次采用經(jīng)典的Edman降解法對(duì)活性蛋白酶進(jìn)行N端序列測(cè)定。并且首次采用纖 維蛋白平板法的體外評(píng)價(jià)方法和FeC13誘導(dǎo)的大鼠動(dòng)脈血栓模型的體內(nèi)評(píng)價(jià)方法對(duì)活性蛋 白酶進(jìn)行活性評(píng)價(jià)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明制備得到的方格星蟲(chóng)活性蛋白酶具有很好的抗 血栓性能，可用于制備抗血栓藥物。
[0044] 本發(fā)明制備工藝設(shè)計(jì)合理，可操作性強(qiáng)，為方格星蟲(chóng)開(kāi)發(fā)新的臨床用途，具有很好 的應(yīng)用前景。
【具體實(shí)施方式】
[0045] 下面結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步闡明本發(fā)明，應(yīng)理解這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而 不用于限制本發(fā)明的范圍，在閱讀了本發(fā)明之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員對(duì)本發(fā)明的各種等價(jià)形 式的修改均落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求所限定的范圍。
[0046] 實(shí)施例1
[0047] 具有抗血栓作用的方格星蟲(chóng)活性蛋白酶的分離純化
[0048] 1實(shí)驗(yàn)材料
[0049] 1.1儀器
[0050] GE A K TAimPure,GE XK 26/20 Column,GE XK 16/100 Column(GE Healthcare, MA，USA);Bio_rad Mini Protein 3 Cell小型垂直電泳系統(tǒng)，Bio-rad ChemiDoc XRS+凝膠 成像分析系統(tǒng)（Bio-rad，CA,USA) ;Waters Alliance 2695型高效液相系統(tǒng)，Waters 2996型 PDA檢測(cè)器（Waters,MA,USA) ;AB SCIEX 5800 MALDI-T0F/T0F?質(zhì)譜系統(tǒng)（AB SCIEX,ΜΑ, USA) ;PE Enspire型多功能酶標(biāo)儀(Perkin Elmer,MA,USA) ;PPSQ-33A全自動(dòng)蛋白質(zhì)多肽測(cè) 序儀（SHIMADZU, Japan) ;Bio_rad Mini Protein 3 Cell小型垂直電泳系統(tǒng)，Bio-rad ChemiDoc XRS+凝膠成像分析系統(tǒng)（Bio-rad,CA,USA) ;TE 22 mini Tank Transfer Mnit電 轉(zhuǎn)移槽（GE Healthcare,MA,USA) ;LABC0N⑶ FreeZone冷凍干燥機(jī)（LAB⑶NC0，KS，USA); SANYO SM-F140AY65制冰機(jī)（SANYO,Osaka, Japan) ;Millpore-Q Reference超純水系統(tǒng) (Merck Millpore ,MA,USA) ;Beckman CoulterAllegra X-15R高速離心機(jī)（Beckman Coulter ,CA ,USA) ;ML204/MS 105型電子天平（Me tt ler-To Iedo ,Zurich, Switzerland);泰斯 特SPX-150BIII型恒溫培養(yǎng)箱(天津泰斯特儀器有限公司）；超低溫冰箱(青島海爾特種電器 有限公司）。
[0051 ] 1.1.1試劑及試藥
[0052] Phenyl Sepharose? High Performance填料，Q Sepharose? High Performance 填料，Superdex? G-75填料（GE Healthcare，MA,USA) ;T0S0H T活性蛋白酶gel G4000PWxl 凝膠色譜柱（TOSOH, Yamaguchiken, Japan) ;MD44 3500 Da透析袋（北京索萊寶科技有限公 W|)；Thermo Scientific Spectra? Multicolor Broad Range Protein Ladders,Thermo Zeba?脫鹽離心柱，Thermo Scientific Pierce? BCA Protein Assay Kit(Thermo Fisher Scientific，MA，USA) ;Mil I iporeAmiconR Ultra 3K 超濾管，ZipTip C4(Merck Millpore，MA，USA);尿激酶（中國(guó)食品藥品檢定研究院，140604-201224);人纖維蛋白原(江 西博雅生物制藥股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字S20013006);凝血酶，TEMED，SDS(Sigma-Aldrich， CA，USA);瓊脂糖（HydraGene 有限公司，產(chǎn)品批號(hào)：111002025);厶(3巧1311^(16,815-Acrylamide(Amresco,0H,USA)；Ammonium Persulfate(BioLink,Sandnes,Norway)；Tris, Glycine(AfTymetrix，OH，USA) ;CHCA，乙臆，TFA，Proteo Mass Peptide&Protein MALDI-MS Calibration Kit，SA(Sigma-Aldrich，CA，USA);樣品革巴（AB Sciex，MA，USA);Thermo Scientific Spectra?Multicolor Broad Range Protein Ladders(Thermo Fisher Scientific，MA，USA);CAPS bufTer(Sigma-Ald;rich，CA，USA);PVDF膜（GE Healthcare，MA, USA) ;Prosorb，Biobrene Plus(ABI ,USA) ;PTFE濾膜（SHIMADZU, Japan) ;PTH_AminoAcis Mixed，EthyIagetate，PTHAminoAc ids Mobile Phase，Trifluoroacetic acid , Phenylisothiocyanaten-Heptane，Trimethylamine(Wako ,Japan);其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析 純，去離子水經(jīng)MiIIpore-Q Reference超純水系統(tǒng)自制。
[0053] 裸體方格星蟲(chóng)(Sipunculus nudus Linnaeus)樣品由廈門大學(xué)丁少雄教授鑒定并 提供。
[0054] 2實(shí)驗(yàn)方法
[0055] 2.1蛋白濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作
[0056] 米用Thermos Scientific公司的Pierce BCA Protein Assay Kit試劑盒測(cè)定樣 品蛋白濃度。用PBS緩沖液按表1 -I -I對(duì)試劑盒中的BSA儲(chǔ)備液(2mg/mL)進(jìn)行稀釋。
[0057] 表1-1-1 BSA蛋白標(biāo)準(zhǔn)液配制表
[0059] 待標(biāo)準(zhǔn)液和樣品稀釋后，用微量加樣器向96孔板中每孔加25yL不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶 液或樣品稀釋液以及200yL試劑盒工作液(A液:B液=50:1 )，每個(gè)濃度標(biāo)準(zhǔn)液或樣品溶液加 三個(gè)復(fù)孔，將上述溶液加入振蕩均勻后，于37°C恒溫箱中30min，取出，放冷，于562nm波長(zhǎng)處 檢測(cè)吸光度。以BSA蛋白標(biāo)準(zhǔn)液濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)作蛋白濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0060] 2.2酶活力標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作
[0061] 2.2.1纖維蛋白平板的制作
[0062] 參照經(jīng)典纖維蛋白平板制作方法[2]稍作改動(dòng)后取5mL 0.5%纖維蛋白原溶液，向 其中加入ImL含IOIU凝血酶溶液，攪拌均勻后，迅速倒入已加入4mL 2%瓊脂糖溶液的燒杯 中，將以上溶液迅速攪拌均勻后迅速倒入無(wú)菌培養(yǎng)皿(90mm)中，靜置Ih后，4°C保存待用。 [0063] 2.2.2尿激酶標(biāo)準(zhǔn)液的配制
[0064] 取尿激酶（1240IU)用生理鹽水溶解定容至1240IU/mL作為母液，其后用生理鹽水 逐級(jí)稀釋，得到620.00IU/mL、310.00IU/mL、155.00IU/mL、77.50IU/mL、38.75IU/mL、 19.38IU/mL、9.69IU/mL 共 7 個(gè)濃度，4°C保存待用。
[0065] 2.2.3酶活力標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作
[0066]待加樣前，用自制打孔器在已制成的纖維蛋白平板上平均打14個(gè)直徑為3mm的孔， 依次用自動(dòng)加樣器加各濃度尿激酶i〇yL，每個(gè)濃度加兩個(gè)復(fù)孔。將加樣后的纖維平板加蓋 倒置于37°C恒溫培養(yǎng)箱中保溫18h后，取出，用游標(biāo)卡尺測(cè)量所形成溶圈相互垂直的兩條直 徑。以尿激酶含量為橫坐標(biāo)，溶圈兩垂直直徑乘積(R1 XR2)的自然對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)制作酶活 力標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0067] 2.3活性蛋白酶的分離純化
[0068] 2.3.1活性蛋白酶粗水提物的制備
[0069] 取新鮮方格星蟲(chóng)，用PBS緩沖液沖洗兩遍洗去雜質(zhì)和泥沙，再用吸水紙吸去表面多 余水分，稱重，得生藥量。用洗凈滅菌的手術(shù)剪解剖星蟲(chóng)，除去體內(nèi)泥沙。將其剪碎并且勻漿 (1000r/min，30s)后加入兩倍的PBS緩沖液，攪拌均勾，于-20°C中冷凍12h后再置于4°C解 凍。其后離心(5000r/min，IOmin，4°C)，取上清液，沉淀部分加入兩倍的PBS緩沖液繼續(xù)重復(fù) 上述步驟。合并兩次上清液后測(cè)定其蛋白濃度和纖溶活性，計(jì)算比活力。將上清液進(jìn)行冷凍 干燥，-20 °C保存?zhèn)溆谩?br>[0070] 2.3.2活性蛋白酶水提物的粗分離
[0071 ] 2.3.2.1硫酸銨沉淀區(qū)間的確定及星蟲(chóng)水提物硫酸銨沉淀
[0072]取7份活性蛋白酶水提液，每份50mL，向其中分別一邊攪拌一邊加入一定量的經(jīng)研 磨過(guò)的硫酸銨固體粉末至10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%的百分飽和度，混勻后于 〇°C孵育30min。取上述7份鹽析液進(jìn)行離心(8000r/min，30min，4°C)取上清，再向7份上清液 中繼續(xù)加入一定量的硫酸銨固體粉末至20 %、30 %、40 %、50 %、60 %、70 %、80 %的百分飽 和度，混勻后于〇°C孵育30min。再將7份鹽析液離心（8000r/min，30min，4°C)后得到10%- 20%、20%-30%、30%-40%、40%-50%、50%-60%、60%-70%、70%-80%共7個(gè)沉淀區(qū)間 的活性蛋白酶蛋白沉淀。將7份沉淀蛋白分別透析除鹽后加入相同量的PBS后用纖維平板法 測(cè)定各個(gè)沉淀區(qū)間蛋白纖溶活性。
[0073] 根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)確定活性蛋白酶的最佳沉淀區(qū)間進(jìn)行活性蛋白酶的粗分離并收集 沉淀繼續(xù)進(jìn)行后續(xù)步驟。
[0074] 2.3.2.2活性蛋白酶沉淀的透析脫鹽除雜
[0075] 將經(jīng)硫酸銨沉淀得到的活性蛋白酶沉淀用少量PBS緩沖液進(jìn)行復(fù)溶后加入截留分 子量大于3500D的透析袋中，在4°C儲(chǔ)存柜中用PBS緩沖液磁力攪拌透析48h，凍干，-20°C保 存?zhèn)溆谩?br>[0076] 2.3.3活性蛋白酶的精制
[0077] 采用美國(guó)GE公司的Al<TA'?Pure蛋白純化系統(tǒng)對(duì)活性蛋白酶進(jìn)行精制。
[0078] 2 · 3 · 3 · I Phenyl Sepharose High Performance疏水作用層析
[0079] 樣品處理
[0080] 用lmoL/L(NH4)2S〇4溶液將活性蛋白酶粗品溶解，離心（8000r/min，30min，4°C )并 通過(guò)0.45μηι水膜過(guò)濾除雜后備用。
[0081 ]上樣洗脫
[0082] 按柱體積（26mm X 170mm)的2 %約上樣2mL。流動(dòng)相:A (PBS緩沖液）和B (用PBS緩沖 液溶解的lmoL/L(NH4)2S〇4溶液），梯度洗脫：100%B，3CV;100%-60%B，0.5CV;60%B， 0.75CV；60%-40%B,0.25CV；40%B,0.75CV；40%-20%B,0.25CV；20%B,0.75CV；20%-0B, 0.25CV; 100%A，2CV。流速:3mL/min;紫外檢測(cè)波長(zhǎng):280nm。以9mL/管進(jìn)行收集，測(cè)定每管蛋 白濃度和酶活力，計(jì)算比活力，合并收集。
[0083]活性蛋白酶活性組分的透析脫鹽除雜
[0084] 將經(jīng)疏水作用層析收集得到的活性蛋白酶活性組分用少量PBS緩沖液進(jìn)行復(fù)溶后 加入截留分子量大于3500Da的透析袋中，在4°C儲(chǔ)存柜中用PBS緩沖液磁力攪拌透析48h，凍 干，-20 °C保存?zhèn)溆谩?br>[0085] 2.3.3.2 Q Sepharose High Performance離子交換層析 [0086]樣品處理
[0087]用PBS緩沖液將上步驟得到的活性蛋白酶活性組分溶解，離心(8000r/min，30min， 4°C)并通過(guò)0.45μπι水膜過(guò)濾除雜后備用。
[0088] 上樣洗脫
[0089] 按柱體積（26mm X 180mm)的2 %約上樣2mL。流動(dòng)相:A (PBS緩沖液）和B (用I3BS緩沖 液溶解的〇 · 8moL/L NaCl溶液），梯度洗脫：100%八，2(^;0-20%8,0.25(^;20%8,2(^ ;20%-30%B,0.25CV；30%BaCV；30%-50%B,0.25CV；50%BaCV；50%-70%B,0.25CV；70%B, 0.75CV ;70%-100%B，0.25CV;100%，2CV。流速：3mL/min;紫外檢測(cè)波長(zhǎng)：280nm。以9mL/管 進(jìn)行收集，測(cè)定每管蛋白濃度和酶活力，計(jì)算比活力進(jìn)行合并收集。
[0090] 樣品脫鹽除雜
[0091 ] 采用Thermo Zeba脫鹽離心柱對(duì)經(jīng)離子交換層析收集得到的活性組分進(jìn)行脫鹽處 理。將活性組分上樣于預(yù)先根據(jù)說(shuō)明書(shū)預(yù)處理過(guò)的脫鹽離心柱中，離心（l〇〇〇Xg，2min)，收 集樣品。
[0092] 采用Millipore Amicon Ultra 3K超濾管對(duì)經(jīng)離子交換層析并脫鹽的活性組分進(jìn) 行除雜濃縮。將脫鹽后的活性組分上樣于預(yù)先用去離子水預(yù)處理過(guò)的超濾管中，離心(5000 Xg，60min)，收集樣品，凍干，-20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0093] 2.3.3.3 Superdex prep grade G-75凝膠過(guò)濾層析
[0094]樣品處理：
[0095]用PBS緩沖液將上步驟得到的活性蛋白酶活性組分溶解，離心(8000r/min，30min， 4°C)并通過(guò)0.45μπι水膜過(guò)濾除雜后備用。
[0096]上樣洗脫：
[0097] 按柱體積（16mm X 500mm)的2 %約上樣2mL。流動(dòng)相:PBS緩沖液;洗脫方式:5CV等度 洗脫;流速:〇. 8mL/min;紫外檢測(cè)波長(zhǎng):280nm。以9mL/管進(jìn)行收集，測(cè)定每管蛋白濃度和酶 活力，計(jì)算比活力進(jìn)行合并收集。
[0098] 樣品除雜
[00"] 采用MilliporeAmiconR Ultra 3K超濾管對(duì)經(jīng)凝膠柱層析的活性組分進(jìn)行除雜濃 縮。將活性組分上樣于預(yù)先用去離子水預(yù)處理過(guò)的超濾管中，離心(5000Xg，60min)，收集 樣品，凍干，-20 °C保存?zhèn)溆谩?br>[0100] 2.4活性蛋白酶的純度鑒定、分子量測(cè)定及N端氨基酸序列測(cè)定
[0101] 2.4.1活性蛋白酶的純度鑒定
[0102] 2.4.1.1 Native-PAGE 和 SDS-PAGE 相結(jié)合進(jìn)行純度鑒定
[0103] 電泳方法參照經(jīng)典的L a e mm I i方法[3 ]稍作改動(dòng)，采用15 %的分離膠和5 %的基層 膠。
[0104] 相關(guān)溶液的配制
[0105] (1 )30 % (W/V)Acrylamide:稱取290gAcrylamide和IOg BIS，加入約600mL去離子 水，充分?jǐn)嚢枞芙夂蠹尤ルx子水定容至1L，用0.45μπι濾器濾去雜質(zhì)，并于棕色瓶中4°C保存。
[0106] (2)1 ·5Μ Tirs-HCl，pH 8.8溶液：稱取 18.21g Tris base，加入約80mL去離子水， 用HCl調(diào)節(jié)pH值至8.8，加去離子水定容至10〇11^，4°(：保存。
[0107] (3)1 .OM Tris-HCl，pH 6.8溶液：稱取 12. IOg Tris base，加入約80mL去離子水， 用HCl調(diào)節(jié)pH值至6.8，加去離子水定容至10〇11^，4°(：保存。
[0108] (4) 10%SDS溶液:稱取IOg SDS，加入約90mL去離子水，攪拌均勻，加熱溶解，再加 入去離子水定容至IOOmL，室溫保存。
[0109] (5) 10%APS溶液:稱取Ig APS，加入約8mL去離子水，震蕩溶解均勻，加入去離子水 定容至IOmL，現(xiàn)配現(xiàn)用。
[0110] (6)10X 電極緩沖液，pH 8.3:稱取30.3g Tris base、144g甘氨酸和IOg SDS，加入 約800mL去離子水溶解，攪拌均勻，用去離子水定容至1000 mL，4°C保存。
[0111] (7)SDS-PAGE5X樣品溶解液：取25mg溴酚藍(lán)和0·5gSDS溶液，向其中加入2·5mL 甘油和1.25mL Tris-HCl(ΙΜ,ρΗ 6.8)，將其混合均勻，用去離子水定容至5mL。分裝成500μ L/份，后-20°C保存使用前將25yL的β-巰基乙醇加入每一小份中。
[0112] (8)Native-PAGE 5Χ樣品溶解液：取25mg溴酚藍(lán)，向其中加入2.5mL甘油和 1.25mLTris-HCl (IM，pH 6.8)，將其混合均勻，用去離子水定容至5mL。分裝成500yL/份，-20 °C保存使用。
[0113] (9)0.1%考馬斯亮藍(lán)染液：取0.58考馬斯亮藍(lán)1?250，向其中加入5011^冰醋酸和 200mL甲醇，攪拌均勾后，用去離子水定容至500mL，用0.45μηι濾器濾去雜質(zhì)，并于棕色瓶中 室溫保存。
[0114] (10)考馬斯亮藍(lán)脫色液:250mL無(wú)水乙醇、60mL冰醋酸和0.5mL甲醛混合均勻，用去 離子水定容至500mL，室溫保存。
[0115] 凝膠電泳分離膠和積層膠的配制
[0116] 依據(jù)表1-1-2配制SDS-PAGE和Native-PAGE的分離膠和積層膠，分別將分離膠和積 層膠均一次性注入模具中，插上5mm的10孔梳子。
[0117] 表1-1-2聚丙烯酰胺凝膠電泳分離膠和積層膠的配制
[0119]加樣和跑膠：
[0120] 將一定量的樣品分別與SDS-PAGE 5 X樣品溶解液和Native-PAGE 5 X樣品溶解液 進(jìn)行混合，于98 °C加熱15min ,Marker也與適量樣品溶解液進(jìn)行混合。再向內(nèi)外槽中各加入 一定量的IX電極緩沖液后分別將樣品和Marker加入樣品孔道中。待各步驟就緒，接通電 源，先將電壓調(diào)至80V，待樣品開(kāi)始進(jìn)入分離膠時(shí)，將電壓升至100V，恒壓跑至分離膠前沿至 底部約0.5cm時(shí)，關(guān)閉電源。
[0121] 染色和脫色
[0122] 將凝膠小心取出，放入一表面皿中，加入0.1 %考馬斯亮藍(lán)染液后蓋上蓋置于搖床 上避光染色4h。將染液回收后，向其中加入脫色液脫色直至背景干凈。
[0123] 2.4.1.2凝膠過(guò)濾色譜法純度鑒定
[0124] 采用Waters 2695型高效液相色譜儀串聯(lián)Waters 2996型HM檢測(cè)器，T活性蛋白酶 gel G4000PWxl凝膠色譜柱(7.8mm I.D. X30cm，10ym)，流動(dòng)相:去離子水;洗脫方式:等度洗 脫；流速：0.5mL/min;柱溫：37°C。用去離子水將活性蛋白酶溶解成2mg/mL的溶液并通過(guò) 0.45μηι水膜過(guò)濾除雜后上樣10yL。
[0125] 2.4.2活性蛋白酶的分子量測(cè)定
[0126] 采用美國(guó)AB Sciex公司的AB Sciex 5800 MALDI-T0F/T0F?對(duì)活性蛋白酶相對(duì)分 子量進(jìn)行測(cè)定。
[0127] 取IyL活性蛋白酶樣品點(diǎn)至樣品靶（384 Opti-TOF 123mmX81mm)上，自然干燥后， 再取0.6yL SA基質(zhì)溶液點(diǎn)至對(duì)應(yīng)靶位上并自然干燥，用相同方法在樣品靶位相鄰位置點(diǎn)標(biāo) 準(zhǔn)品。采用校準(zhǔn)范圍為39212±100和66430±100的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行校準(zhǔn)測(cè)試。檢測(cè)條件:脈沖 激光波長(zhǎng)：355nm;離子模式：正離子模式下線性方法測(cè)試樣品分子量；由4000 Series Explorer V 3.5軟件導(dǎo)出原始數(shù)據(jù)及圖譜。
[0128] 2.4.3活性蛋白酶的N端序列測(cè)定
[0129] 本實(shí)驗(yàn)中采用了經(jīng)典的Edman降解法對(duì)活性蛋白酶的N端序列進(jìn)行測(cè)定。
[0130] 2 · 4 · 3 · I SDS-PAGE凝膠電泳
[0131] 2.4.3.2 轉(zhuǎn)膜
[0132] 準(zhǔn)備PVDF膜，剪成和凝膠一致的大小，在100%甲醇中均勻潤(rùn)濕約5min。將凝膠置 于也在轉(zhuǎn)移緩沖液中浸過(guò)的厚濾紙上，然后將PVDF膜覆于凝膠上，再蓋上一張浸濕的厚濾 紙(避免在每一層間留有氣泡），適當(dāng)用手按壓以便排出空氣使其充滿液體，最后將它們一 起夾入轉(zhuǎn)印夾，放入轉(zhuǎn)印槽中。加入大約IL轉(zhuǎn)移緩沖液，打開(kāi)外循環(huán)制冷，打開(kāi)電轉(zhuǎn)移槽下 的磁力攪拌儀。打開(kāi)電源，250mA濕轉(zhuǎn)通電90min后，取出轉(zhuǎn)印夾，取下PVDF膜用立春紅染液 染色，再用純化水漂洗至背景沒(méi)有紅色條帶清晰。
[0133] 2.4.3.3蛋白質(zhì)N端測(cè)序
[0134] 組裝好反應(yīng)器，將PVDF膜中的待測(cè)樣品剪下，放置到反應(yīng)器中置于儀器固定位置， 儀器設(shè)置完成后開(kāi)始測(cè)試。
[0135] 2.4.3.4 數(shù)據(jù)處理
[0136] PPSQ-33A產(chǎn)生的原始數(shù)據(jù)及圖譜由PPSQ-30DataProcessing軟件識(shí)別標(biāo)峰并導(dǎo) 出。
[0137] 3實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0138] 3.1蛋白含量標(biāo)準(zhǔn)曲線
[0139] 依據(jù)試劑盒說(shuō)明測(cè)得9個(gè)濃度蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度值，見(jiàn)表1-1-3。以標(biāo)準(zhǔn)溶液 濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制蛋白蛋白濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線。其標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y = 0.0012X+0.1681，R2 = 0.9929。
[0140] 表1-1-3蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液測(cè)定值
[0142] 3.2酶活力標(biāo)準(zhǔn)曲線
[0143] 采用纖維蛋白平板法測(cè)得7個(gè)濃度尿激酶標(biāo)準(zhǔn)液的溶圈直徑，見(jiàn)表1-1-4。以尿激 酶標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，溶圈兩垂直直徑乘積(R1 X R2)的自然對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)，繪制酶活 力標(biāo)準(zhǔn)曲線。其標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y = 0 · 0024X+0 · 4124，R2 = 0 · 9952。
[0144] 表1-1-4尿激酶標(biāo)準(zhǔn)溶液活力測(cè)定倌 L0146」3.3沽性蛍臼_ (沽性蛍臼_)的分
離純化
[0147] 3.3.1活性蛋白酶粗水提物的粗分離
[0148] 根據(jù)設(shè)定的7個(gè)硫酸銨沉淀區(qū)間得到7份沉淀蛋白，將7份沉淀蛋白配成溶液，分別 加入自制的纖維蛋白平板中測(cè)定其纖維活性，結(jié)果表明，在10%_20%和20%-30%區(qū)間，沉 淀蛋白纖溶活性很弱，在30 % -40 %，40 % -50 %和50 % -60 %區(qū)間，沉淀蛋白的纖溶活性均 很強(qiáng)，在60%-70%和70%-80%區(qū)間，沉淀蛋白纖溶活性也很弱。上述結(jié)果表明活性蛋白酶 在硫酸銨30 %飽和度時(shí)開(kāi)始大量沉淀，一直到硫酸銨60 %飽和度時(shí)基本沉淀完全。根據(jù)以 上結(jié)果，選擇30%_60%的沉淀區(qū)間對(duì)星蟲(chóng)水提物進(jìn)行鹽析，可以最大限度地對(duì)具有纖溶活 性的活性蛋白酶進(jìn)行粗分離。
[0149] 根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)確定活性蛋白酶的最佳沉淀區(qū)間向星蟲(chóng)水提液中一邊攪拌一邊加 入一定量硫酸銨固體粉末至30 %的百分飽和度，混勻后于0 °C孵育30min，離心(8000r/min， 30min，4°C )取上清，繼續(xù)向其中加入一定量的硫酸銨固體粉末至60 %的百分飽和度，離心 (8000r/min，30min，4°C)，收集沉淀。將沉淀用截留分子量大于3500D的透析袋低溫透析除 鹽除雜后凍干進(jìn)行下一步精制。
[0150] 3.3.2活性蛋白酶的精制
[0151] 3 · 3 · 2 · I Phenyl Sepharose High Performance疏水作用層析
[0152] 利用Phenyl Sepharose High Performance疏水作用層析，將粗酶樣品根據(jù)蛋白 的疏水性由高到低進(jìn)行第一步精制。將經(jīng)疏水作用層析后的流出液進(jìn)行收集，9mL-管，逐 管檢測(cè)纖溶活性，合并纖溶活性高流份。用截留分子量大于3500D的透析袋低溫透析除鹽除 雜后凍干進(jìn)行下一步精制。
[0153] 3.3.2.2 Q Sepharose High Performance陰離子交換層析
[0154] 利用Q Sepharose High Performance陰離子交換層析，將經(jīng)上一步層析后收集到 的活性組分根據(jù)不同離子強(qiáng)度下與填料基團(tuán)的結(jié)合能力將其進(jìn)一步分離精制。收集經(jīng)離子 交換層析作用后的流出液，9mL-管，逐管檢測(cè)纖溶活性，合并纖溶活性較強(qiáng)流份。分別采用 Thermo Zeba脫鹽離心柱脫鹽和MilliporeAmicon Ultra 3000D超濾管除去小分子雜質(zhì)并 濃縮，凍干繼續(xù)進(jìn)行下一步精制。
[0155] 3.3.2.3 Superdex prep grade G-75凝膠過(guò)濾層析
[0156] 利用Superdex prep grade G-75凝膠過(guò)濾層析，將經(jīng)上一步層析后收集到的活性 組分基于分子量大小進(jìn)行分離。收集層析作用后的流出液，9mL-管，逐管檢測(cè)纖溶活性，收 集纖溶活性較強(qiáng)流份。并采用Millipore Amicon Ultra 3K超濾管進(jìn)一步除去小分子雜質(zhì) 并濃縮蛋白，凍干，-20 °C保存?zhèn)溆谩?br>[0157] 活性蛋白酶分離純化結(jié)果
[0158] 本發(fā)明中分別考慮樣品量、樣品純度等因素后分別選擇了不同原理的硫酸銨分級(jí) 沉淀法、疏水作用層析法、離子交換層析法和凝膠過(guò)濾層析法結(jié)合透析、超濾等方法從多角 度進(jìn)行活性蛋白酶提取、分離和純化。將每步驟后的樣品根據(jù)纖維蛋白平板活性測(cè)定結(jié)果 進(jìn)行合并、除鹽、除雜和濃縮，并測(cè)定每一步驟過(guò)后的樣品總蛋白含量和總酶活力，并計(jì)算 酶比活力，總得率和純度，得到結(jié)果見(jiàn)表1-1-5。與此同時(shí)，為了更直觀體現(xiàn)出經(jīng)過(guò)提取、硫 酸銨沉淀、疏水作用層析、離子交換層析和凝膠過(guò)濾層析后活性蛋白酶的純度情況，本發(fā)明 還采用了 SDS-PAGE法對(duì)上述每一步驟后的樣品進(jìn)行凝膠電泳分離。
[0159] 表1-1-5活性蛋白酶分離純化結(jié)果
[0161] 3.4活性蛋白酶的純度鑒定和分子量測(cè)定。
[0162] 3.4.1活性蛋白酶的純度鑒定
[0163] 采用15%的分離膠和5%的積層膠分別在還原和非還原下對(duì)分離得到的活性蛋白 酶進(jìn)行純度鑒定。經(jīng)過(guò)多步分離純化后的活性蛋白酶在還原和非還原的聚丙烯酰胺凝膠電 泳下均只有單條帶，說(shuō)明制備出的活性蛋白酶的純度達(dá)到了電泳純。采用凝膠過(guò)濾色譜法 對(duì)活性蛋白酶進(jìn)行純度鑒定，結(jié)果顯示在20min處出現(xiàn)一個(gè)單一峰，純度達(dá)95 %以上。
[0164] 3.4.2活性蛋白酶的分子量測(cè)定
[0165] 為保證供試品相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)試的準(zhǔn)確性，在測(cè)試供試品相對(duì)分子質(zhì)量之前，通 過(guò)測(cè)試標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)樣品靶進(jìn)行校準(zhǔn)。標(biāo)準(zhǔn)品校準(zhǔn)測(cè)試通過(guò)后，進(jìn)行活性蛋白酶相對(duì)分子質(zhì)量 測(cè)試，測(cè)試結(jié)果顯示活性蛋白酶相對(duì)分子質(zhì)量為28003.67D。
[0166] 3.4.3活性蛋白酶的N端氨基酸序列測(cè)定
[0167] 轉(zhuǎn)膜結(jié)束的PVDF膜經(jīng)麗春紅染色后，用去離子水漂洗至背景清晰，目的條帶顯 著。。利用含19種PTH氨基酸的混合標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)儀器進(jìn)行校準(zhǔn)后，對(duì)活性蛋白酶進(jìn)行了 15個(gè)循 環(huán)的N端測(cè)序，得到活性蛋白酶的N端序列為NH2-Pr〇-Phe-Pr〇-Val-Pr〇-Asp-Pr〇-Phe_Val-Trp-Asp-Thr-Ser-Phe-Gln 0
[0168] 實(shí)施例2活性蛋白酶活性測(cè)試
[0169] 1實(shí)驗(yàn)材料
[0170] 1.1儀器
[0171] 泰斯特SPX-150BIII型恒溫培養(yǎng)箱（天津泰斯特儀器有限公司）；Millp〇re-Q Reference超純水系統(tǒng)（Merck Millpore,MA,USA) ;ML204/MS105型電子天平（]\^?16『-Toledo,Zurich,Switzerland);超低溫冰箱(青島海爾特種電器有限公司）；游標(biāo)卡尺(上海 海凌量具有限公司）。
[0172] 1.2試劑及試藥
[0173] 尿激酶（中國(guó)食品藥品檢定研究院，140604-201224);人纖維蛋白原（江西博雅生 物制藥股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字S20013006);凝血酶，TEMED，SDS(Sigma-Aldrich，CA，USA); 瓊脂糖(HydraGene有限公司，產(chǎn)品批號(hào)：111002025);三氯化鐵（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公 司）；無(wú)菌注射用水（上海信誼金珠藥業(yè)有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字：H31022048);二磷酸腺苷 (ADP )、凝血酶原時(shí)間（PT )、活化部分凝血激酶時(shí)間（APTT )、凝血酶時(shí)間（TT)和纖維蛋白原 含量卬18)試劑盒購(gòu)自北京世帝科學(xué)儀器公司；1乂82、？41-1、？1^、丨?4、061^41'1、？0?、6-ket〇-PGFI2和PGI2Elisa試劑盒購(gòu)自上海酶聯(lián)生物技術(shù)有限公司；其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析 純，去離子水經(jīng)MiIlpore-Q Reference超純水系統(tǒng)自制。方格星蟲(chóng)活性蛋白酶(活性蛋白 酶，自制）。
[0174] 2實(shí)驗(yàn)方法
[0175] 2.1活性蛋白酶對(duì)纖維蛋白平作用量效關(guān)系
[0176] 溶液的配制：活性蛋白酶溶液的配制:稱取IOOmg實(shí)施例1制備得到的方格星蟲(chóng)活 性蛋白酶，用ImL PBS緩沖液溶解，然后用PBS緩沖液逐級(jí)稀釋，得到100 · 00mg/mL、50 · OOmg/ mL、25·00mg/mL、12·50mg/mL、6·25mg/mL 5個(gè)濃度，4°C保存待用。
[0177] 實(shí)驗(yàn)步驟:用自制打孔器在已制成的纖維蛋白平板上打直徑為3mm的孔，將實(shí)施例 1制備得到的活性蛋白酶配制溶液分別加入自制纖維平板中。將加樣后的纖維平板加蓋后 置于37°C恒溫培養(yǎng)箱中保溫18h，取出，用游標(biāo)卡尺測(cè)量所形成溶圈相互垂直的兩條直徑， 計(jì)算乘積(R1 XR2)研究不同濃度活性蛋白酶溶解纖維蛋白平板量效關(guān)系。
[0178] 2.2活性蛋白酶對(duì)FeCl3誘導(dǎo)的大鼠動(dòng)脈血栓形成的影響
[0179] 2.2.1分組、給藥與造模
[0180] 大鼠48只，隨機(jī)平均分為空白組（C)、動(dòng)脈血栓模型組（M)、尿激酶給藥組（UK， 40000IU/kg)、實(shí)施例1方格星蟲(chóng)活性蛋白酶高劑量組(活性蛋白酶H，100mg/kg)、方格星蟲(chóng) 活性蛋白酶中劑量組(活性蛋白酶M，50mg/kg)和方格星蟲(chóng)活性蛋白酶低劑量組(活性蛋白 酶L，10mg/kg)。用無(wú)菌注射用水作溶媒，連續(xù)7天尾靜脈注射給藥，假手術(shù)組和模型組注射 等量無(wú)菌注射用水。第七天給藥半小時(shí)后用10%水合氯醛麻醉后固定，分離大鼠右側(cè)頸總 動(dòng)脈，用浸有50yL IO^FeCl3溶液的無(wú)菌濾紙（ImmX 2mm)覆蓋在右側(cè)頸總動(dòng)脈上，假手術(shù) 組將浸有50yL無(wú)菌生理鹽水的濾紙覆蓋在大鼠右側(cè)頸總動(dòng)脈上。計(jì)時(shí)3min，將濾紙取下，用 浸有無(wú)菌生理鹽水的無(wú)菌紗布覆蓋傷口 20min。
[0181] 2.2.2血漿指標(biāo)的檢測(cè)
[0182] 觀察血栓形成后，大鼠腹主動(dòng)脈取血8mL，其中6mL以枸櫞酸鈉(3.8%)1:9抗凝，另 外2mL以EDTA(1.5 % ) 1:9抗凝，靜置。先將以枸櫞酸鈉(3.8 % ) 1:9抗凝的全血以800r/min離 心IOmin取上層富血小板血漿，采用血小板聚集凝血因子分析儀按照試劑盒說(shuō)明測(cè)定ADP誘 導(dǎo)的血小板聚集率。其后繼續(xù)以3000r/min離心10min取血衆(zhòng)，采用血小板聚集凝血因子分 析儀按照試劑盒說(shuō)明測(cè)定凝血四項(xiàng)指標(biāo)(APTT、TT、PT和FIB)。
[0183] 將以枸櫞酸鈉(3.8 % ) 1:9抗凝的全血以3000r/min離心10min的得到的各組血漿 按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行TXB2、PAI-1、PLG和tPA的含量的測(cè)定。將以EDTA(1.5%)1:9抗凝的各 組血漿按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行061^411、？0?、6-1?^〇^^^12和?612的含量的測(cè)定。
[0184] 2.2.3大鼠動(dòng)脈血栓質(zhì)量的測(cè)定及動(dòng)脈血栓組織形態(tài)學(xué)觀察
[0185] 大鼠取血完成后，采用用游標(biāo)卡尺測(cè)量，迅速剪下每組大鼠右側(cè)動(dòng)脈血栓造模段 和左側(cè)動(dòng)脈對(duì)應(yīng)位置的動(dòng)脈段，迅速稱重，計(jì)算栓重。
[0186] 栓重=右側(cè)頸總動(dòng)脈血栓造模段-左側(cè)頸總動(dòng)脈對(duì)應(yīng)位置的動(dòng)脈。
[0187] 將各組稱重后的血栓段永10%福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋，切片厚4_5μπι，ΗΕ染 色，病理專業(yè)人員閱片。
[0188] 3實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0189] 3.1活性蛋白酶對(duì)纖維蛋白作用量效關(guān)系
[0190] 表1-1-6顯示，設(shè)定的活性蛋白酶的溶液濃度范圍為6.25-100.00mg/mL，各設(shè)定濃 度溶液在纖維蛋白平板上所形成的溶圈大小兩相互垂直直徑的乘積范圍為1.55-2.44cm2。 由此得出的結(jié)論為在一定劑量范圍內(nèi)，活性蛋白酶溶液溶解纖維蛋白平板所形成的溶圈大 小與其劑量存在一定的量效關(guān)系。
[0191] 表1-1-6不同濃度活性蛋白酶溶解纖維蛋白平板活力情況
[0193] 3.2活性蛋白酶對(duì)FeCl3誘導(dǎo)的大鼠動(dòng)脈血栓形成的影響
[0194] 3.2.1活性蛋白酶對(duì)動(dòng)脈血栓模型大鼠血栓質(zhì)量的影響
[0195] 表1-1-7顯示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠的血栓質(zhì)量顯著性減少，差異有統(tǒng)計(jì) 學(xué)意義（P〈0.01)，表明模型成功；與模型組比較，尿激酶組的血栓質(zhì)量顯著性減少，（P〈 0.01)，活性蛋白酶的低、中、高劑量組也均明顯減少(p〈0.01)，且隨劑量增加，對(duì)血栓質(zhì)量 的減小作用增加。結(jié)果提示，本發(fā)明制備得到的活性蛋白酶對(duì)抑制動(dòng)脈血栓模型大鼠血栓 的形成具有顯著作用，并且在一定劑量范圍內(nèi)，隨劑量增加，作用遞增。
[0196] 表1-1-7活性蛋白酶對(duì)動(dòng)脈血栓模型大鼠血栓質(zhì)量的影響（I ± s_，n = 8)
[0199] 注：與正常組比較，*P〈〇 · 05廣P〈0 · 01;與模型組比較，#P〈0 · 05，##P〈0 · 01。乍〈 0.05,**P<0.01 vs Control group；#P<0.05,##P<0.01 vs Model group.
[0200] 3.2.2活性蛋白酶對(duì)動(dòng)脈血栓模型大鼠凝血四項(xiàng)和血小板聚集的影響
[0201] 表1-1-8顯示，與假手術(shù)組相比，模型組的凝血四項(xiàng)指標(biāo)和血小板聚集率均有顯著 差異，其中APTT、PT、TT和ADP四個(gè)指標(biāo)均顯著降低，F(xiàn)IB含量顯著升高(P〈0.01);與模型組相 比，尿激酶組的凝血四項(xiàng)和ADP均有顯著改善(P〈0.05或P〈0.01 )，本發(fā)明活性蛋白酶的低、 中、高劑量組的凝血四項(xiàng)和ADP也均有顯著改善(P〈0.05或P〈0.01)，且隨劑量增加，改善作 用逐漸增強(qiáng)。以上結(jié)果提示，本發(fā)明制備得到的活性蛋白酶對(duì)動(dòng)脈血栓模型大鼠的凝血四 項(xiàng)和血小板聚集率均有顯著改善，并且在一定劑量范圍內(nèi)，隨劑量增加，作用增強(qiáng)。
[0202]表1-1-8活性蛋白酶對(duì)動(dòng)脈血栓模型大鼠凝血四項(xiàng)和血小板聚集的影響（7 ± s, n = 8)
[0204] 注：與正常組比較，*p〈〇 . 〇5廣P〈0.01;與模型組比較，#P〈0.05，##P〈0.01。乍〈 0.05,**P<0.01 vs Control group；#P<0.05,##P<0.01 vs Model group.
[0205] 3 · 2 · 3活性蛋白酶對(duì)動(dòng)脈血栓模型大鼠血漿TXB2、PAI-1、PLG、tPA、CGRP、ETl、FDP、 6-ket〇-PGFI2和PGI2含量的影響。
[0206] 表1-1-9顯示，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠血漿TXB2、PAI-1、PLG和tPA的含量均 有顯著差異，其中TXB2和PAI-I的含量均顯著升高，PLG和tPA的含量均顯著降低(P〈0.01); 與模型組相比，尿激酶組的TXB2、PAI-1、PLG和tPA四項(xiàng)指標(biāo)均有顯著改善斤〈0.01)，本發(fā)明 活性蛋白酶的低、中、高劑量組的TXB2、PAI-1、PLG和tPA四項(xiàng)指標(biāo)也均有顯著改善(P〈0.05 或P〈〇.01)，且隨劑量增加，改善作用逐漸增強(qiáng)。以上結(jié)果提示，活性蛋白酶對(duì)動(dòng)脈血栓模型 大鼠血漿中TXB2、PAI-1、PLG和tPA均有顯著改善，并且在一定劑量范圍內(nèi)，隨劑量增加，改 善作用增強(qiáng)。
[0207] 表1-1-10顯示，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠血漿061^41'1、？0?、6-1?^〇-?6?12和 PGI2的含量均有顯著差異，其中ΕΤ1、Π )Ρ和6-ket0-PGFI2的含量均顯著升高，CGRP和PGI2的 含量均顯著降低(？〈0.01);與模型組相比，尿激酶組的061^41'1^0?、6-1?^〇-?6?12和?612 五項(xiàng)指標(biāo)均有顯著改善(P〈〇.01)，本發(fā)明提供的活性蛋白酶的低、中、高劑量組的CGRP、 ETl、n)P、6-ket〇-PGFI2和PGI2五項(xiàng)指標(biāo)也均有顯著改善（P〈0.05或P〈0.01)，且隨劑量增 加，改善作用逐漸增強(qiáng)。以上結(jié)果提示，活性蛋白酶對(duì)動(dòng)脈血栓模型大鼠血漿中CGRP、ET1、 FDP、6-ket〇-PGFI2和PGI2均有顯著改善，并且在一定劑量范圍內(nèi)，隨劑量增加，改善作用增 強(qiáng)。
[0208] 表1-1-9活性蛋白酶對(duì)動(dòng)脈血栓模型大鼠血漿TXB2、PAI-1、PLG和tPA含量的影響 (*: 土 m=8)
[0210] 注：與正常組比較，*p〈0.05，**P〈0.01;與模型組比較，#P〈0.05，##P〈0.01。乍〈 0.05,**P<0.01 vs Control group；#P<0.05,##P<0.01 vs Model group.
[0211] 表1-1-10活性蛋白酶對(duì)動(dòng)脈血栓模型大鼠血漿061^41'1小0?、6-1?^〇-?6?12和 PGI2含量的影響（I 土 ·?,η = 8)
[0214] 注：與正常組比較，*Ρ〈〇 . 〇5廣P〈0.01;與模型組比較，#Ρ〈0.05 ,##P〈0.01。，〈 0.05,**P<0.Ol vs Control group；#P<0.05,##P<0.01 vs Model group.
[0215] 3.2.4活性蛋白酶對(duì)動(dòng)脈血栓模型大鼠動(dòng)脈血栓組織形態(tài)學(xué)的影響
[0216] 組織形態(tài)學(xué)結(jié)果表明，假手術(shù)組大鼠動(dòng)脈三層組織結(jié)構(gòu)清晰，內(nèi)膜上皮細(xì)胞無(wú)變 性、壞死、脫落，中膜和外膜未見(jiàn)水腫和炎細(xì)胞浸潤(rùn)等病理變化;模型組大鼠動(dòng)脈外膜嚴(yán)重 損傷，中膜和內(nèi)皮下層明顯增厚，管腔內(nèi)可見(jiàn)明顯緊密的纖維化血栓。尿激酶組大鼠動(dòng)脈外 膜損傷，管腔內(nèi)血栓明顯減少，部分內(nèi)皮完整。本發(fā)明提供的活性蛋白酶的低、中、高劑量組 的大鼠動(dòng)脈管腔中血栓隨劑量遞增逐漸松散并減少，活性蛋白酶高劑量組血栓也看不到明 顯血栓;動(dòng)脈外膜損傷，但是動(dòng)脈中膜和內(nèi)膜結(jié)構(gòu)逐漸完整，在活性蛋白酶高劑量組可以看 到整個(gè)血管管腔輪廓清晰，內(nèi)膜也趨于完整連續(xù)。
[0217] 以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人 員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng) 視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種具有抗血栓作用的方格星蟲(chóng)活性蛋白酶，其特征在于，該活性蛋白酶的N端氨基 酸序列為 Pro-Phe-Pro-Val-Pro-Asp-Pro-Phe-Val-Trp-Asp-Thr-Ser-Phe-Gln。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有抗血栓作用的方格星蟲(chóng)活性蛋白酶，其特征在于，方格星 蟲(chóng)活性蛋白酶的相對(duì)分子質(zhì)量為28003.67D。3. 權(quán)利要求1或2所述的具有抗血栓作用的方格星蟲(chóng)活性蛋白酶的制備方法，其特征在 于，包括以下步驟： (1) 活性蛋白酶粗水提物的制備 取新鮮方格星蟲(chóng)，洗去雜質(zhì)和泥沙，解剖星蟲(chóng)，除去體內(nèi)泥沙，將其剪碎并且勻漿后加 入PBS緩沖液，攪拌均勻，于-10至-20°C中冷凍12~24h后再置于4°C解凍，然后離心，取上清 液;沉淀部分加入PBS緩沖液繼續(xù)重復(fù)上述步驟;將上清液進(jìn)行冷凍干燥，-20°C保存?zhèn)溆茫? (2) 活性蛋白酶水提物的粗分離 硫酸銨沉淀區(qū)間的確定及星蟲(chóng)水提物硫酸銨沉淀 取步驟（1)制備得到的活性蛋白酶粗水提物，向其中分別一邊攪拌一邊加入硫酸銨固 體粉末至30%的百分飽和度，混勻后于0°C孵育30min，然后取鹽析液進(jìn)行離心，取上清，再 向上清液中繼續(xù)加入一定量的硫酸銨固體粉末至60%的百分飽和度，混勻后于0°C孵育 30min，再將鹽析液離心，收集活性蛋白酶沉淀； 活性蛋白酶沉淀的透析脫鹽除雜 將經(jīng)硫酸銨沉淀得到的活性蛋白酶沉淀，用PBS緩沖液進(jìn)行復(fù)溶后，加入到截留分子量 大于3500D的透析袋中，在4°C儲(chǔ)存柜中用roS緩沖液磁力攪拌透析24~48h，除鹽除雜后凍 干，得到活性蛋白酶粗品，備用； (3) 活性蛋白酶的精制 采用美國(guó)GE公司的AKTATMPure蛋白純化系統(tǒng)對(duì)活性蛋白酶進(jìn)行精制 (3.1) 疏水作用層析 樣品處理：用1111〇171(見(jiàn)14)23〇4溶液將活性蛋白酶粗品溶解，離心，并通過(guò)0.45以111水膜過(guò) 濾除雜后備用； 上樣洗脫： 按柱體積的2%上樣，流動(dòng)相：A相為PBS緩沖液和B相為用PBS緩沖液溶解的lm〇L/L (NH4)2S〇4 溶液，梯度洗脫：100%B，3CV;100%-60%B，0.5CV;60%B，0.75CV;60%-40%B， 0.25CV；40%B,0.75CV；40%-20%B,0.25CV；20%B,0.75CV；20%-0B,0.25CV；100%A,2CV； 流速:3mL/min;紫外檢測(cè)波長(zhǎng):280nm;以9mL/管進(jìn)行收集，測(cè)定每管蛋白濃度和酶活力，計(jì) 算比活力，合并收集； (3.2) 活性蛋白酶活性組分的透析脫鹽除雜 將經(jīng)步驟(3.1)疏水作用層析收集得到的活性蛋白酶活性組分用PBS緩沖液進(jìn)行復(fù)溶 后加入到截留分子量大于3500Da的透析袋中，在4°C儲(chǔ)存柜中用PBS緩沖液磁力攪拌透析24 ~48h，凍干，-20°C保存?zhèn)溆茫? (3·3)Q Sepharose High Performance離子交換層析 樣品處理 用PBS緩沖液將上步驟(3.2)得到的活性蛋白酶活性組分溶解，離心，并通過(guò)0.45μπι水 膜過(guò)濾除雜后備用； 上樣洗脫 按柱體積的2 %上樣；流動(dòng)相：A相為PBS緩沖液和B相為用PBS緩沖液溶解的0.8m〇L/ LNaCl 溶液，梯度洗脫：100%A，2CV;0-20%B，0.25CV;20%B，2CV ;20%-30%B，0.25CV;30% BaCV；30%-50%B,0.25CV；50%BaCV；50%-70%B,0.25CV；70%B,0.75CV；70%-100%B, 0.25CV; 100 %，2CV;流速:3mL/min;紫外檢測(cè)波長(zhǎng):280nm;以9mL/管進(jìn)行收集，測(cè)定每管蛋 白濃度和酶活力，計(jì)算比活力進(jìn)行合并收集； 樣品脫鹽除雜 采用Thermo Zeba脫鹽離心柱對(duì)經(jīng)離子交換層析收集得到的活性組分進(jìn)行脫鹽處理； 將活性組分上樣于脫鹽離心柱中，離心，收集樣品； 采用Millipore Amicon Ultra 3K超濾管對(duì)經(jīng)離子交換層析并脫鹽的活性組分進(jìn)行除 雜濃縮，將脫鹽后的活性組分上樣于預(yù)先用去離子水預(yù)處理過(guò)的超濾管中，離心，收集樣 品，凍干，-20 °C保存?zhèn)溆茫? (3.4) Superdex prep grade G-75凝膠過(guò)濾層析 樣品處理 用roS緩沖液將上步驟得到的活性蛋白酶活性組分溶解，離心（8000r/min，30min，4°C) 并通過(guò)0.45μπι水膜過(guò)濾除雜后備用； 上樣洗脫 按柱體積的2 %上樣，流動(dòng)相:PBS緩沖液;洗脫方式:5CV等度洗脫;流速:0.8mL/min;紫 外檢測(cè)波長(zhǎng):280nm;以9mL/管進(jìn)行收集，測(cè)定每管蛋白濃度和酶活力，計(jì)算比活力進(jìn)行合并 收集； (3.5) 樣品除雜 采用組111口〇代4111；[〇〇]/1]11^3 31(超濾管對(duì)經(jīng)步驟(3.4)凝膠過(guò)濾層析后的活性組分進(jìn) 行除雜濃縮;將活性組分上樣于預(yù)先用去離子水預(yù)處理過(guò)的超濾管中，離心，收集樣品，凍 干，得到精制的方格星蟲(chóng)活性蛋白酶。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的具有抗血栓作用的方格星蟲(chóng)活性蛋白酶的制備方法，其特征 在于，所得方格星蟲(chóng)活性蛋白酶的純度大于95%。5. 權(quán)利要求1或2所述的具有抗血栓作用的方格星蟲(chóng)活性蛋白酶在制備抗血栓藥物中 的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61K38/48GK105861474SQ201610301603
【公開(kāi)日】2016年8月17日
【申請(qǐng)日】2016年5月6日
【發(fā)明人】唐于平, 葛雅輝, 段金廒, 劉欣
【申請(qǐng)人】南京中醫(yī)藥大學(xué)