用于酮生產(chǎn)的微生物和方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了重組產(chǎn)乙酸、一氧化碳營養(yǎng)細菌，其缺乏仲醇脫氫酶或包含失活的仲醇脫氫酶。失活的仲醇脫氫酶可由包含失活突變的仲醇脫氫酶基因編碼，所述失活突變減少細菌將丙酮轉(zhuǎn)換為異丙醇并且將甲基乙基酮轉(zhuǎn)換為2?丁醇的能力。因為缺乏仲醇脫氫酶或包含失活的仲醇脫氫酶的細菌累積含羰基化合物，所以本發(fā)明還提供了生產(chǎn)含羰基化合物例如丙酮和甲基乙基酮的方法。
【專利說明】用于酬生產(chǎn)的微生物和方法
[0001] 與相關(guān)申請的交叉參考
[0002] 本專利申請要求于2013年12月3日提交的美國臨時專利申請?zhí)?1 /911，449的利 益，所述美國臨時專利申請全文W引用的方式并入本文。
[000；3] 序列表
[0004] 本專利申請包括隨同同時提交且如下鑒定的核巧酸/氨基酸序列表:于2014年12 月1日創(chuàng)建，名稱為"LT101PCT_ST25. txt"的7，617字節(jié)ASCII(文本)文件，所述序列表全文 W引用的方式并入本文。
技術(shù)領(lǐng)域
[0005] 本發(fā)明設及工業(yè)發(fā)酵。特別地，它設及使用微生物來生產(chǎn)工業(yè)上有用的溶劑例如 酬。
【背景技術(shù)】
[0006] 產(chǎn)乙酸、一氧化碳營養(yǎng)細菌例如自產(chǎn)乙醇梭菌(Clostridium autoethanogenum)、 揚氏梭菌（Clostridium Ijungd址Iii)和拉氏梭菌（Clostridium ragsdalei)將丙酬轉(zhuǎn)換 為異丙醇，并且將甲基乙基甲酬(MEK)轉(zhuǎn)換為2-下醇。相應地，運些細菌W酬例如丙酬和MEK 為代價產(chǎn)生醇例如異丙醇和2-下醇。
[0007] 然而，酬自身是重要的商業(yè)產(chǎn)品。丙酬是工業(yè)溶劑W及甲基丙締酸甲醋(MMA)和聚 甲基丙締酸甲醋(PMMA)的前體，所述MMA和PMMA具有約$ 100億USD/年的合并市場價值。丙酬 還是異下締的前體（van Leeuwen,ApplMicrobiol Biotechnol ,93:1377-1387,2012)。異下 締的市場價值也是顯著的，為約$240億USD/年。MEK是涂料和油墨的重要組分，具有約$20億 USD/年的全球市場價值，W每年約1.9%增長。MEK還是1，3-下二締的前體，其具有超過$190 億USD/年的市場價值，W每年約2.7%增長。此外，丙酬是噴氣燃料的生產(chǎn)前體(Anbarasan, Na1:ure,491:235-239,2012)。
[000引相應地，存在生產(chǎn)工業(yè)上有用的溶劑和合成前體例如丙酬和甲基乙基酬(MEK)的 改良方法的需要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明提供了重組產(chǎn)乙酸、一氧化碳營養(yǎng)細菌，其缺乏仲醇脫氨酶或包含失活的 仲醇脫氨酶。優(yōu)選地，細菌是梭菌屬(Clostridium)的成員，例如來源于自產(chǎn)乙醇梭菌、揚氏 梭菌或拉氏梭菌的細菌。在一個特定實施例中，細菌來源于在DSMZ登錄號DSM23693下保藏 的自產(chǎn)乙醇梭菌。
[0010] 失活的仲醇脫氨酶可來源于具有仲醇脫氨酶或伯-仲醇脫氨酶活性的酶。失活的 仲醇脫氨酶可由包含失活突變的仲醇脫氨酶基因編碼。包含失活突變的仲醇脫氨酶基因可 來源于編碼具有仲醇脫氨酶或伯-仲醇脫氨酶活性的酶的基因。在一個實施例中，失活的仲 醇脫氨酶來源于SEQ ID NO: 1的氨基酸序列。在另一個實施例中，包含失活突變的仲醇脫氨 酶基因來源于SEQ ID N0:2或SEQ ID N0:3的核酸序列。特別地，失活突變可為插入。
[0011] 細菌還可包括編碼一種或多種酶例如硫解酶、CoA-轉(zhuǎn)移酶或乙酷乙酸脫簇酶的外 源基因。此外，細菌可包含編碼丙二醇脫水酶的外源基因，所述丙二醇脫水酶將內(nèi)消旋-2， 3-下二醇轉(zhuǎn)換為MEK，例如產(chǎn)酸克雷伯氏菌化Iebsiella oxtoca)丙二醇脫水酶。
[0012] 失活的仲醇脫氨酶的存在導致酬的累積。相應地，細菌可累積或產(chǎn)生酬，例如丙酬 或 MEK。
[0013] 本發(fā)明還提供了通過培養(yǎng)包含失活的仲醇脫氨酶(所述失活的仲醇脫氨酶由包含 失活突變的仲醇脫氨酶基因編碼）的細菌，由此該細菌產(chǎn)生丙酬和MEK中的一種或多種，來 生產(chǎn)酬例如丙酬或的方法。該方法還可包括從培養(yǎng)物中回收丙酬或Mffi。
【附圖說明】
[0014] 圖1是顯示自產(chǎn)乙醇梭菌醇脫氨酶對各種底物的動力學的表。
[0015] 圖2是顯示在仲醇脫氨酶基因上的內(nèi)含子祀位點（2113、287曰、388曰、40〇3、4333和 552a)和引物結(jié)合位點（156F和939R)的基因圖。
[0016] 圖3A-3C是證實組II內(nèi)含子插入的凝膠圖像。
[0017] 圖4是顯示通過LZ1561和具有失活的仲醇脫氨酶(287a)的突變型自產(chǎn)乙醇梭菌， 將丙酬轉(zhuǎn)換為異丙醇(或其缺乏)的圖表。
[0018] 圖5A-5C是顯示與具有失活的仲醇脫氨酶(433s、388a)的突變型自產(chǎn)乙醇梭菌的 培養(yǎng)物相比較，經(jīng)過LZ1561培養(yǎng)物的4天生長，如通過光密度（圖5A )、丙酬中的變化（圖5B) 和異丙醇中的變化(圖5C)測量的生長的圖表。
[0019] 圖6A和6B是顯示當進料到LZ156U具有含CO鋼鐵廠氣體作為底物）的穩(wěn)定連續(xù)培 養(yǎng)物時，丙酬W高濃度和速率完全轉(zhuǎn)換為異丙醇的圖表。進料濃度在每個圖表下指出。
[0020] 圖7是顯示在具有失活的仲醇脫氨酶的突變型自產(chǎn)乙醇梭菌的第11-14天發(fā)酵時， 乙酸鹽(=角形）、乙醇(菱形）和生物質(zhì)（正方形)濃度的圖表。在第11天時將丙酬進料到發(fā) 酵罐內(nèi)，并且在第12天時將進料到發(fā)酵罐內(nèi)。
[0021] 圖8是顯示通過HPLC檢測的丙酬(S角形）和異丙醇(菱形)濃度的圖表，W及在稀 釋速率1.6時關(guān)于丙酬的理論洗脫曲線(虛線）。差異是由于丙酬的氣提。
[0022] 圖9是顯示通過LZ1561和具有失活的仲醇脫氨酶(287a)的突變型自產(chǎn)乙醇梭菌， 將1邸轉(zhuǎn)換為2-下醇(或其缺乏）的圖表。
[0023] 圖10是顯示通過冊LC檢測的MEK(S角形）和2-下醇(菱形）的圖表，W及在稀釋速 率1.6時關(guān)于1邸的理論洗脫曲線(虛線）。差異是由于1邸的氣提。
[0024] 圖11是顯示在具有失活的仲醇脫氨酶的突變型自產(chǎn)乙醇梭菌的連續(xù)發(fā)酵中，由CO 生產(chǎn)丙酬的圖表。
【具體實施方式】
[0025] 仲醇脫氨酶將含幾基化合物轉(zhuǎn)換為醇。相應地，含有仲醇脫氨酶的細菌能夠?qū)⒑?幾基化合物例如丙酬和MK(分別轉(zhuǎn)換為醇例如異丙醇和2-下醇。本發(fā)明提供了重組產(chǎn)乙酸、 一氧化碳營養(yǎng)細菌，其缺乏仲醇脫氨酶或包含失活的仲醇脫氨酶。特別地，失活的仲醇脫氨 酶可由包含失活突變的仲醇脫氨酶基因編碼，其中所述失活突變減少細菌將丙酬轉(zhuǎn)換為異 丙醇并且將轉(zhuǎn)換為2-下醇的能力。因為該失活突變導致含幾基化合物的累積，所W本發(fā) 明還提供了生產(chǎn)含幾基化合物例如丙酬和1邸的方法。
[0026] 幾基是由與氧原子雙鍵鍵合的碳原子組成的官能團，例如醒或酬。含幾基化合物 包括例如乙偶姻、丙酬、甲基乙基酬(MffiK即2-下酬)和乙醒。
[0027] 醇是其中徑基官能團與飽和碳原子結(jié)合的有機化合物。醇包括例如異丙醇和2-下 醇。
[0028] 醇脫氨酶(ADH)是催化醒或酬（例如丙酬）和醇（例如異丙醇）之間的互換的一組 酶。伯醇脫氨酶能夠?qū)⑿艳D(zhuǎn)換為伯醇，或反之亦然，并且仲醇脫氨酶能夠?qū)⒊贽D(zhuǎn)換為仲醇， 或反之亦然。另外，許多醇脫氨酶能夠?qū)⑿艳D(zhuǎn)換為伯醇，或反之亦然，并且將酬轉(zhuǎn)換為仲醇， 或反之亦然。運些醇脫氨酶可被稱為伯-仲醇脫氨酶，因為它們證實伯醇脫氨酶和仲醇脫氨 酶兩者的活性。如本文使用的，術(shù)語"醇脫氨酶"和"仲醇脫氨酶"涵蓋仲醇脫氨酶和伯-仲醇 脫氨酶兩者。
[0029] 細菌可缺乏仲醇脫氨酶或可遺傳改造為不表達仲醇脫氨酶。特別地，細菌可為來 源于缺乏仲醇脫氨酶的自產(chǎn)乙醇梭菌、揚氏梭菌或拉氏梭菌(其是已知具有仲醇脫氨酶的 唯一產(chǎn)乙醇細菌物種)的細菌。
[0030] 失活突變是減少、基本上消除或完全消除酶活性的任何突變，所述酶例如仲醇脫 氨酶或伯-仲醇脫氨酶。失活突變可為插入、缺失、置換或無義突變、或者減少或消除酶活性 的任何其他類型的突變。失活突變可使細菌的酶活性減少至少10%、至少20%、至少30%、 至少40 %、至少50 %、至少60 %、至少70 %、至少80 %、至少90 %、至少95 %、或至少99 %。酶 活性可通過減少酶功能或通過減少酶量得到減少或消除。引入失活突變的方法是本領(lǐng)域眾 所周知的。例如，失活突變可通過化學誘變、轉(zhuǎn)座子誘變、病毒誘變或體外誘變進行制備。
[0031] 就核酸序列和氨基酸序列而言，術(shù)語"衍生的"指親本或野生型核酸序列或氨基酸 序列的修飾。例如，包含失活突變的仲醇脫氨酶核酸序列或氨基酸序列可分別來源于不含 失活突變的親本或野生型核酸序列或氨基酸序列。在一個優(yōu)選實施例中，失活的仲醇脫氨 酶來源于包含SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的野生型仲醇脫氨酶。編碼失活的仲醇脫氨酶的 基因可來源于包含SEQID NO:2或SEQ ID NO:3的核酸序列。
[0032] 本發(fā)明可使用其序列由本文具體例示的序列改變的核酸進行實踐，條件是核酸執(zhí) 行基本上相同的功能。對于編碼蛋白質(zhì)或膚的核酸序列，運意指編碼的蛋白質(zhì)或膚執(zhí)行基 本上相同的功能。對于啟動子的核酸序列，變體序列具有促進一種或多種基因表達的能力。 此類核酸可被稱為"功能等價變體"。例如，核酸的功能等價變體包括等位基因變體、基因片 段、多態(tài)性等等。來自其他微生物的同源基因是本文具體例示的序列的功能等價變體的例 子。運些包括在物種例如自產(chǎn)乙醇梭菌、揚氏梭菌、拉氏梭菌或諾維氏梭菌(C.novyi)中的 同源基因，關(guān)于其的序列信息可在網(wǎng)站例如GenBank或NCBI公開獲得。短語"功能等價變體" 還包括其序列由于特定生物的密碼子優(yōu)化而改變的核酸。核酸的功能等價變體優(yōu)選與鑒定 的核酸具有至少大約70 %、至少大約80 %、至少大約85 %、至少大約90 %、至少大約95 %或 更大的核酸序列同一性。
[0033] 另外，本發(fā)明可使用其序列由本文具體例示的序列改變的酶或蛋白質(zhì)進行實踐， 條件是酶或蛋白質(zhì)執(zhí)行基本上相同的功能。運些變體可被稱為"功能等價變體"。蛋白質(zhì)或 膚的功能等價變體包括與鑒定的蛋白質(zhì)或膚共享至少40%、至少50%、至少60%、至少 70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或更大的氨基酸同一性的那些蛋 白質(zhì)或膚。此類變體包括蛋白質(zhì)或膚的片段，其中所述片段包括截短形式的多膚，其中缺失 可為1至5、至10、至15、至20、至25個氨基酸。缺失可在多膚的任一末端處從殘基1延伸到25， 可為在該區(qū)域內(nèi)的任何長度，或可在賦予特異性催化功能和活性或者底物或輔因子結(jié)合的 蛋白質(zhì)的內(nèi)部位置或特定結(jié)構(gòu)域處。特定酶或蛋白質(zhì)的功能等價變體還包括由其他細菌物 種中的同源基因表達的多膚，例如如先前段落中例示的。
[0034] 本發(fā)明的核酸序列和氨基酸序列可為外源或內(nèi)源的。在一個實施例中，引入外源 核酸W表達未由微生物天然產(chǎn)生的基因，或過表達由微生物天然產(chǎn)生的基因。另外，外源核 酸可增加基因的拷貝數(shù)，引入強啟動子或組成型啟動子，或引入調(diào)節(jié)元件。外源核酸可整合 到微生物的基因組內(nèi)或可W染色體外狀態(tài)保留。
[0035] 重組核酸、蛋白質(zhì)或微生物含有已連接在一起的不同個體、不同物種或不同屬的 部分。通常，運使用重組DNA技術(shù)來完成，使得形成復合核酸。復合核酸可用于制備例如復合 蛋白質(zhì)。它可用于制備融合蛋白。它可用于轉(zhuǎn)化微生物，所述微生物維持復合核酸且復制復 合核酸，且任選表達蛋白質(zhì)，任選復合蛋白質(zhì)。本發(fā)明的細菌是重組的，即非野生型的。
[0036] 立體特異性酶差異識別對映體且催化與對映體的不同反應。因此，僅一種對映體 可反應，或每種對映體可獲得不同產(chǎn)物。
[0037] "減弱的表達"指相對于在親本微生物中的表達減少的核酸或蛋白質(zhì)表達。減弱的 表達還包括指完全不表達核酸或蛋白質(zhì)的"零"表達。"零"表達可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知 的任何方法來實現(xiàn)，包括RNA沉默、表達過程的修飾(例如啟動子功能的破壞）、或者編碼酶 的核酸從基因組中的完全或部分去除(敲除）。
[0038] 術(shù)語核酸"構(gòu)建體"或"載體"和類似術(shù)語應廣義地理解為包括適合于用作將遺傳 材料轉(zhuǎn)移到細胞內(nèi)的媒介物的任何核酸(包括DNA和RNA)。該術(shù)語應理解為包括質(zhì)粒、病毒 (包括細菌隧菌體）、粘粒和人工染色體。構(gòu)建體或載體可包括一種或多種調(diào)節(jié)元件、復制起 點、多克隆位點和/或可選標記物。構(gòu)建體或載體可適合于允許表達由構(gòu)建體或載體編碼的 一種或多種基因。核酸構(gòu)建體或載體包括裸露核酸W及用一種或多種試劑配制W促進對細 胞的遞送的核酸(例如脂質(zhì)體綴合的核酸）。
[0039] 外源核酸可使用本領(lǐng)域已知的任何方法引入細菌。例如，轉(zhuǎn)化(包括轉(zhuǎn)導或轉(zhuǎn)染） 可通過電穿孔、超聲處理、聚乙二醇介導的轉(zhuǎn)化、化學或自然感受態(tài)、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化、原隧菌 體誘導或綴合來實現(xiàn)（參見例如Sambrook,Molecular Cloning = A LaboratoiT Manual, Cold Spring Harbor Lsborstory Press,Cold Spring Harbor,1989)〇
[0040] 電穿孔的使用已對于幾種一氧化碳營養(yǎng)產(chǎn)乙酸菌報道，包括揚氏梭菌化opke, PNAS, 107:13087-13092，2010 ;W0/2012/053905)、自產(chǎn)乙醇梭菌(W0/2012/053905)、乙酸梭 菌（C.aceticum) (Schiel-Bengelsdorf,Synthetic Biol, 15:2191-2198,2012)和伍氏乙酸 桿菌(A .woodii KStr射Z,A卵1 Elnviron Microbiol, 60:1033-1037,1994)。電穿孔的使用還 已在梭菌屬中報道，包括丙酬下醇梭菌（CloStridium acetobutyl icum) (Mermelstein, Biotechnol, 10 :190-195,1992) W及解纖維素梭菌（C. cel Iulolyticum)(Jennert, Microbiol, 146:3071-3080,2000)。另外，原隧菌體誘導已對于一氧化碳營養(yǎng)產(chǎn)乙酸菌得到 證實，包括糞味梭菌（C.scatologenes)(Pa;rthasarathy,Development of a Genetic Modification System in Clostridium scatologenes ATCC 25775for Generation of Mutants，Masters Project，Western Ken化cky University,2010)，并且綴合已對于許多 梭菌得到描述，包括艱難梭菌（C?difficileKHerbert，F(xiàn)EMSMicrobiolLett，229:103-110,2003) W及丙酬下醇梭菌(Williams J Gen Microbiol ,136:819-826,1990)。類似方法 可用于一氧化碳營養(yǎng)產(chǎn)乙酸菌中。
[0041] 如果某些限制系統(tǒng)在宿主微生物中是活躍的，則可能需要外源核酸的甲基化。
[0042] 穿梭微生物可為其中表達甲基轉(zhuǎn)移酶且不同于目的微生物的微生物。穿梭微生物 可用于將合成后修飾引入遺傳改造的核酸，所述合成后修飾保護最終宿主生物中的遺傳改 造的核酸。相反，目的微生物是其中表達在表達構(gòu)建體/載體上包括的基因且不同于穿梭微 生物的微生物。
[0043] 細菌可為任何重組、一氧化碳營養(yǎng)、產(chǎn)乙酸細菌。"重組"指已由野生型或親本微生 物遺傳修飾的微生物。"一氧化碳營養(yǎng)"指可耐受高濃度一氧化碳的微生物，優(yōu)選細菌。"產(chǎn) 乙酸菌"指天然生成乙酸鹽/乙酸作為厭氧發(fā)酵產(chǎn)物的微生物，優(yōu)選細菌。
[0044] 特別地，細菌可屬于梭菌屬。例如，細菌可為乙酸梭菌、丙酬下醇梭菌、自產(chǎn)乙醇梭 菌、拜氏梭菌（C. bei jerinckii)、下酸梭菌（Clostridium butyricum)、食一氧化碳梭菌 (Clostridium carboxidovirans)、解纖維素梭菌、嗜纖維梭菌（Clostridium cellulovorans)、艱難梭菌、Clostridium diolis、Clostridium drakei、蟻酸乙酸梭菌 (Clostridium formicoaceticum)、克氏梭菌（Clostridium.kluyveri)、揚氏梭菌、大梭菌 (Clostridium magnum)、諾維氏梭菌、己斯德梭菌（Cl OStr id ium pas ter ianium)、 Clostridium phytofermentans、控氏梭菌、Clostridium saccharbutyricum、Clostridium saccharoperbutylacetonicum、糞味梭菌、熱纖梭菌（Clostridium thermocellum)或由其 衍生的細菌。細菌可為產(chǎn)乙酸、一氧化碳營養(yǎng)菌。在一個優(yōu)選實施例中，細菌來源于自產(chǎn)乙 醇梭菌、揚氏梭菌或控氏梭菌。細菌可來源于自產(chǎn)乙醇梭菌DSM10061、自產(chǎn)乙醇梭菌 DSM23693(LZ1561，自產(chǎn)乙醇梭菌DSM10061的衍生物）、或揚氏梭菌DSM13528。在一個優(yōu)選實 施例中，細菌是包含基因的自產(chǎn)乙醇梭菌DSM23693,所述基因編碼包含失活突變的仲醇脫 氨酶。
[0045] 還可使用其他細菌。例如，細菌可屬于乙酸桿菌屬(Acetobacterium)、產(chǎn)堿桿菌屬 (Alkaligenes)、芽抱桿菌屬（Baci Ilus)、短桿菌屬（Brevibac ter ium)、假絲酵母屬 (Candida)、棒狀桿菌屬（Corynebac ter ium)、腸球菌屬化n ter O CO ecus)、埃希氏菌屬 (Escherichia)、漢遜酵母屬（Hansenu la)、克雷伯氏菌屬（Klebsiella)、乳桿菌屬 (Xactobacillus)、乳球菌屬(Xactococcus )、類芽抱桿菌屬（Paenibaci Ilus)、畢赤酵母屬 (Pichia)、假單胞菌屬（Pseudomonas)、羅爾斯通氏菌屬（Ra Istonia)、紅球菌屬 (Rhodococcus)、酵母屬（Saccharo my ces)、沙口 氏菌屬（Salmonella)、木霉屬 (Trichoderma)或發(fā)酵單胞菌屬(Zymomonas)D特別地，細菌可為伍氏乙酸桿菌、己氏嗜喊菌 (Alkalibaculum bacchii)、地衣芽抱桿菌（BaciIlus Iicheniformis)、枯草芽抱桿菌 (Bacillus subtilis)、Blautia producta、甲基營養(yǎng)下酸桿菌（Butyribacterium me thy Iotrophi cum)、谷氨酸棒狀桿菌（Corynebac ter ium g Iutami cum)、大腸桿菌 化scherichia coli)、粘液真桿菌化ubacterium limosum)、產(chǎn)酸克雷伯氏菌、肺炎克雷伯 氏菌（Klebsiella pneumonia)、植物乳桿菌化actobaciIlus PIantarum)、乳酸乳球菌 (Xactococcus Iactis)、熱自養(yǎng)穆爾氏菌（Moorella 化ermautotrophica)、熱乙酸穆爾氏 菌（Moorella thermoacetica)、普氏產(chǎn)醋桿菌（Oxobacter pfennigii)、惡臭假單胞菌 (Pseudomonas putida)、富養(yǎng)羅爾斯通氏菌（Ralstonia eutropha)、釀酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)、卵形鼠抱菌（Sporomusa ovata)、Sporomusa silvacetica、 球形鼠抱菌（Sporomusa S地aeroides)、凱伍熱厭氧菌（Thermoanaerobacter kiuvi)、里氏 木霉（Trichoderma reesei)、運動發(fā)酵單胞菌（Zymomonas mobilis)或由其衍生的細菌。
[0046] 就微生物(例如細菌)而言，術(shù)語"衍生的"指親本或野生型微生物的修飾。包含編 碼包含失活突變的仲醇脫氨酶的基因的細菌可來源于包含編碼仲醇脫氨酶(所述仲醇脫氨 酶不含失活突變)的基因的親本或野生型細菌，或者不含編碼仲醇脫氨酶的基因的親本或 野生型細菌。使用本領(lǐng)域已知的任何方法，例如人工或天然選擇、突變或遺傳重組，細菌可 來源于親本或野生型細菌。親本微生物可為運樣的生物，其先前已進行修飾，但不表達或過 表達本發(fā)明的一種或多種酶(例如LZ1561)。在一個優(yōu)選實施例中，細菌來源于自產(chǎn)乙醇梭 菌、揚氏梭菌或拉氏梭菌。在一個特別優(yōu)選的實施例中，細菌來源于在DSMZ登錄號DSM23693 下保藏的細菌(目化Z1561)。
[0047] 細菌可為分離的。例如，細菌可從其天然環(huán)境、包含兩種或更多種微生物的培養(yǎng) 物、或包含單一微生物的異質(zhì)(遺傳上不等同）群體的培養(yǎng)物中物理分離。由單一細菌生長 的菌落或培養(yǎng)物也視為分離的。
[0048] 細菌還可進行修飾，W表達或過表達在用于制備含幾基化合物例如醒或酬的生物 合成途徑中的一種或多種酶。生物合成途徑可為對細菌內(nèi)源、部分內(nèi)源或完全外源的。生物 合成途徑可包含例如外源酶或者來源于其他物種或?qū)俚拿?。在一些情況下，外源酶可與內(nèi) 源酶協(xié)同工作，W形成并非天然存在于細菌中的生物合成途徑。例如，丙酬生產(chǎn)已在并非天 然生產(chǎn)丙酬的微生物中得到證實(W0/2012/115527)。編碼酶例如硫解酶、CoA-轉(zhuǎn)移酶和乙 酷乙酸脫簇酶的基因可加入細菌中，W使細菌能夠制備丙酬。另外或可替代地，外源丙二醇 脫水酶可加入細菌中，W使細菌能夠?qū)?nèi)消旋-2,3-下二醇轉(zhuǎn)換為2-下酬(MEK)。外源丙二 醇脫水酶可來源于產(chǎn)酸克雷伯氏菌。
[0049] 氣體發(fā)酵是通過其氣態(tài)底物用作碳源和/或能源用于生產(chǎn)乙醇或其他產(chǎn)物或化學 品的代謝過程。如本文使用的，術(shù)語"發(fā)酵"涵蓋該過程的生長期和產(chǎn)物生物合成期兩者。氣 體發(fā)酵通過微生物通常為細菌來執(zhí)行。
[0050] 細菌培養(yǎng)物可在對培養(yǎng)物提供足夠資源的任何液體營養(yǎng)培養(yǎng)基中生長。液體營養(yǎng) 培養(yǎng)基可含有例如維生素、礦物質(zhì)和水。合適的液體營養(yǎng)培養(yǎng)基的例子是本領(lǐng)域已知的，包 括適合于乙醇或其他產(chǎn)物發(fā)酵的厭氧培養(yǎng)基（參見例如美國專利5,173,429、美國專利5， 593,886和WO 2002/08438)。
[0051] 細菌培養(yǎng)物可包含在反應器(生物反應器）中。反應器可為具有一個或多個容器 和/或塔或管道布置用于生長細菌培養(yǎng)物的任何發(fā)酵裝置。反應器可為例如固定化細胞反 應器、氣舉式反應器、鼓泡塔反應器(BCR)、環(huán)管反應器、膜反應器例如中空纖維膜生物反應 器化FM BR)、連續(xù)流攬拌蓋式反應器(CSTR)或滴流床反應器(TBR)。反應器優(yōu)選適合于接受 包含C0、O)2和/或出的氣態(tài)底物。反應器可包括平行或串聯(lián)的多重反應器(階段）。例如，反應 器可包含在其中培養(yǎng)細菌的第一生長反應器和第二發(fā)酵反應器，來自生長反應器的發(fā)酵液 可進料給所述第二發(fā)酵反應器并在其中可產(chǎn)生大多數(shù)發(fā)酵產(chǎn)物。
[0052] 發(fā)酵應期望地在用于含幾基化合物的生產(chǎn)發(fā)生的適當發(fā)酵條件下進行。應考慮的 反應條件包括壓力、溫度、氣體流速、液體流速、培養(yǎng)基抑、培養(yǎng)基氧化還原電位、攬動速率 (如果使用連續(xù)攬拌蓋式反應器）、接種物水平、確保在液相中的CO不會成為限制性的最大 氣體底物濃度和避免產(chǎn)物抑制的最大產(chǎn)物濃度。
[0053] 當與發(fā)酵工藝相關(guān)使用時，術(shù)語"增加效率"、"增加的效率"等等包括但不限于增 加下述中的一種或多種:催化發(fā)酵的微生物的生長率、W升高的產(chǎn)物濃度的生長率和/或產(chǎn) 物生產(chǎn)率、產(chǎn)生的所需產(chǎn)物的體積/消耗的底物體積、所需產(chǎn)物的生產(chǎn)率或生產(chǎn)水平、W及 與發(fā)酵的其他副產(chǎn)物相比較產(chǎn)生的所需產(chǎn)物的相對比例。
[0054] 氣態(tài)底物（"氣體"或"進料氣體"或"發(fā)酵氣體"或"底物"）可為任何氣體，其含有在 發(fā)酵中由微生物用作碳源和/或能源的化合物或元素。氣態(tài)底物通常含有顯著比例的出、0)2 和/或CO,并且可另外含有化或其他氣體。在一個實施例中，氣態(tài)底物包含C0。在另一個實施 例中，氣態(tài)底物包含出、0)2和C0。在一個進一步的實施例中，氣態(tài)底物不含或基本上不含化。
[0055] 氣態(tài)底物的確切組成可改變。氣態(tài)底物可含有例如按體積計約20%至約100%C0、 按體積計約20 %至70 % CO、按體積計約30 %至60 % CO、或按體積計約40 %至55 %C0。特別 地，氣態(tài)底物可含有按體積計約25 %、約30 %、約35 %、約40 %、約45 %、約50 % CO、約55 % C0、或約60 % C0。氣態(tài)底物可含有例如按體積計約1 %至80 % C〇2或按體積計約1 %至30 % C〇2。氣態(tài)底物可含有例如按體積計小于約20 % C〇2、小于約15 % C〇2、小于約10 % C〇2、小于約 5 % C〇2、或約0 % (基本上無)0)2。雖然氣態(tài)底物無需含有此，但此的存在可導致所需產(chǎn)物生 產(chǎn)的總體效率改善。氣態(tài)底物可包含例如2:1、1: 1、或1: 2比率的此:C0。氣態(tài)底物可包含例 如按體積計小于約30 %出、小于約20 %出、小于約15 %出、或小于約10 %出。在其他實施例 中，氣態(tài)底物可包含低濃度此，例如按體積計小于約5%出、小于約4%此、小于約3%此、小于 約2%出、小于約1 %出、或約0%(基本上無化。
[0056] 此外，通常期望增加底物流的CO濃度(或氣態(tài)底物中的CO分壓），W增加其中CO是 底物的發(fā)酵反應的效率。在增加的壓力下操作允許從氣相到液相的CO轉(zhuǎn)移速率中的顯著增 加，在所述液相中它可由微生物吸收。運依次又減少定義為生物反應器中的液體體積除W 輸入氣體流速的保留時間。最佳反應條件部分地取決于使用的特定微生物。然而，一般而 言，優(yōu)選在比環(huán)境壓力更高的壓力下執(zhí)行發(fā)酵。此外，因為給定CO轉(zhuǎn)換率部分地是底物保留 時間的函數(shù)，并且達到所需保留時間指示生物反應器的所需體積，所W增壓系統(tǒng)的使用可 極大減少所需生物反應器的體積，并且因而減少發(fā)酵設備的資金成本。根據(jù)US 5,593,886 中給出的例子，反應器體積可與反應器操作壓力中的增加按線性比例減少。例如，在IOatm 壓力下操作的生物反應器僅需要在Iatm壓力下操作的那些十分之一的體積。
[0057] 用于給發(fā)酵反應進料的氣體流的組成可對發(fā)酵反應的效率和/或成本具有顯著影 響。例如，〇2的存在可降低厭氧發(fā)酵過程的效率。在發(fā)酵前或發(fā)酵后發(fā)酵過程階段中不需要 或不必要的氣體的處理可增加階段的能量負荷。例如，當氣體流在進入生物反應器之前是 壓縮的時，能量可用于壓縮在發(fā)酵中不需要的氣體。
[005引氣態(tài)底物可源自工業(yè)過程。特別地，氣態(tài)底物可為由工業(yè)過程生成的廢氣，所述工 業(yè)過程例如鐵金屬產(chǎn)品制造(例如鋼鐵制造）、非鐵產(chǎn)品制造、石油精煉、煤炭氣化、電力生 產(chǎn)、碳黑生產(chǎn)、氨生產(chǎn)、甲醇生產(chǎn)或焦炭制造。在一個優(yōu)選實施例中，氣態(tài)底物來源于鋼鐵制 造氣體。
[0059]氣態(tài)底物可源自有機物質(zhì)的氣化，所述有機物質(zhì)例如甲燒、乙燒、丙烷、煤、天然 氣、原油、來自煉油廠的低價值殘渣(包括石油焦炭或石油焦）、固體城市廢物或生物質(zhì)。生 物質(zhì)包括在糧食提取和加工期間獲得的副產(chǎn)物，例如來自甘薦的糖、或者來自玉蜀泰或谷 物的淀粉、或者通過林業(yè)產(chǎn)業(yè)生成的非食物生物質(zhì)廢物。運些含碳材料中的任一種可為氣 化的，即部分由氧燃燒，W產(chǎn)生合成氣體(合成氣）。合成氣通常主要包含C0、出和/或C〇2,并 且可另外含有甲燒、乙締、乙燒或其他氣體的量。氣化器的操作條件可進行調(diào)整，W提供具 有所需組成的底物流用于發(fā)酵，或者與一種或多種其他流滲和W提供最佳組成或期望組成 W得到發(fā)酵過程中增加的醇生產(chǎn)率和/或總體碳捕獲。
[0060] 在氣態(tài)底物用于發(fā)酵之前，可能期望過濾、擦洗或W其他方式預處理氣態(tài)底物，W 去除化學或物理雜質(zhì)或污染物。例如，源氣體可經(jīng)過水或W其他方式過濾，W去除顆粒物 質(zhì)、長鏈控或焦油。然而，不一定需要此類過濾或預處理。有時能夠?qū)Πl(fā)酵培養(yǎng)物直接提供 未過濾、未經(jīng)處理的氣態(tài)底物。
[0061] 盡管氣態(tài)底物通常W氣體的形式提供，但術(shù)語"氣態(tài)底物"還涵蓋W替代形式提供 的包含CO、0)2和/或此的底物。例如，含有CO的氣態(tài)底物可在液體中溶解提供?；旧?，液體 可用含CO氣體飽和，并且隨后加入生物反應器中。示例性方法包括微泡分布發(fā)生器 化ensirisak,Appl BiochemBiotechnol ,101:211-227,2002)的使用和氣態(tài)底物吸附到固 體支持物上。
[0062] 本發(fā)明還提供了通過培養(yǎng)包含失活的仲醇脫氨酶(所述失活的仲醇脫氨酶由包含 失活突變的仲醇脫氨酶基因編碼）的細菌，由此該細菌產(chǎn)生丙酬和MEK中的一種或多種，來 生產(chǎn)酬例如丙酬或的方法。該方法還可包括從培養(yǎng)物中回收丙酬或Mffi。
[0063] 實例
[0064] 下述實例進一步舉例說明本發(fā)明，但當然，不應解釋為W任何方式限制其范圍。 [00化]實例1
[0066] 該實例描述了一般材料和方法。
[0067] 微生物和生長條件
[0068] 自產(chǎn)乙醇梭菌DSM10061和DSM23693(DSM10061的衍生物）W及揚氏梭菌DSM13528 源自DSMZ(德國微生物和細胞培養(yǎng)物保藏中屯、（The German Collection Of Microorganisms and Cell Cultures)，InhoffenstraPe 7B,38124Braunschweig，德國）。 拉氏簇基ATCC BAA-622源自ATCC(美國典型培養(yǎng)物中屯、，Manassas,VA 20108,USA)，并且大 腸桿菌D冊a源自 Invitrogen(Carlsbad，CA 92008，USA)。
[0069] 大腸桿菌在好氧條件下在37°C下在LB化uria-Bertani)培養(yǎng)基中進行生長，所述 LB培養(yǎng)基含有IOg膜蛋白腺、5g酵母提取物和IOg化C1/1. OL培養(yǎng)基。固體培養(yǎng)基含有1.5 % 瓊脂。
[0070] 梭菌屬菌株在37°C下在PETC培養(yǎng)基中在pH 5.6下進行生長，使用標準厭氧技術(shù) (Hungate,In=Methods in Microbiology,3B:117-132,1969;Wolfe,Adv Microb F*hysiol, 6:107-146，1971)。果糖（異養(yǎng)生長)或頂空中的30psi含C0鋼鐵廠氣體（由在Glenbrook，NZ 中的化W Zealand Steel場所收集；組成：44%C0、32%化、22%C02、2%出）（自養(yǎng)生長）用作 底物。對于固體培養(yǎng)基，加入1.2 %Bacto瓊脂(BD，陸姐kl in Lakes，NJ 07417，USA)。
[0071] 陽TC培養(yǎng)基

[0080] 用自產(chǎn)乙醇梭菌DSM23693的發(fā)酵在I.化生物反應器中在37°C下進行，使用含CO鋼 鐵廠氣體作為唯一能源和碳源。制備確定成分的培養(yǎng)基，其含有:MgClXaCl2(0.5mM)、KCl (2mM)、出PCk(SmM) Je(IOOiiM)、Ni、ai(5iiM)、Mn、B、W、Mo、Se(2iiM)。將培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到生物反應 器內(nèi)且在12rC下高壓滅菌45分鐘。在高壓滅菌后，培養(yǎng)基補充硫胺、泛酸鹽(0.05mg/L)、生 物素(0.02mg/L)，且用3mM半脫氨酸-HCl還原。反應器容器通過0.2皿濾器用氮噴射，W達到 厭氧條件。在接種之前，將氣體轉(zhuǎn)變?yōu)檫B續(xù)進料至反應器的含CO鋼鐵廠氣體。氣流最初設為 80ml/分鐘，并且在指數(shù)中期過程中增加至200ml/分鐘，同時攬動從20化pm增加到35化pm。 將化2SWO. 25ml/小時給予生物反應器內(nèi)。一旦0D600達到0.5,生物反應器就轉(zhuǎn)變?yōu)閃 1.0ml/分鐘速率(稀釋速率0.96d-l)的連續(xù)模式。獲取樣品W測量生物質(zhì)和代謝產(chǎn)物，并且 分析流入和流出氣體。
[0081] 代謝產(chǎn)物分析
[0082] 頂空的氣體組成在具有兩個安裝通道的化rian CP-4900mic;ro GC上進行測量。通 道1是在70°(：、2001^^氣和4.23的回洗時間下運行的101111〇1篩分柱，而通道2是在90°(：、 150k化氮和無回洗下運行的IOm PPQ柱。關(guān)于兩個通道的進樣器溫度為70°C。運行時間設為 120s，但所有目的峰通常在IOOs前洗脫。
[0083] 使用配備在35°C下操作的RID(折射率接觸器)和保持在60°C下的Alltech IOA-2000有機酸柱（150x 6.5mm，粒度扣m)的Agilent IlOOSeries HPLC系統(tǒng)，執(zhí)行代謝終產(chǎn)物 的HPLC分析。略微酸化的水(0.005M此S〇4)用作移動相，具有0.7ml/分鐘的流速。為了去除 蛋白質(zhì)和其他細胞殘渣，將400iil樣品與10化1 2%(w/v)5-橫基水楊酸混合，并且W14, OOOx g離屯、3分鐘，W分離沉淀的殘渣。隨后將IOiil上清液注入HPLC內(nèi)用于分析。
[0084] 使用配備Supelco PDMS 100 Icm纖維、Alltech EC-1000(30m xO. 25mm X 0.25y m)柱和火焰離子化接觸器(FID)的Agilent 6890N頂空GC，執(zhí)行代謝終產(chǎn)物的GC分析。將5ml 樣品轉(zhuǎn)移到化ngate管內(nèi)，在水浴中加熱至40°C，并且暴露于纖維正好5分鐘。進樣器保持在 250°C下。氮用作載氣并且維持在Iml/分鐘的恒定流速下。烘箱在40°C下運行5分鐘，隨后為 10°C/分鐘增加直到200°C。溫度隨后還W50°c/分鐘的速率增加至220°C，隨后在該溫度下 保持5分鐘。隨后，溫度W50°C/分鐘的速率下降至40°C，隨后在該溫度下保持1分鐘。FID保 持在250°C下，具有40ml/分鐘氨、450ml/分鐘空氣和15ml/分鐘氮作為補充載氣。
[0085] 實例2
[0086] 該實例證實在自產(chǎn)乙醇梭菌、揚氏梭菌和拉氏梭菌中，負責將丙酬還原為異丙醇 和將還原為2-下醇的仲醇脫氨酶的鑒定。
[0087] 丙酬至異丙醇的轉(zhuǎn)換已在一氧化碳營養(yǎng)菌中得到描述，所述一氧化碳營養(yǎng)菌例如 自產(chǎn)乙醇梭菌(WO 2012/115527)、揚氏梭菌(WO 2012/115527)和拉氏梭菌(WO 2012/ 115527)(Ramachan化iya,Biotechnol Bioeng,108:2330-2338,2011)。還鑒定了與來自拜 氏梭菌的酶（Ismaiel，J Bacteriol ,175:5097-5105,1993)具有相似性的仲醇脫氨酶(ADH; EC 1.1.1.2)(W0 2012/115527)。
[008引自產(chǎn)乙醇梭菌包含具有SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的仲醇脫氨酶，由SEQ ID NO:2 的核酸序列編碼。揚氏梭菌包含具有SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的仲醇脫氨酶(NCBI YP_ 003780646.1)，由揚氏梭菌基因組內(nèi)的仲醇脫氨酶基因的核酸序列編碼（NCBI NC_ 014328.1:2755565. .2756620，GeneID9446102,基因座標簽化JU-C24860)。拉氏梭菌包含具 有SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的仲醇脫氨酶，由SEQ ID N0:3的核酸序列編碼。
[0089] 為了證實該仲醇脫氨酶負責丙酬至異丙醇的轉(zhuǎn)換，使自產(chǎn)乙醇梭菌的仲醇脫氨酶 在大腸桿菌中過度產(chǎn)生，并且測量它的活性。SEQ ID N0:2由如WO 2012/115527中所述分離 的自產(chǎn)乙醇梭菌的基因組DNA擴增，經(jīng)由KpnI和HindIII克隆到pBAD載體（Invitrogen)內(nèi)， 并且使用如Sambrook中所述的標準方法，通過電穿孔轉(zhuǎn)化到大腸桿菌內(nèi)。ADH基因的序列通 過DNA測序加 W證實。經(jīng)轉(zhuǎn)化的細胞在IOOmL具有氨節(jié)青霉素的LB中在37°C下生長，直至達 至IjO. 8的0D600。在運時，加入ImL 20 %阿拉伯糖，并且對于表達的剩余部分，使培養(yǎng)物在28 °C下溫育。使細胞形成團塊，并且傾析上清液。隨后將團塊重懸浮于肥陽S緩沖液(50mM化-肥陽S和0.2mM DTT，P冊.0)中，并且加入各0.化L邸NZ0NAW?(Merck，25單位/化）和溶菌酶 (Merck，30kUAiL)。隨后使用固定化金屬親和層析，經(jīng)由融合的N末端化s6標簽來純化仲醇 脫氨酶。在冰上的30分鐘溫育后，細胞通過超聲處理進行裂解，使不溶性碎片形成團塊，并 且使用0.2微米濾器使上清液澄清。將澄清的上清液加入TALON?樹脂(Clontech)中，所述 TALON?樹脂已用裂解緩沖液充分洗涂。500化的柱床體積用于純化，并且允許蛋白質(zhì)與 TALON?樹脂在4 °C下結(jié)合一小時，并且隨后用裂解緩沖液洗涂幾次。使用補充有150mM咪挫 的裂解緩沖液從柱中洗脫蛋白質(zhì)，并且將洗脫物W5(K)化級分收集。通過純化過程獲取的等 分試樣W及洗脫級分在SDS PAGE凝膠上運行，W證實蛋白質(zhì)的存在且測定純化的成功。使 用AMIC0N?Ultra-4Cent;ri化gal Filter Units(Millipore)，將蛋白質(zhì)交換到膽存緩沖液 (50mM憐酸鐘、150mM化Cl、10%v/v甘油，pH 7.0)內(nèi)。當在大腸桿菌中表達時，蛋白質(zhì)是高 度可溶的且可容易地純化。活性測定在使用石英比色杯的紫外/可見光分光光度計中進行， 使用Wo. 2mM濃度的NADPH作為輔因子，并且使用3mM M邸作為底物。測定混合物含有50mM 化is-HCl緩沖液(pH7.5)與ImM DTT。自產(chǎn)乙醇梭菌的仲醇脫氨酶顯示用于將丙酬還原為異 丙醇的活性。此外，發(fā)現(xiàn)用于將還原為2-下醇，將乙偶姻還原為2,3-下二醇，W及將乙醒 還原為乙醇的活性。最高活性對于丙酬發(fā)現(xiàn)，隨后為MEK(圖1)。
[0090] 除仲醇脫氨酶之外，對異丙醇具有活性的兩種下醇脫氨酶(抓H)已得到描述(Tan, J Basic Microbiol ,54:996-1004,2013)。運些下醇脫氨酶也存在于自產(chǎn)乙醇梭菌和拉氏 梭菌中。
[0091] 實例3
[0092] 該實例證實在自產(chǎn)乙醇梭菌中仲醇脫氨酶的失活。
[0093] 所鑒定的自產(chǎn)乙醇梭菌的仲醇脫氨酶(SEQ ID NO: 2)使用Clos化on系統(tǒng)化eap，J Microbiol Meth,70:452-464,2007)進行失活。在CloslYon網(wǎng)站上的內(nèi)含子設計工具用于 設計344bp祀向區(qū)域(SEQ ID N0:4)，W及鑒定在有義鏈和反義鏈上的六個祀位點（圖2)。祀 向區(qū)域在含有逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座活化的ermB標記物(RAM)的載體PMTL007C-E2中進行化學合成。
[0094] 如WO 2012/053905中所述，將載體引入自產(chǎn)乙醇梭菌中。在具有15iig/ml甲諷霉素 的PETC MES上生長的單一菌落在具有扣g/ml克拉霉素的PETC MES上進行劃線培養(yǎng)。隨機挑 選來自每種祀的菌落，并且使用側(cè)翼引物155F(SEQ ID N0:5)和939R(SEQ ID N0:6)篩選插 入。使用iN化onMaxime PCR預混合物執(zhí)行擴增。783bp的PCR產(chǎn)物指示LZ1561基因型，而大約 2.6化的產(chǎn)物大小提示組II內(nèi)含子在祀位點中的插入（圖3)。質(zhì)粒的喪失通過PCR使用引物 (AAGAAGGGCGTATATGAAAACTTGT,沈Q ID N0:8)用于擴增抗性標記物（catP)，W及革蘭氏陽 性復制起點(PCB102)。
[0095] 相同策略和質(zhì)粒也可應用于揚氏梭菌或拉氏梭菌。轉(zhuǎn)化方案先前已得到描述(WO 2012/053905)(Leang,Appl Environ Microbiol,79:1102-1109,2013)〇
[0096] 實例4
[0097] 該實例證實在具有失活的仲醇脫氨酶的自產(chǎn)乙醇梭菌中丙酬還原為異丙醇的消 除。
[0098] 將丙酬(0、1、5和20g/L)進料至（1化Z1561和(2)ClosTron突變型自產(chǎn)乙醇梭菌(具 有含有在位置287a和211s處的突變的失活仲醇脫氨酶)的血清瓶培養(yǎng)物。LZ1561菌株將Ig/ L丙酬完全轉(zhuǎn)換成異丙醇，使得通過HPLC檢測到0.65g/L異丙醇，且未檢測到丙酬。進料20g/ L丙酬的血清瓶中的異丙醇的終濃度為8. Ig/L異丙醇，其中剩下9.25g/L丙酬。在Clos化on 仲醇脫氨酶突變體的任一中未觀察到丙酬至異丙醇的可檢測轉(zhuǎn)換（圖4)。在進料量和測量 量之間的差異是由于將丙酬準確加入增壓血清瓶的困難。
[0099] 在另外的實驗中，將16g/L丙酬進料到在陽TC MES中的LZ1561SecADH: :erm 433s、 LZ1561SecADH: :erm 388a和LZ1561的血清瓶培養(yǎng)物。培養(yǎng)物在鋼鐵廠氣體頂空下在37°C下 生長。在生長4天后，LZ1561已將大約一半丙酬轉(zhuǎn)換成異丙醇。在secADH Clos化on突變體中 未檢測到異丙醇（圖5)。
[0100] 因此，雖然LZ1561菌株非常有效地將丙酬還原為異丙醇，但突變株不能將丙酬還 原為異丙醇。盡管存在兩種下醇脫氨酶(其在丙酬至異丙醇的還原中明顯不起作用），仍觀 察到該結(jié)果。
[0101] 還執(zhí)行設及生物反應器中的連續(xù)培養(yǎng)的實驗。LZ1561如上所述在生物反應器中生 長。一旦處于具有穩(wěn)定生物質(zhì)和代謝產(chǎn)物生產(chǎn)的連續(xù)模式中，就將丙酬加入生物反應器和 進料培養(yǎng)基兩者中。將丙酬滲料到反應器內(nèi)至一定水平，其隨后通過連續(xù)進料獲得。最初加 入Ig/L丙酬。一旦代謝產(chǎn)物濃度穩(wěn)定，濃度就增加至5g/L、15g/L，并且在第二實驗中，至 20g/L。即使在15-20g/L的高濃度下，培養(yǎng)物也W高速率將所有丙酬轉(zhuǎn)換為異丙醇，證實所 鑒定的仲醇脫氨酶是高度有效的（圖6)(wo 2012/0252083)。
[0102] 類似生物反應器實驗用Clos化on突變體執(zhí)行，所述Clos化on突變體具有含有在位 置211s處的突變的失活的仲醇脫氨酶。將5g/L丙酬滲料到生物反應器內(nèi)。與在其中觀察到 丙酬至異丙醇的幾乎立即轉(zhuǎn)換的LZ156U圖6)不同，在Clos化on突變體中未觀察到丙酬的 轉(zhuǎn)換(圖7和圖8)。因此，丙酬至異丙醇的轉(zhuǎn)換在Clos Tron突變體中完全被消除。
[0103] 實例5
[0104] 該實例證實無丙酬還原的來自1,2-丙二醇的丙酬生產(chǎn)。
[0105] 先前已證實自產(chǎn)乙醇梭菌含有運樣的基因，當將丙-1,2-二醇加入培養(yǎng)基時，所述 基因賦予將丙-1,2-二醇立體特異性脫水為丙醒和丙酬的能力。在LZ156中，丙醒和丙酬被 還原為丙-1-醇和丙-2-醇。丙酬通過仲醇脫氨酶還原。當丙-1,2-二醇加入用Clos化on突變 體(具有失活的仲醇脫氨酶)接種的培養(yǎng)基中時，所產(chǎn)生的丙酬未還原為丙-2-醇。
[0106] 將丙-1,2-二醇加入血清瓶中的PETC-MES培養(yǎng)基中至66mM。瓶用自產(chǎn)乙醇梭菌或 LZ1561進行接種，所述自產(chǎn)乙醇梭菌具有ClOsTron失活的仲醇脫氨酶（SecADH: :e;rmB 287a)。在生長96小時后，LZ1561產(chǎn)生16.0± 1.6mM丙-2-醇和8.1 ± 1.8mM丙-1-醇，而失活的 sADH菌株產(chǎn)生5.7 ± 1.5mM丙酬、6.0 ± 1. SmM丙-1-醇和無法檢測的丙-2-醇。
[0107] 實例6
[0108] 該實例證實在具有失活的仲醇脫氨酶基因的自產(chǎn)乙醇梭菌中由CO生產(chǎn)丙酬。
[0109] 具有丙酬合成基因包括編碼硫解酶、CoA-轉(zhuǎn)移酶和乙酷乙酸脫簇酶的基因的質(zhì)粒 已得到設計，并且在自產(chǎn)乙醇梭菌中引入，導致異丙醇生產(chǎn)，僅伴隨很少的丙酬或無丙酬 (WO 2012/0252083)。當此類質(zhì)粒在具有失活的仲醇脫氨酶的自產(chǎn)乙醇梭菌的Clos化on突 變體中引入時，產(chǎn)生丙酬，而不產(chǎn)生異丙醇。培養(yǎng)物在6孔板中W6mL/孔的體積在厭氧培養(yǎng) 罐內(nèi)在W25psi的C0/H2氣體上生長。在生長4天后，培養(yǎng)物產(chǎn)生平均0.95±0.01g/L丙酬、 5.64 ± 0.1 Ig/L乙醇和3.58 ± 1.3g/L乙酸鹽。由于丙酬在37 °C下的揮發(fā)性，實驗用兩個另外 的6孔板重復，所述6孔板具有培養(yǎng)基，但不含丙酬生產(chǎn)細菌。丙酬生產(chǎn)培養(yǎng)物在4天內(nèi)產(chǎn)生 平均0.92 ± 0.04g/L丙酬。此外，本底板產(chǎn)生平均0.5 ± 0.02g/L丙酬，其已經(jīng)由氣相丙酬轉(zhuǎn) 移。考慮到丙酬的轉(zhuǎn)移，最終調(diào)整的生產(chǎn)為1.9g/L丙酬。
[0110] 丙酬生產(chǎn)還在生物反應器中的連續(xù)培養(yǎng)物中得到證實，使用與上文描述相同的菌 株和方法。經(jīng)過20天時期，在發(fā)酵液中始終觀察到大約0.2g/L丙酬（圖11，其中"總丙酬"指 培養(yǎng)基中的丙酬(通過HPLC觀察到)加上計算為通過經(jīng)過發(fā)酵罐的氣體從培養(yǎng)基中去除的 丙酬）。生物反應器用1.5的稀釋速率運行，獲得發(fā)酵液中大約0.4g/L/d的生產(chǎn)率。除發(fā)酵液 中的濃度之外，用逸出氣體剝離相當量的丙酬(超過發(fā)酵液中濃度的30%)，如在流出氣體 的冷卻分離罐中測定的?？紤]到丙酬的揮發(fā)性和通過系統(tǒng)的氣體流動，丙酬的剝離提供了 理想、低成本的產(chǎn)物分離，從而提供超過異丙醇的優(yōu)點，所述異丙醇不是揮發(fā)性的，并且大 多數(shù)需要例如通過蒸饋從發(fā)酵液中提取。丙酬的剝離還提供了用于產(chǎn)物合成的驅(qū)動力，從 而避免終產(chǎn)物抑制。
[0111] 實例7
[0112] 該實例證實1邸至2-下醇還原的消除。
[0113] 將MEK(0、1、5和20g/L)進料至（1化Z1561和（2)ClosTron突變型自產(chǎn)乙醇梭菌（具 有含有在位置287a和211s處的突變的失活的仲醇脫氨酶）的血清瓶培養(yǎng)物。LZ1561將1和 5g/L MEK分別完全轉(zhuǎn)換成0.94和4.34g/L2-下醇，其中未剩下可檢測的MEK。進料20g/L MEK 的血清瓶中的2-下醇的終濃度為6.3g/L 2-下醇，其中剩下17.3g/L MEK。在Clos化on仲醇 脫氨酶突變體的任一中未觀察到1邸至2-下醇的轉(zhuǎn)換(圖9)。
[0114] 為了進一步驗證使在位置211s處失活的仲醇脫氨酶基因失活完全消除自產(chǎn)乙醇 梭菌將MEK轉(zhuǎn)換成2-下醇的能力，將lOg/L MEK滲料到具有仲醇脫氨酶失活菌株生長的生物 反應器內(nèi)。未觀察到MEK的轉(zhuǎn)換(圖7，圖10)。
[0115] 實例8
[0116] 該實例描述在具有失活的仲醇脫氨酶基因的自產(chǎn)乙醇梭菌中來自2,3-下二醇的 MEK生產(chǎn)。
[0117] 已證實在自產(chǎn)乙醇梭菌中表達來自產(chǎn)酸克雷伯氏菌的丙二醇脫水酶允許將外源 內(nèi)消旋-2,3-下二醇轉(zhuǎn)換為2-下酬。所產(chǎn)生的2-下酬通過自產(chǎn)乙醇梭菌中存在的仲醇脫氨 酶還原為2-下醇。
[0118] 使用確定的方法，用表達來自產(chǎn)酸克雷伯氏菌的二醇脫水酶的pMTL83155-pddABC 轉(zhuǎn)化具有失活的仲醇脫氨酶的自產(chǎn)乙醇梭菌的ClosTron突變體。所得的菌株在外源內(nèi)消 旋-2,3-下二醇的存在下在血清瓶中自養(yǎng)生長。轉(zhuǎn)換為2-下酬的下二醇未還原為2-下醇。
[0119] 本文引用的所有參考文獻包括出版物、專利申請和專利在此W引用的方式并入， 其程度與每個參考文獻個別且特別指出W引用的方式并入且在本文中全文闡述相同。本說 明書中對任何現(xiàn)有技術(shù)的提及不是，也不應被視為承認現(xiàn)有技術(shù)在任何國家構(gòu)成努力領(lǐng)域 中的公知常識的一部分。
[0120] 在描述本發(fā)明的上下文中（尤其是在下述權(quán)利要求的上下文中），術(shù)語"一個"和 "一種"和"該/所述"W及類似指示物的使用應解釋為涵蓋單數(shù)和復數(shù)兩者，除非本文另有 說明或上下文明顯矛盾。術(shù)語"包含"、"具有"、"包括"和"含有"應解釋為開放式術(shù)語(即，意 指"包括但不限于"），除非另有說明。本文值范圍的敘述僅預期充當個別提及落入該范圍內(nèi) 的每個分開值的速記方法，除非本文另有說明，并且每個分開值并入說明書內(nèi)，如同它在本 文中個別敘述一樣。本文描述的所有方法均可W任何合適的次序執(zhí)行，除非本文另有說明 或上下文明顯矛盾。本文提供的任何和所有例子或示例性語言（如"例如"）的使用僅預期更 好地舉例說明本發(fā)明，并且不對本發(fā)明的范圍造成限制，除非另有說明。說明書中的語言不 應解釋為指示任何未請求保護的元件作為本發(fā)明實踐必需的。
[0121] 本發(fā)明的優(yōu)選實施例在本文中描述，包括本發(fā)明人已知用于進行本發(fā)明的最佳方 式。在閱讀前述說明書后，運些優(yōu)選實施例的變化對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可W變得顯而 易見。本發(fā)明人預期技術(shù)人員在適當時采用此類變化，并且本發(fā)明人預期本發(fā)明W與如本 文具體描述外的其他方式進行實踐。相應地，本發(fā)明包括如由可應用法律許可的與之附著 的權(quán)利要求中所述的主題的所有修飾和等價物。此外，在其所有可能變化中的上述元件的 任何組合由本發(fā)明涵蓋，除非本文另有說明或上下文明顯矛盾。
【主權(quán)項】
1. 一種重組產(chǎn)乙酸、一氧化碳營養(yǎng)細菌，其缺乏仲醇脫氫酶或包含失活的仲醇脫氫酶。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的細菌，其中所述細菌是梭菌屬的成員。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的細菌，其中所述細菌來源于選自自產(chǎn)乙醇梭菌、揚氏梭菌和拉 氏梭菌的細菌。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的細菌，其中所述自產(chǎn)乙醇梭菌是在DSMZ登錄號DSM23693下保 藏的自產(chǎn)乙醇梭菌。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的細菌，其中所述失活的仲醇脫氫酶是失活的伯-仲醇脫氫酶。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的細菌，其中所述失活的仲醇脫氫酶來源于包含SEQ ID NO: 1的 氨基酸序列的仲醇脫氫酶。7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的細菌，其中所述失活的仲醇脫氫酶由包含失活突變的仲醇脫 氫酶基因編碼。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的細菌，其中包含失活突變的所述仲醇脫氫酶基因來源于SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的核酸序列。9. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的細菌，其中所述失活突變是插入。10. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的細菌，其中所述細菌還包含編碼硫解酶、CoA-轉(zhuǎn)移酶和乙酰 乙酸脫羧酶中的一種或多種的外源基因。11. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的細菌，其中所述細菌還包含編碼丙二醇脫水酶的外源基因， 所述丙二醇脫水酶將內(nèi)消旋-2，3-丁二醇轉(zhuǎn)換為MEK。12. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的細菌，其中所述丙二醇脫水酶是產(chǎn)酸克雷伯氏菌丙二醇脫 水酶。13. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的細菌，其中所述細菌產(chǎn)生丙酮和MEK中的一種或多種。14. 一種生產(chǎn)丙酮的方法，所述方法包括培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求1所述的細菌，由此所述細 菌產(chǎn)生丙酮。15. 根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其還包括從培養(yǎng)物中回收所述丙酮。16. -種生產(chǎn)MEK的方法，所述方法包括培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求1所述的細菌，由此所述細菌 產(chǎn)生MEK。17. 根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其還包括從培養(yǎng)物中回收所述MEK。
【文檔編號】C12P7/62GK105874057SQ201480072228
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2014年12月3日
【發(fā)明人】A·P·穆勒, M·科普克, B·艾爾-辛那維, R·O·延森, R·E·希爾
【申請人】朗澤科技新西蘭有限公司