一種利用非遺傳物質(zhì)對植物基因組進行定點改造的方法【專利摘要】本發(fā)明公開了一種利用非遺傳物質(zhì)對植物基因組進行定點改造的方法。本發(fā)明所提供的方法包括如下步驟：向目的植物的細胞或組織或植物體部位中導(dǎo)入非遺傳物質(zhì)，所述非遺傳物質(zhì)為特異于所述靶標片段的核酸酶或表達所述核酸酶的mRNA，在所述核酸酶的作用下，所述靶標片段被剪切，再通過所述植物的自身DNA修復(fù)，完成對所述靶標片段的定點改造。本發(fā)明通過導(dǎo)入特異性核酸酶的非遺傳物質(zhì)不僅實現(xiàn)了對植物基因的定點突變，而且利用核酸酶的非遺傳物質(zhì)產(chǎn)生的突變體中沒有任何外來基因或核酸片段的導(dǎo)入和整合，在基因組功能研究上更具有準確性，在生產(chǎn)上更具有較高的生物安全性?！緦＠f明】一種利用非遺傳物質(zhì)對植物基因組進行定點改造的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
[0001]本發(fā)明屬于植物基因工程領(lǐng)域，涉及一種利用非遺傳物質(zhì)對植物基因組進行定點改造的方法，具體涉及一種通過蛋白或mRNA來實現(xiàn)非轉(zhuǎn)基因的植物基因組定點改造的方法?！?br>背景技術(shù)：
】[0002]基因組編輯技術(shù)是目前解析基因功能和進行作物遺傳改良的最具潛力的技術(shù)手段。目前的基因組編輯技術(shù)包括鋅指核酸酶(Zincfingernuclease，ZFN)、類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶（Transcriptionactivator-likeeffectornuclease,TALEN)和成族的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列及其相關(guān)系統(tǒng)（Clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats/CRISPRassociated，CRISPR/Cas9system)，統(tǒng)稱為序列特異性核酸酶（sequence-specificnucleases)。它們的共同特征是能夠作為核酸內(nèi)切酶切割特定的DNA序列，創(chuàng)造DNA雙鏈斷裂(Double-strandbreakJSBhDSB能夠激活細胞內(nèi)固有的修復(fù)機制非同源末端連接（Non-homologousendjoining，NHEJ)和同源重組（Homologousrecombination，HR)對細胞中的DNA損傷進行修復(fù)。從而產(chǎn)生基因（或DNA片段)定點替換或者插入突變體。目前，基因編輯技術(shù)對植物基因組的改造已經(jīng)在部分植物獲得了有效的利用(例如，水稻，擬南芥，玉米，小麥等），特別是對重要的農(nóng)作物農(nóng)業(yè)性狀的分子改良表現(xiàn)出巨大的潛力。[0003]然而，在基因組編輯技術(shù)對作物的性狀改良帶來的革命性機遇的同時，也呈現(xiàn)出了一個重要的挑戰(zhàn)。序列核酸酶能在植物基因組編輯的前提是將其在細胞內(nèi)表達，目前，將序列核酸酶在植物細胞表達的方法是通過傳統(tǒng)的遺傳轉(zhuǎn)化方法(農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法，基因槍轉(zhuǎn)化法，注射法等)將核酸酶的表達載體或有效表達核酸酶的DNA片段送入到細胞中，這些遺傳物質(zhì)隨機整合在植物染色體上進行轉(zhuǎn)錄表達實現(xiàn)對靶位點的編輯。由于這些傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)化方法涉及到外源基因先要整合到植物基因組中，而且轉(zhuǎn)化的過程需要添加篩選標記(選擇壓力），這使得利用基因組編輯技術(shù)獲得的產(chǎn)物可能會產(chǎn)生不必要的表型以及在轉(zhuǎn)基因調(diào)控方面也會受到很大的局限。因此，很有必要建立一個不需要導(dǎo)入DNA遺傳物質(zhì)來實現(xiàn)對植物基因組編輯的方法，使基因組編輯技術(shù)在植物基因組功能研究以及性狀的分子改良上發(fā)揮更大的優(yōu)勢?！?br/>發(fā)明內(nèi)容】[0004]本發(fā)明的目的是提供一種對植物目的基因中靶標片段進行定點改造的方法。[0005]本發(fā)明所提供的對植物目的基因中靶標片段進行定點改造的方法，具體包括如下步驟：向目的植物的細胞或組織或植物體部位中導(dǎo)入非遺傳物質(zhì)，所述非遺傳物質(zhì)為特異于所述靶標片段的核酸酶或表達所述核酸酶的mRNA，在所述核酸酶的作用下，所述靶標片段被剪切，再通過所述植物的自身DNA修復(fù)，完成對所述靶標片段的定點改造。[0006]向所述目的植物的細胞或組織或植物體部位中導(dǎo)入所述非遺傳物質(zhì)，這些非遺傳物質(zhì)可以直接表達核酸酶進行對所述靶標片段的定點改造或這些非遺傳物質(zhì)直接能夠作用到所述靶標片段對其進行定點改造，這些非遺傳物質(zhì)在行使對所述靶標片段的定點改造的同時或之后會被細胞內(nèi)的代謝機制降解，而被定點改造的細胞或組織在正常的組織培養(yǎng)下再生成植株，最終實現(xiàn)只有所述靶標片段被改造，而沒有任何外源遺傳物質(zhì)引入的非轉(zhuǎn)基因突變體植物。[0007]其中，所述核酸酶為TALEN核酸酶、鋅指核酸酶、CRISPR/Cas9核酸酶或所有能實現(xiàn)基因組編輯的核酸酶；[0008]相應(yīng)的，所述非遺傳物質(zhì)可為如下(a)-(c)中任一種：[0009](a)所述非遺傳物質(zhì)為所述TALEN核酸酶，或能表達成對TALEN蛋白的mRNA;所述TALEN蛋白由能夠識別所述靶標片段并與其結(jié)合的DNA結(jié)合域和FokI結(jié)構(gòu)域組成。[0010]在本發(fā)明的一個實施方式(實施例1)中，所述非遺傳物質(zhì)具體為序列表中SEQIDN0:3和SEQIDN0:4所示的mRNA;在本發(fā)明的另一個實施方式(實施例2)中，所述非遺傳物質(zhì)具體為序列表中SEQIDN0:7和SEQIDN0:8所示的蛋白質(zhì)。[0011](b)所述非遺傳物質(zhì)為鋅指核酸酶，或能表達成對ZFN蛋白的mRNA;所述ZFN蛋白由能夠識別所述靶標片段并與其結(jié)合的DNA結(jié)合域和FokI結(jié)構(gòu)域組成。[0012](c)所述非遺傳物質(zhì)由Cas9蛋白或能表達Cas9蛋白的mRNA和向?qū)NA組成;所述向?qū)NA為由crRNA和tracrRNA通過部分堿基配對結(jié)合而成的具有回文結(jié)構(gòu)的RNA;所述crRNA含有能夠與所述靶標片段互補結(jié)合的RNA片段。[0013]在本發(fā)明的一個實施方式(實施例3)中，所述非遺傳物質(zhì)具體為SEQIDN0:10所示的蛋白質(zhì)和SEQIDNO:11所示的sgRNA;在本發(fā)明的另一個實施方式(實施例4)中，所述非遺傳物質(zhì)具體為SEQIDN0:10所示的蛋白質(zhì)和SEQIDN0:12所示的sgRNA。[0014]在所述方法中，所述細胞可為任何能導(dǎo)入所述非遺傳物質(zhì)并能經(jīng)過組織培養(yǎng)再生為完整植株的細胞;所述組織可為任何能導(dǎo)入所述非遺傳物質(zhì)并能經(jīng)過組織培養(yǎng)再生為完整植株的組織，所述植物體部位為任何能導(dǎo)入非遺傳物質(zhì)的存在于整株植物上植物體部位(并非離體的植物體部位）。[0015]具體而言，所述細胞可為原生質(zhì)體細胞或懸浮細胞;所述組織可為愈傷組織、幼胚、成熟胚;所述植物體部位包括葉片、莖尖、花粉管、幼穗或下胚軸。[0016]在所述方法中，向所述目的植物的細胞或組織或植物體部位中導(dǎo)入所述非遺傳物質(zhì)的方法為基因槍法、PEG誘導(dǎo)原生質(zhì)體法、花粉管通道法或其他任何能夠?qū)胨龇沁z傳物質(zhì)的導(dǎo)入方法。[0017]在所述方法中，所述定點改造為:對所述靶標片段的核苷酸進行插入突變、缺失突變和/或替換突變。[0018]本發(fā)明的另一個目的是提供一種培育非轉(zhuǎn)基因突變植物的方法。[0019]本發(fā)明所提供的培育非轉(zhuǎn)基因突變植物的方法，具體可包括如下步驟:采用如上所述方法對目的植物的目的基因中的靶標片段進行定點改造，進而獲得所述目的基因功能喪失或改變、且基因組中未整合任何外源基因的植物。[0020]在本發(fā)明中，所述植物既可為單子葉植物，也可雙子葉植物。[0021]在本發(fā)明的實施例中，所述植物具體為水稻、玉米、小麥或煙草。[0022]相對于遺傳物質(zhì)DNA來說，蛋白和mRNA是兩種非遺傳物質(zhì)，在細胞內(nèi)很容易被細胞自身的防御機制降解。本發(fā)明通過將序列特異核酸酶的mRNA或蛋白瞬時導(dǎo)入的方法，可以保證序列特異核酸酶基因或載體片段不整合到植物基因組，同時還可以獲得基因定點敲除突變體，實現(xiàn)真正意義上的無轉(zhuǎn)基因操作。本發(fā)明具有較高的生物安全性，該技術(shù)創(chuàng)制的作物品種不會受轉(zhuǎn)基因調(diào)控的影響，有著不可估量的基礎(chǔ)理論研究意義和育種生產(chǎn)應(yīng)用價值?！靖綀D說明】[0023]圖1為Cas9mRNA和sgRNA轉(zhuǎn)化小麥未成熟幼胚產(chǎn)生TaGW2基因突變。A，利用mRNA轉(zhuǎn)錄試劑盒(AM1344，Ambion)體外轉(zhuǎn)錄Cas9-mRNA的電泳結(jié)果。B，利用PCR/RE檢測T0代植物Cas9mRNA和sgRNA-GW2-C14對TaGW2靶位點的突變。C，測序結(jié)果表明體外轉(zhuǎn)錄的Cas9-mRNA和sgRNA-GW2-C14在靶位點處誘導(dǎo)產(chǎn)生了突變。C中，WT表示野生型基因序列，表示發(fā)生了刪除突變的序列，"+"表示發(fā)生了插入突變的序列，后邊的數(shù)字表示刪除或插入的核苷酸的數(shù)量。[0024]圖2為mRNA-TALEN瞬時轉(zhuǎn)化水稻原生質(zhì)體產(chǎn)生0sBADH2基因突變。A，利用mRNA轉(zhuǎn)錄試劑盒(Ambion)在體外分別轉(zhuǎn)錄T-BADH2b-L和T-BADH2b-R，并在mRNA的3'末端加PolyA尾巴的電泳結(jié)果。B，利用PCR/RE在原生質(zhì)體檢測體外轉(zhuǎn)錄的mRNA對靶位點的突變。C，測序結(jié)果表明體外轉(zhuǎn)錄的mRNA在靶位點處誘導(dǎo)產(chǎn)生了突變。C中，WT表示野生型基因序列，表示發(fā)生了刪除突變的序列，"+"表示發(fā)生了插入突變的序列，后邊的數(shù)字表示刪除或插入的核苷酸的數(shù)量。[0025]圖3為ML0-TALEN蛋白轉(zhuǎn)化小麥原生質(zhì)體對小麥基因ML0進行突變。A，利用原核表達體系表達和純化ML0靶位點的T-ML0-L和T-ML0-R，以及SDS-PAGE檢測的結(jié)果。B，利用PCR/RE在原生質(zhì)體中檢測體TALEN蛋白對靶位點的突變。C，測序結(jié)果表明體外TALEN蛋白對靶位點處誘導(dǎo)產(chǎn)生了突變。C，WT表示野生型基因序列，表示發(fā)生了刪除突變的序列，"+"表示發(fā)生了插入突變的序列，后邊的數(shù)字表示刪除或插入的核苷酸的數(shù)量。[0026]圖4為Cas9蛋白和體外轉(zhuǎn)錄的sgRNA共轉(zhuǎn)化小麥原生質(zhì)體對小麥基因TaGASR7進行突變。A，利用原核表達體系表達和純化Cas9蛋白的SDS-PAGE檢測的結(jié)果。B，利用PCR/RE在原生質(zhì)體中檢測體Cas9蛋白和體外轉(zhuǎn)錄的sgRNA對靶位點的突變。C，測序結(jié)果表明體外Cas9蛋白和體外轉(zhuǎn)錄的sgRNA對靶位點處誘導(dǎo)產(chǎn)生了突變。C，WT表示野生型基因序列，表示發(fā)生了刪除突變的序列，"+"表示發(fā)生了插入突變的序列，后邊的數(shù)字表示刪除或插入的核苷酸的數(shù)量。[0027]圖5為Cas9蛋白和體外轉(zhuǎn)錄的sgRNA共轉(zhuǎn)化煙草原生質(zhì)體對基因NtPVY進行突變并通過原生質(zhì)體再生獲得突變植物。A，利用PCR/RE在原生質(zhì)體中檢測體Cas9蛋白和體外轉(zhuǎn)錄的sgRNA對靶位點的突變。B，測序結(jié)果表明體外Cas9蛋白和體外轉(zhuǎn)錄的sgRNA共轉(zhuǎn)化煙草原生質(zhì)體對靶位點處誘導(dǎo)產(chǎn)生了突變。C，利用PCR/RE檢測原生質(zhì)質(zhì)體再生獲得有突變的植物以及對靶位點測序的結(jié)果。WT表示野生型基因序列，表示發(fā)生了刪除突變的序列，"+"表示發(fā)生了插入突變的序列，后邊的數(shù)字表示刪除或插入的核苷酸的數(shù)量?！揪唧w實施方式】[0028]下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。[0029]下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。[0030]小麥品種Bobwhite:在文獻"馬建華等.GUS基因瞬時表達檢測小麥lAy基因啟動子功能.《山西農(nóng)業(yè)大學學報（自然科學版)》2014年第06期"中公開過，公眾可從中國科學院遺傳與發(fā)育生物學研究所獲得。[0031]小麥TaMLO基因靶向TALEN載體T-ML0:在文獻"Wang，Y.，Cheng，X.，Shan，Q.，Zhang，Y·，Liu，J·，Gao，C·，andQiu,J.L.(2014).Simultaneouseditingofthreehomoeoallelesinhexaploidbreadwheatconfersheritableresistancetopowderymildew.NatureBiotechnology·32,947-951"中公開過，公眾可從中國科學院遺傳與發(fā)育生物學研究所獲得。[0032]原核表達載體PGEX-4T:上海北諾生物科技有限公司產(chǎn)品，貨號為1110024。[0033]Cas9-mRNA體外轉(zhuǎn)錄載體pXT7-Cas9:在文獻"ChangN，SunC，GaoL，ZhuD，XuX，etal.2013.GenomeeditingwithRNA-guidedCas9nuc1easeinzebrafishembryos.Cellresearch23:465-72"中公開過，公眾可從文章作者處獲得。[0034]pT7_gRNA載體：在文獻"Aprogrammabledual-RNA-guidedDNAendonucleaseinadaptivebacterialimmunity.Science337(6096):816-821."中公開過，公眾可從中國科學院遺傳與發(fā)育生物學研究所獲得。[0035]玉米品種Hill:在文獻"Armstrong，C.L.，Green，C.E.&Phillips，R.L.DevelopmentandavailabilityofgermplasmwithhightypeIIcultureformationresponse.MaizeGenet.Coop.NewsLett.65,92-93(1991)"中公開過，公眾可從中國科學院遺傳與發(fā)育生物學研究所獲得。[0036]水稻原生質(zhì)體制備和轉(zhuǎn)化所用溶液如表1-表5所示。[0037]表1:50ml酶解液[0039]表2:500mlW5[0041]表3:10mlMMG溶液[0044]表4:4mlPEG溶液[0046]表5:250mlWI溶液[0047][0048]上述表1-表5中的％表不質(zhì)量體積百分含量，g/lOOml。[0049]小麥組織培養(yǎng)所用培養(yǎng)基如下：[0050]高滲培養(yǎng)基:MS基本培養(yǎng)基、90g/L甘露醇、5mg/L2,4-D、30g/L蔗糖和3g/L植物凝膠，pH值為5.8。[0051]誘導(dǎo)培養(yǎng)基:MS基本培養(yǎng)基、2mg/L2，4-D、0·6mg/L硫酸銅、0·5mg/L水解酪蛋白、30g/L蔗糖和3g/L植物凝膠，pH值為5.8。[0052]分化培養(yǎng)基:MS基本培養(yǎng)基、0.2mg/L激動素、30g/L蔗糖和3g/L植物凝膠，pH值為5.8〇[0053]生根培養(yǎng)基：1/2的MS基本培養(yǎng)基、0.5mg/L乙磺酸、0.5mg/La-萘乙酸、30g/L蔗糖和3g/L植物凝膠，pH值為5.8。[0054]實施例1、利用體外轉(zhuǎn)錄的Cas9mRNA和sgRNA轉(zhuǎn)化小麥未成熟幼胚，對TaGW2基因進行定點突變[0055]一、革巴標片段target_C14的設(shè)計[0056]Target-C14:5'-CCAGGATGGGGTATTTCTAGAGG-3'（位于小麥TaGW2A、B、D組的第8外顯子的保守區(qū)）；[0057]二、Cas9_mRNA的體外轉(zhuǎn)錄及純化[0058]1.將pXT7_Cas9載體用Xbal進行酶切，將酶切產(chǎn)物用純化試劑盒進行純化(Axygen)，濃度要求在lOOng/μΙ以上，命名為pXT7-Cas9_XbaI。[0059]2.將純化產(chǎn)物pXT7-Cas9-XbaI用體外轉(zhuǎn)錄試劑盒(AM1344，Ambion)進行轉(zhuǎn)錄，利用mRNA純化試劑盒(AM1908，Ambion)進行純化，得到的濃度為500ng/yl以上。體外轉(zhuǎn)錄的Cas9-mRNA瓊脂糖凝膠電泳如圖1A所示。[0060]三、靶位點sgRNA的體外轉(zhuǎn)錄[0061]1·將TaGW2的靶位點構(gòu)建在pTaU6_gRNA載體上[0062]合成下述帶有粘性末端(下劃線部分)的單鏈引物：[0063]C14F:5'-CTTGCAGGATGGGGTATTTCTAG-3'；[0064]C14R:5'-AAACCTAGAAATACCCCATCCTG-3'。[0065]經(jīng)過引物退火程序形成有粘性末端的雙鏈DNA，插入到pTaU6-gRNA質(zhì)粒的兩個BbsI酶切位點之間，即得含有C14的pTaU6-gRNA質(zhì)粒，質(zhì)粒經(jīng)測序驗證陽性質(zhì)粒，SP在pTaU6-gRNA質(zhì)粒的酶切位點Bbsl處正向插入5'-CTTGCAGGATGGGGTATTTCTAG-3'所示DNA片段后得到的重組質(zhì)粒為陽性，命名為pTaU6-gRNA-Cl4。[0066]2·T7-TaGW2-gRNA的DNA片段的體外擴增及純化[0067]設(shè)計引物[0068]T7-TaGW2-F：TAATACGACTCACTATAGGCAGGATGGGGTATTTCTAG[0069]gRNA-PCR-R：AGCACCGACTCGGTGCCACTT[0070]以PTaU6-gRNA-C14為模板進行PCR擴增，將得到的PCR產(chǎn)物用PCR純化試劑盒進行純化（4?-6乂-2506^178611)，濃度要求在100叫/^1以上。所獲得的？01?產(chǎn)物為含有T7promoter及TaGW2靶位點的sgRNA，命名為T7-TaGW2-gRNA[0071]3.含有TaGW2的靶位點的sgRNA的體外轉(zhuǎn)錄[0072]利用NEB公司的T7體外轉(zhuǎn)錄試劑盒（E2040S，NEB)轉(zhuǎn)錄試劑盒在體外轉(zhuǎn)錄合成sgRNA-GW2-C14(如序列表中SEQID從)：17所示）。[0073]四、利用基因槍法轉(zhuǎn)化體外轉(zhuǎn)錄的Cas9_mRNA和體外轉(zhuǎn)錄的sgRNA對小麥TaGW2基因進行定點編輯.[0074]1.0.6nm金粉裝載體外轉(zhuǎn)錄的Cas9_mRNA和體外轉(zhuǎn)錄的sgRNA[0075]將5μ10.6nm金粉、3μ1Cas9-mRNA、lylsgRNA-GW2-C14、lyl5M乙酸銨、20μ1異丙醇進行混合，在-20°C沉淀lh，使Cas9-mRNA和sgRNA-GW2-C14附著于金粉上，lOOOrpm瞬時離心5秒，去上清，用100μΙ無水乙醇進行清洗。lOOOrpm再次瞬時離心5秒，去上清，用20μ1無水乙醇重懸。[0076]2.利用基因槍轉(zhuǎn)化小麥受體材料[0077]1)取小麥品種ΚΝ199幼胚用高滲培養(yǎng)基進行高滲處理4小時；[0078]2)使用基因槍對經(jīng)步驟1)所述高滲培養(yǎng)的小麥幼胚進行轟擊，將20μ1的sgRNA-Cas9-mRNA混合物裝載在載樣膜上;利用基因槍進行轟擊，每次所述轟擊的轟擊距離為6cm，轟擊壓力為llOOpsi，轟擊直徑為2cm〇[0079]3)將經(jīng)步驟2)所述轟擊的小麥幼胚進行高滲培養(yǎng)16小時；[0080]4)將經(jīng)步驟3)所述高滲培養(yǎng)的小麥幼胚依次進行14天愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)、28天分化培養(yǎng)和14-28天生根培養(yǎng)，獲得小麥植株。[0081]5)將經(jīng)步驟4)產(chǎn)生的小麥幼苗提取DNA，經(jīng)PCR/RE檢測基因定點敲除的突變體(具體方法參見步驟四進行）。同時設(shè)置野生型小麥品種KN199作為對照。由于小麥內(nèi)源基因TaGW2的靶標片段上存在限制性內(nèi)切酶Xbal的識別序列，因而實驗中采用限制性內(nèi)切酶Xbal進行PCR/RE檢測實驗。其中，PCR擴增所用引物為A、B、D組的特異引物，序列如下：[0082]TaGW2-AF:5'-CTGCCATTACTTTGTATTTTGGTAATA-3'；[0083]TaGW2-BF:5'-GTTCAGATGGCAATCTAAAAGTT-3'；[0084]TaGW2-DF:5'-GCATGTACTTTGATTGTTTGCGTGA-3'；[0085]TaGW2-R:5'-TCCTTCCTCTCTTACCACTTCCC-3'[0086]部分突變體的檢測結(jié)果顯示，在小麥TaGW2基因靶位點發(fā)生了突變，回收測序圖中的條帶，測序結(jié)果表明在TaGW2基因的靶位點都發(fā)生了堿基插入/刪除類型的突變（圖1B和〇〇[0087]實施例2、利用體外轉(zhuǎn)錄的TALEN的mRNA轉(zhuǎn)化水稻原生質(zhì)體對0sBADH2基因進行定點突變[0088]一、TALEN革巴標片段[0089]水稻基因BADH2的序列如序列表中SEQIDN0:1所示。[0090]TALEN祀標片段為水稻基因BADH2的第四外顯子上，序列如下：[0091]5'-GCTGGATGCTTTGAGTActttgcagatcttgcagaATCCTTGGACAAAAGGC-3'（序列表SEQIDNO:1的第1589位至第1640位）；其中的小寫字母為間隔序列，兩側(cè)大寫字母為TALEN模塊識別序列(分別命名為L-b和R-b);下劃線為BglΠ的酶切識別序列。[0092]二、TALEN編碼基因的設(shè)計與合成[0093]將以靶序列中的L-b為模塊識別序列的TALEN命名為T-BADH2b-L，該核酸酶的編碼基因序列如序列表SEQIDN0:2中第7-2952位所示，其中，序列表SEQIDN0:2的第7-27位編碼核定位信號NLS，第463-2154位編碼L-b序列識別模塊蛋白，第2350-2952位(603bp)編碼內(nèi)切核酸酶FokI;[0094]將以靶序列中的R-b為模塊識別序列的TALEN命名為T-BADH2b-R，該核酸酶的編碼基因序列如序列表SEQIDN0:2中第3085-6018位所示，其中，序列表SEQIDN0:2的第3085-3105位編碼核定位信號NLS，第3541-5232位編碼R-b序列識別模塊蛋白，第5428-6018位(591bp)編碼內(nèi)切核酸酶FokI;[0095]序列表中SEQIDN0:2的第2953-3006位編碼T2A，由18個氨基酸組成，使T-BADH2b-L和T-BADH2b-R在同一個表達盒中表達時斷開形成兩個蛋白。[0096]三、TALEN基因mRNA的體外合成[0097]將水稻BADH2基因的TALEN的兩個組成模塊T-BADH2b-L和T-BADH2b-R的分別用T7啟動子啟動，利用mRNA轉(zhuǎn)錄試劑盒(Ambion)在體外分別轉(zhuǎn)錄T-BADH2b-L和T-BADH2b-R，即獲得mRNA-L-T-〇sBADH2b和mRNA-R-T-〇sBADH2b(圖1中A)，并在mRNA的3'末端加PolyA尾巴以提高mRNA的穩(wěn)定性。[0098]mRNA-L-T-〇sBADH2b的序列為序列表中SEQIDN0:3，mRNA-R-T-0sBADH2b的序列為序列表中SEQIDN0:4。[0099]四、將體外轉(zhuǎn)錄的兩部分TALEN的mRNA混合系統(tǒng)導(dǎo)入至水稻原生質(zhì)體[0100]1.材料準備[0101]水稻品種為日本晴，種子先用75%乙醇漂洗1分鐘，再用2.5%次氯酸鈉處理20分鐘，無菌水洗滌5次以上。放在1/2MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)7~10天，26°C，12h光照（150μπιο1·πΓ2·s^1)。使用大玻璃培養(yǎng)杯培養(yǎng)，每瓶可放15粒種子。40~60株幼苗可以做一次實驗，分離出的原生質(zhì)體量可以轉(zhuǎn)化大約6個質(zhì)粒。[0102]2.原生質(zhì)體分離[0103]1)選取幼苗莖干和葉鞘部分分離原生質(zhì)體，用鋒利的刀片切成大約0.5mm寬的條塊，可以20~30個放在一起切開；[0104]2)切開后立刻轉(zhuǎn)移到0.6M甘露醇溶液中，避光放置10分鐘；[0105]3)過濾掉甘露醇溶液，將其轉(zhuǎn)移到配好的酶解液中，避光，真空栗-15~-20(mmHg)抽真空30分鐘；[0106]4)再避光酶解4~5小時，同時緩慢搖動(脫色搖床，速度10);[0107]5)酶解結(jié)束后，加入等體積的W5溶液，稍有力地用手水平搖動10秒鐘，釋放原生質(zhì)體；[0108]6)使用40μπι尼龍膜過濾原生質(zhì)體到50ml的圓底離心管中，再加W5溶液沖洗條塊；[0109]7)250g水平離心3分鐘沉淀原生質(zhì)體，用5ml移液器吸出上清；[0110]8)加10mlW5重懸原生質(zhì)體，250g離心3分鐘，棄上清；[0111]9)加適量MMG溶液重懸，原生質(zhì)體濃度為2X106/ml，血球計數(shù)器計數(shù)。[0112]注：以上所有步驟在室溫進行。[0113]3.原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化[0114](1)加入等比例的mRNA-L-T-〇sBADH2b和mRNA-R-T-〇sBADH2b各10yg到2ml離心管中，加入200μ1原生質(zhì)體(大約4X105細胞），再加入220μ1新配的PEG溶液，混勻，室溫避光放置10~20分鐘誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化；[0115](2)誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化結(jié)束后緩慢加880μ1W5溶液，輕輕顛倒混勻，250g水平離心3分鐘，棄上清；[0116](3)加lmlWI溶液重懸，轉(zhuǎn)移到六孔板中（已預(yù)先加入lmlWI溶液)室溫(或28°C)暗處培養(yǎng)6~16小時，若用于提取原生質(zhì)體基因組DNA，需培養(yǎng)48小時。[0117](4)PCR/RE實驗分析體外轉(zhuǎn)錄的TALEN對水稻內(nèi)源基因BADH2的突變結(jié)果[0118]原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化后48小時提取基因組DNA，以該DNA為模板，進行PCR/RE(PolymeraseChainReaction/Restrictiondigestion)實驗分析。同時設(shè)置野生型水稻品種日本晴的原生質(zhì)體作為對照。PCR/RE分析方法參考了文獻Shan,Q.etal.RapidandefficientgenemodificationinriceandBrachypodiumusingTALENs.MolecularPlant(2013)，由于水稻內(nèi)源基因BADH2的靶標片段上存在限制性內(nèi)切酶Bgin的識別序列，因而實驗中采用限制性內(nèi)切酶Bgin進行PCR/RE檢測實驗。其中，PCR擴增所用引物為：[0119]OsBADH-F:5'-GATCCCGCAGCGGCAGCTCTTCGTCG-3'；[0120]0sBADH2-R:5'-GAGGAATAAAATCTCAAATGTCTTCAACTT-3'。[0121]PCR/RE實驗分析結(jié)果見圖1中B，結(jié)果表明在BADH2基因靶位點發(fā)生了突變，突變效率約為5%，回收測序圖中的條帶，測序結(jié)果表明在BADH2基因的靶位點都發(fā)生了堿基插入/刪除（insertion/deletion，indel)類型的突變（圖2中C)〇[0122]實施例3、利用原核表達系統(tǒng)表達和純化TALEN蛋白并轉(zhuǎn)入小麥原生質(zhì)體或幼胚對ML0基因進行定點突變[0123]一、選擇靶序列并設(shè)計TALENs[0124]將小麥源ML0基因的第二個外顯子的一個保守區(qū)作為靶序列，設(shè)計一對TALENs(由TAL-ML0-L蛋白和TAL-ML0-R蛋白組成;TAL-ML0-L蛋白包括兩個功能區(qū)段，即與靶序列上游部分核苷酸特異結(jié)合的片段和EL突變型FokI核酸內(nèi)切酶;TAL-ML0-R蛋白包括兩個功能區(qū)段，即與靶序列下游部分核苷酸特異結(jié)合的片段和KK突變型FokI核酸內(nèi)切酶），該TALENs對TaML〇-A基因、TaML〇-B基因和TaML〇-D基因的靶序列分別如下：[0131]在小麥細胞中，TALEN蛋白TAL-L片段和TAL-R片段分別與各自的結(jié)合區(qū)結(jié)合后，兩個不同單體形式的FokI核酸內(nèi)切酶(EL突變型FokI核酸內(nèi)切酶和KK突變型FokI核酸內(nèi)切酶)形成具有活性的FokI二聚體核酸內(nèi)切酶，在靶序列區(qū)域(包括靶序列及其側(cè)翼序列）進行切割，產(chǎn)生一個雙鏈斷裂的缺口，細胞自發(fā)修復(fù)該缺口的過程中會引入大量突變(本處"突變"指的是廣義突變，包括插入、缺失、狹義突變等形式，這些突變中絕大多數(shù)為基因功能失活突變）。[0132]上述靶序列中，下劃線部分為Avan酶切識別序列，可以被限制性內(nèi)切酶Avail切害J。靶序列區(qū)域被切割后:如果發(fā)生了突變，則Avail酶切識別序列被破壞，將不能被限制性內(nèi)切酶Avail切割;如果沒有發(fā)生突變，將可以被限制性內(nèi)切酶Avail切割。[0133]二、利用原核表達系統(tǒng)表達和純化ML0基因靶位點的TALEN蛋白[0134]1.表達TALEN蛋白的原核表達載體構(gòu)建[0135]1)將TALEN基因的兩部分TAL-L和TAL-R的編碼區(qū)（TAL-L編碼區(qū)序列為序列表中SEQIDN0:5，TAL-R編碼區(qū)序列為序列表中SEQIDN0:6)分別構(gòu)建在原核表達載體pGEX-4T上，獲得在pGEX-4T載體的酶切位點BamHI和Xbal之間正向插入SEQIDN0:5K*TAL-US碼區(qū)，同時在酶切位點Xbal和BamHI之間正向插入SEQID如:6所示丁41^編碼區(qū)的重組載體，轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21，陽性克隆接種至含有氨芐青霉素和氯霉素的LB培養(yǎng)基中，37°C過夜培養(yǎng)，然后將培養(yǎng)物按1:100接種至5ml新鮮LB液體培養(yǎng)基中，在37°C225rpm的搖床中培養(yǎng)至0D600?0.5時，取lml菌液作為未誘導(dǎo)的陰性對照，同時設(shè)立只含有pGEX-4T質(zhì)粒DNA空載體的誘導(dǎo)及未誘導(dǎo)的對照，向剩余培養(yǎng)液加入IPTG(終濃度為lmM)，37°C225rpm誘導(dǎo)培養(yǎng)8h〇[0136]2)取對照以及誘導(dǎo)的菌液各lml，12000g離心10min收集菌體，棄上清液，加入蛋白質(zhì)上樣緩沖液50yL，重懸，煮沸7min，上清液用10%SDS-PAGE電泳檢測。每一個TALEN蛋白的分子量約為lOOKDaJAL-MLO-L蛋白的氨基酸序列為序列表中SEQIDN0:7**，TAL-ML0-R蛋白的氨基酸序列為序列表中SEQIDN0:8所示。[0137]2.TALEN蛋白的純化[0138]收集培養(yǎng)菌液，4°C離心10分鐘，收集沉淀的菌體。向沉淀中加入10ml破碎緩沖液(pH8.5的50mMTris-HCl，2mMEDTA，100mMNaCl，lmg/ml溶菌酶）在冰上混合45分鐘，然后經(jīng)超聲破碎、離心收集沉淀，破碎離心的沉淀用4M咪唑清洗包涵體，再離心所得沉淀用pH7·4的50mM磷酸緩沖液(含8M脲素)溶解(圖3A)。[0139]三、將純化的TALEN蛋白導(dǎo)入小麥原生質(zhì)體對ML0基因進行定點編輯[0140]將純化的ML0基因的靶位點的TALEN蛋白通過PEG誘導(dǎo)法導(dǎo)入至小麥品種Bobwhite的原生質(zhì)體，具體過程如下：[0141]1.小麥苗的種植[0142]小麥種子種于培養(yǎng)室，溫度25±2°C，光照度1000Lx，光照14~16h/d的條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)時間約1-2周。[0143]2.原生質(zhì)體分離[0144]1)取小麥幼嫩的葉片，用刀片將其中間部分切成0.5-lmm的絲，放入0.6M的甘露醇溶液(溶劑為水）中避光處理10分鐘，再用濾網(wǎng)過濾，將其放入50ml酶解液中消化5小時（先抽真空酶解0.5h，再lOrmp緩慢搖晃4.5h)。[0145]注:酶解溫度要保持在20-25°C，且要避光，酶解完輕輕搖晃酶解液，使原生質(zhì)體釋放出來。[0146]2)加10mlW5稀釋酶解產(chǎn)物，用75μπι尼龍濾膜過濾酶解液于50ml圓底離心管中。[0147]注:尼龍濾膜要浸泡在75%(體積分數(shù))酒精里，用時要用水沖洗，再用W5浸泡2min再過濾。[0148]3)23°C，100g，離心3min，棄上清。[0149]4)用10mlW5輕輕懸起，冰上放置30min;原生質(zhì)體逐漸沉降，棄上清。[0150]5)加適量MMG溶液懸浮，至于冰上，待轉(zhuǎn)化。[0151]注:此時需要確定原生質(zhì)體的濃度，鏡檢（X100)，原生質(zhì)體數(shù)為2X105/ml至IX106/ml〇[0152]3.小麥原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化[0153]1)加15ygTALEN蛋白（TAL-ML0-L蛋白和TAL-ML0-R蛋白等質(zhì)量混合)或20yg的T-MLO載體（對照）于2ml離心管，用槍頭吸取200ul分離的小麥原生質(zhì)體輕彈混勻，靜止3-5min，再加250μ1PEG4000，輕彈混勻，避光誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化30min;[0154]2)加900μ1W5(室溫)顛倒混勻，100g，離心3min，棄上清；[0155]3)加lmlW5,顛倒混勻，輕輕轉(zhuǎn)至6孔板中，已預(yù)先加入lmlW5,23°C培養(yǎng)過夜。[0156]4、PCR/RE實驗分析純化的TALEN蛋白對小麥內(nèi)源基因ML0的突變結(jié)果[0157]小麥原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化后48小時提取基因組DNA，以該DNA為模板，進行PCR/RE實驗分析。同時設(shè)置轉(zhuǎn)化T-ML0質(zhì)?；蛞吧托←溒贩NBobwhite的原生質(zhì)體作為對照。PCR/RE分析方法參考了文南犬Shan，Q.etal.RapidandefficientgenemodificationinriceandBrachypodiumusingTALENs.MolecularPlant(2013)，由于小麥內(nèi)源基因MLO的革巴標片段上存在限制性內(nèi)切酶Avail的識別序列，因而實驗中采用限制性內(nèi)切酶Avail進行PCR/RE檢測實驗。其中，PCR擴增所用的通用引物為：[0158]TaML〇-F:5'-TCATCGTCTCCGTCCTCCTGGAGCA-3'；[0159]TaML〇-R:5'-TGGTATTCCAAGGAGGCGGTCTCTGTCT-3'。[0160]PCR/RE實驗分析結(jié)果顯示，在ML0基因靶位點發(fā)生了突變，回收測序圖中的條帶，測序結(jié)果表明在ML0基因的革E1位點都發(fā)生了堿基插入/刪除（insertion/deletion，indel)類型的突變(圖3中B和C)。[0161]四、利用基因槍法轉(zhuǎn)化TALEN蛋白對小麥ML0基因進行定點編輯[0162]利用基因槍將普通表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)入細胞是通過金粉作為介質(zhì)將DNA質(zhì)粒帶入細胞，而對于蛋白則不能利用金粉作為介質(zhì)，因為蛋白與金粉很難結(jié)合在一起。本發(fā)明利用二氧化硅為介質(zhì)對蛋白進行基因槍轉(zhuǎn)化。[0163]1.二氧化硅裝載蛋白[0164]選取孔徑為10nm的二氧化娃Au-MSN為介質(zhì)，將20mg的Au-MSN加入5ml的PH7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)中進行超聲處理，隨后再分別加入7mg純化好的TAL-ML0-L蛋白和TAL-ML0-R蛋白。將此混合體在22°C攪拌24小時，再用12000rpm離心，棄上清，將沉淀再用roS緩沖液旋起。[0165]2.利用基因槍轉(zhuǎn)化小麥受體材料[0166]1)取小麥品種Bobwhite幼胚用高滲培養(yǎng)基進行高滲處理4小時；[0167]2)使用基因槍對經(jīng)步驟1)所述高滲培養(yǎng)的小麥幼胚進行轟擊，將載有TALEN蛋白的Au-MSN(5μ1，20ygAU)裝載在載樣膜上;利用基因槍進行轟擊，每次所述轟擊的轟擊距離為6cm，轟擊壓力為llOOpsi，轟擊直徑為2cm〇[0168]3)將經(jīng)步驟2)所述轟擊的小麥幼胚進行高滲培養(yǎng)16小時；[0169]4)將經(jīng)步驟3)所述高滲培養(yǎng)的小麥幼胚依次進行14天愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)、28天分化培養(yǎng)和14-28天生根培養(yǎng)，獲得小麥植株。[0170]5)將經(jīng)步驟4)產(chǎn)生的小麥幼苗提取DNA，經(jīng)PCR/RE檢測基因定點敲除的突變體(參見步驟三）。同時設(shè)置野生型小麥品種Bobwhite作為對照。[0171]部分突變體的檢測結(jié)果顯示，在小麥ML0基因靶位點發(fā)生了突變，回收測序圖中的條帶，測序結(jié)果表明在ML0基因的靶位點都發(fā)生了堿基插入/刪除類型的突變。[0172]以上結(jié)果表明，將核酸酶的蛋白轉(zhuǎn)入小麥植物可以實現(xiàn)對靶位點的定點編輯，這種方法獲得的突變體沒有導(dǎo)入外源DNA，而導(dǎo)入的蛋白會被植物體細胞降解，所以獲得的突變體為非轉(zhuǎn)基因植物，具有很高的生物安全性。[0173]實施例4、利用原核表達系統(tǒng)表達和純化Cas9蛋白和體外轉(zhuǎn)錄的sgRNA共導(dǎo)入小麥原生質(zhì)體或幼胚對TaGASR7基因進行定點突變[0174]-、革E標片段target_C5的設(shè)計[0175]Target-C5:5'-CCGCCGGGCACCTACGGCAAC-3'（GenbankNo·EU095332所示的TaGASR7基因中，第248-268位）；[0176]二、Cas9蛋白的原核表達及純化[0177]1.將Cas9基因（植物密碼子優(yōu)化并在兩端加入核定位信號NLS)構(gòu)建在原核表達載體PGEX-4T上，獲得在pGEX-4T載體的酶切位點BamHI和Spel之間正向插入SEQIDN0:9所示Cas9基因（植物密碼子優(yōu)化并在兩端加入核定位信號NLS)的重組載體，轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21，陽性克隆接種至含有氨芐青霉素和氯霉素的LB培養(yǎng)基中，37°C過夜培養(yǎng)，然后將培養(yǎng)物按1:100接種至5ml新鮮LB液體培養(yǎng)基中，在37°C225rpm的搖床中培養(yǎng)至0D600?0.5時，取lml菌液作為未誘導(dǎo)的陰性對照，同時設(shè)立只含有PGEX-4T質(zhì)粒DNA空載體的誘導(dǎo)及未誘導(dǎo)的對照，向剩余培養(yǎng)液加入IPTG(終濃度為ImM)，37°C225rpm誘導(dǎo)培養(yǎng)8h。[0178]2.取對照以及誘導(dǎo)的菌液各lml，12000g離心10min收集菌體，棄上清液，加入蛋白質(zhì)上樣緩沖液50yL，重懸，煮沸7min，上清液用10%SDS-PAGE電泳檢測。Cas9蛋白的分子量約為200KDa。Cas9蛋白的氨基酸序列為序列表中SEQIDN0:10所示。[0179]3.Cas9蛋白的純化[0180]收集培養(yǎng)菌液，4°C離心10分鐘，收集沉淀的菌體。向沉淀中加入10ml破碎緩沖液(pH8.5的50mMTris-HCl，2mMEDTA，100mMNaCl，lmg/ml溶菌酶）在冰上混合45分鐘，然后經(jīng)超聲破碎、離心收集沉淀，破碎離心的沉淀用4M咪唑清洗包涵體，再離心所得沉淀用pH7·4的50mM磷酸緩沖液(含8M脲素)溶解(圖4中A)。[0181]三、靶位點sgRNA的體外轉(zhuǎn)錄[0182]1·將TaGASR7的靶位點構(gòu)建在pT7_gRNA載體上[0183]C5是能與靶標target_C5互補結(jié)合的RNA的編碼DNA。[0184]合成下述帶有粘性末端(下劃線部分)的單鏈引物：[0185]C5F:5'-CTTGTTGCCGTAGGTGCCCGG-3'；[0186]C5R:5'-AAACCCGGGCACCTACGGCAA-3'。[0187]經(jīng)過引物退火程序形成有粘性末端的雙鏈DNA，插入到pT7_gRNA質(zhì)粒的兩個Bbsl酶切位點之間，即得含有C5的pT7-gRNA質(zhì)粒，質(zhì)粒經(jīng)測序驗證陽性質(zhì)粒，即在pT7-gRNA質(zhì)粒的酶切位點Bbsl處正向插入5'-CTTGTTGCCGTAGGTGCCCGG-3'所示DNA片段后得到的重組質(zhì)粒為陽性，命名為pT7-gRNA-C5。[0188]2.含有TaGASR7的靶位點的sgRNA的體外轉(zhuǎn)錄[0189]將TaGASR7基因的sgRNA的用T7啟動子啟動，利用mRNA轉(zhuǎn)錄試劑盒(Ambion)在體外轉(zhuǎn)錄成sgRNA-GASR7-C5(如序列表中SEQIDNO:11所示），并在sgRNA的3'末端加PolyA尾巴以提高mRNA的穩(wěn)定性。[0190]四、將Cas9蛋白和體外轉(zhuǎn)錄的sgRNA共轉(zhuǎn)入小麥原生質(zhì)體對TaGASR7基因進行編輯。[0191]1.原生質(zhì)體的制備同實施例3。[0192]2原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化[0193]1)加入15yg純化的Cas9蛋白和20yg的sgRNA-GASR7-C5到2ml離心管中，加入200μ1原生質(zhì)體(大約4X105細胞），再加入250μl新配的PEG溶液，混勻，室溫避光放置30min。[0194]2)加900μ1W5(室溫)顛倒混勻，100g，離心3min，棄上清；[0195]3)加lmlW5,顛倒混勻，輕輕轉(zhuǎn)至6孔板中，已預(yù)先加入lmlW5,23°C培養(yǎng)過夜。[0196]3、PCR/RE實驗分析純化的Cas9蛋白和體外轉(zhuǎn)錄的sgRNA對小麥內(nèi)源基因TaGASR7的突變結(jié)果[0197]原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化后48小時提取基因組DNA，以該DNA為模板，進行PCR/RE(PolymeraseChainReaction/Restrictiondigestion)實驗分析。同時設(shè)置野生型小麥品種Bobwhite的原生質(zhì)體作為對照。PCR/RE分析方法參考了文獻Shan,Q.etal.RapidandefficientgenemodificationinriceandBrachypodiumusingTALENs.MolecularPlant(2013)，由于小麥內(nèi)源基因TaGASR7(GenbankN〇.EU095332)的靶標片段（GenbankN〇.EU095332的第248-268位)上存在限制性內(nèi)切酶NciI的識別序列（5'-CCSGG-3'），因而實驗中采用限制性內(nèi)切酶NciI進行PCR/RE檢測實驗。其中，PCR擴增所用引物為：[0198]TaGASR7-F:5，-GGAGGTGATGGGAGGTGGGGG-3，；[0199]TaGASR7-R:5'-CTGGGAGGGCAATTCACATGCCA-3'。。[0200]PCR/RE實驗分析結(jié)果顯示，在TaGASR7基因靶位點發(fā)生了突變，回收測序圖中的條帶，測序結(jié)果表明在TaGASR7基因的革巴位點都發(fā)生了堿基插入/刪除（insertion/deletion，indel)類型的突變(圖4中B和C)。[0201]五、利用基因槍法轉(zhuǎn)化純化的Cas9蛋白和體外轉(zhuǎn)錄的sgRNA對小麥TaGASR7基因進行定點編輯.[0202]1.二氧化娃裝載純化的Cas9蛋白和體外轉(zhuǎn)錄的sgRNA[0203]選取孔徑為10nm的二氧化娃Au-MSN為介質(zhì)，將20mg的AU-MSN加入5ml的PH7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)中進行超聲處理，隨后再分別加入7mg純化好的Cas9蛋白。將此混合體在22°C攪拌24小時，再用12000rpm離心，棄上清，將沉淀再用PBS緩沖液旋起。將4μ1的體外轉(zhuǎn)錄的sgRNA(250ng/yl)加入到10μ1Cas9蛋白-Au-MSN(lOygAU)介質(zhì)中，再加入12·5μ12.5Μ的CaCl2和5μ10.1Μ的亞精胺，再5000rpm離心15s，棄上清用，再用100%的酒精洗滌沉淀兩次，再用5μ1的100%酒精懸起mRNA包裹的載有Cas9蛋白的Au-MSN，形成sgRNA-Cas9-Au-MSN。[0204]2.利用基因槍轉(zhuǎn)化小麥受體材料[0205]1)取小麥品種Bobwhite幼胚用高滲培養(yǎng)基進行高滲處理4小時；[0206]2)使用基因槍對經(jīng)步驟1)所述高滲培養(yǎng)的小麥幼胚進行轟擊，將5μ1的sgRNA-Cas9-Au-MSN裝載在載樣膜上;利用基因槍進行轟擊，每次所述轟擊的轟擊距離為6cm，轟擊壓力為ll〇〇psi，轟擊直徑為2cm〇[0207]3)將經(jīng)步驟2)所述轟擊的小麥幼胚進行高滲培養(yǎng)16小時；[0208]4)將經(jīng)步驟3)所述高滲培養(yǎng)的小麥幼胚依次進行14天愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)、28天分化培養(yǎng)和14-28天生根培養(yǎng)，獲得小麥植株。[0209]5)將經(jīng)步驟4)產(chǎn)生的小麥幼苗提取DNA，經(jīng)PCR/RE檢測基因定點敲除的突變體(具體方法參見步驟四進行）。同時設(shè)置野生型小麥品種Bobwhite作為對照。[0210]部分突變體的檢測結(jié)果顯示，在小麥TaGASR7基因靶位點發(fā)生了突變，回收測序圖中的條帶，測序結(jié)果表明在TaGASR7基因的靶位點都發(fā)生了堿基插入/刪除類型的突變。[0211]實施例5、通過花粉管通道將純化的Cas9蛋白和sgRNA導(dǎo)入植物對玉米內(nèi)源基因ZmIPK的定點突變[0212]-、革E標片段target_C2的設(shè)計[0213]Target-C2:5'-CCGAGCTCGACCACGCCGCCGAC-3'(GenbankNo·AY172635的ZmIPK基因中，第393-415位）。[0214]二、Cas9蛋白的原核表達及純化[0215]同實施例3步驟二。[0216]三、祀位點sgRNA的體外轉(zhuǎn)錄[0217]1.將ZmIPK的靶位點構(gòu)建在pT7-gRNA上[0218]C2是能與靶標Target-C2互補結(jié)合的RNA的編碼DNA〇[0219]合成下述帶有粘性末端(下劃線部分)的單鏈引物：[0220]C2-1F:5，-AGCAGTCGGCGGCGTGGTCGAGCT-3，；[0221]C2-1R:5，-AAACAGCTCGACCACGCCGCCGAC-3，。[0222]C2-1F/1R經(jīng)過引物退火程序形成有粘性末端的雙鏈DNA，插入到pT7-gRNA質(zhì)粒的兩個Bbsl酶切位點之間，即得含有C2的pT7-gRNA質(zhì)粒，質(zhì)粒經(jīng)測序驗證陽性質(zhì)粒，即在pT7-gRNA質(zhì)粒的兩個酶切位點Bbsl之間正向插入5'-AGCAGTCGGCGGCGTGGTCGAGCT-3'所示DNA片段后得到的重組質(zhì)粒為陽性，命名為pZmU3-gRNA-C2。[0223]2.含有ZmIPK的靶位點的sgRNA的體外轉(zhuǎn)錄[0224]將含有ZmIPK基因靶位點的sgRNA的用T7啟動子啟動，利用mRNA轉(zhuǎn)錄試劑盒(Ambion)在體外轉(zhuǎn)錄成sgRNA-IPK-C2(如序列表中SEQID勵：12所示），并在881?祖的3'末端加PolyA尾巴以提高sgRNA的穩(wěn)定性。[0225]四、利用花粉管通道法導(dǎo)入純化的Cas9蛋白和體外轉(zhuǎn)錄的sgRNA對玉米內(nèi)源基因ZmIPK進行定點編輯[0226]取大田中長勢旺盛的玉米自交系HiII，于晴朗的天氣14:00-16:00自交授粉，授粉后16-20h，即第2天10:00-12:00，用手術(shù)刀快速切開授粉材料的花柱，在切口處用滴管滴加含有l(wèi)Oyg/ylCas9蛋白和250ngAUsgRNA的混合物(分3次進行），然后套袋，自然結(jié)實。將結(jié)實后的玉米種子種植，待萌發(fā)后提取基因組DNA，以其為模板，進行PCR/RE實驗分析。同時設(shè)置野生型玉米品種ΗΠΙ作為對照。PCR/RE分析方法參考文獻"Shan,Q.etal.RapidandefficientgenemodificationinriceandBrachypodiumusingTALENs.MolecularPlant，6(4):1365-1368,(2013)"，由于玉米內(nèi)源基因ZmIPK(GenbankNo.AY172635)的靶標片段(GenbankNo.AY172635的第393-415位）上存在限制性內(nèi)切酶SacI的識別序列（5'_GAGCTC-3'），因而實驗中采用限制性內(nèi)切酶SacI進行PCR/RE檢測實驗。其中，PCR擴增引物如下：[0227]ZmIPK-lF:5'-TCGCAGCCCCTGGCAGAGCAA-3'；[0228]ZmIPK-lR:5'-GAGACCTGGGAGAAGGAGACGGATCC-3'。[0229]結(jié)果表明，玉米在ZmIPK基因靶位點發(fā)生了突變，回收測序未切開條帶，測序結(jié)果表明ZmIPK基因發(fā)生了堿基插入/刪除（insertion/deletion，indel)類型的突變。[0230]實施例6、利用原核表達系統(tǒng)表達、純化Cas9蛋白和體外轉(zhuǎn)錄的sgRNA共導(dǎo)入煙草原生質(zhì)體對NtPVY基因進行定點突變并再生形成植株。[0231]-、革E標片段target_P4的設(shè)計[0232]Target-P4:5'-TGATACCAGCTGGCTATACACGG-3'[0233]二、Cas9蛋白的原核表達及純化同實施例3。[0234]三、靶位點sgRNA的體外轉(zhuǎn)錄[0235]1.將NtPVY的靶位點構(gòu)建在pHSMOl載體上[0236]P4是能與祀標target_P4互補結(jié)合的RNA的編碼DNA。[0237]合成下述帶有粘性末端(下劃線部分)的單鏈引物：[0238]P4-F:5'-ATTGTGATACCAGCTGGCTATACA-3'；[0239]P4-R:5'-AAACTGTATAGCCAGCTGGTATCA-3'。[0240]經(jīng)過引物退火程序形成有粘性末端的雙鏈DNA，插入到pHSMOl質(zhì)粒的兩個Bsal酶切位點之間，即得含P4的pHSN401質(zhì)粒，經(jīng)測序驗證得到陽性質(zhì)粒，即在pHSMOl質(zhì)粒的酶切位點Bsal處正向插入5'-ATTGTGATACCAGCTGGCTATACA-3'所示DNA片段后得到的重組質(zhì)粒為陽性，命名為PHSN401-P4。[0241]2.含有NTPVY的靶位點的sgRNA的體外轉(zhuǎn)錄[0242]將NtPVY基因（如序列表中SEQID勵：13、14、15所示）的88尺祖用了7啟動子啟動，利用mRNA轉(zhuǎn)錄試劑盒(Ambion)在體外轉(zhuǎn)錄成sgRNA_PVY_P4(如序列表中SEQIDN0:16所示）。[0243]四、將Cas9蛋白和體外轉(zhuǎn)錄的sgRNA共轉(zhuǎn)入煙草原生質(zhì)體對NtPVY基因進行編輯。[0244]1.材料準備[0245]煙草的品種為紅花大金元，種子先用20%的次氯酸鈉處理20分鐘后，用無菌水洗滌5次。將種子置于1/2MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為25°C，16小時的光照。[0246]2.原生質(zhì)體的分離[0247]1)在無菌條件下，選取6片生長期約為30d的煙草葉片，去除大的葉脈后，用刀片切成大約為1cm寬的切斷，置于含有15ml酶解液的培養(yǎng)皿中。將密封的培養(yǎng)皿放在25°C、黑暗條件下過夜培養(yǎng)(12h為最佳）；[0248]2)酶解完成后，向酶解產(chǎn)物中加入一定量的W5溶液，輕輕晃動使原生質(zhì)體充分釋放出來。然后分別用1OOym和40μηι的無菌過濾器過濾原生質(zhì)體懸浮液，70g離心5分鐘；[0249]3)去除上清液，加入5ml的22%蔗糖溶液重懸原生質(zhì)體，再加入2mlW5溶液，70g離心5分鐘，原生質(zhì)體懸浮在界面處；[0250]4)從界面處吸取原生質(zhì)體，加入5ml的W5溶液，混合均勻后，70g離心5分鐘；[0251]5)去除上清液，加入lml的MMG轉(zhuǎn)化液重懸。鏡檢，計算原生質(zhì)體的產(chǎn)量。[0252]3.原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化及再生[0253]1)向14ml離心管中加入20yg純化的Cas9蛋白和20yg的mRNA-PVY-P4，加入300μ1原生質(zhì)體(大約5X105細胞），再加入300μ1新配的PEG溶液，混勻，室溫避光放置20min;[0254]2)加入10mlW5溶液，混勻后，70g離心5分鐘，棄上清液。然后再重復(fù)一次；[0255]3)加入lml含有0.6%SeaPlaqueagarose的K3:H培養(yǎng)基（使用前孵育在40_45°C的水浴鍋中），混勾后，轉(zhuǎn)至無菌的30mm的培養(yǎng)皿中；[0256]4)待培養(yǎng)基凝固后，置于24°C，黑暗條件下培養(yǎng)24h，再置于暗光條件下培養(yǎng)6d后，細胞發(fā)生了第一次分裂；[0257]5)將瓊脂塊轉(zhuǎn)移到90mm的培養(yǎng)皿中，加入一定量的液體A培養(yǎng)基，置于24°C暗光條件下繼續(xù)培養(yǎng)；[0258]6)培養(yǎng)3-4個星期后，培養(yǎng)皿中形成肉眼可見的愈傷組織。當培養(yǎng)時間為5-6星期時，愈傷組織直徑達到8-10_;[0259]7)將愈傷組織轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)1-2個星期后，在愈傷組織的表面要到形成不定芽；[0260]8)待不定芽長至3-4cm時切下。轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根，最終形成完整的植株；[0261]9)待根系生長到一定的長度時，將生根的植株取出，小心的移除并清洗其上的培養(yǎng)基，栽種到沙土中成活。[0262]提取轉(zhuǎn)基因煙草的DNA，以該DNA為模板，進行PCR/RE(PolymeraseChainReaction/Restriction(1丨8681:;[011)實驗分析。同時設(shè)置野生型煙草的0嫩作為對照。？0?/RE分析方法參考了文南犬Shan,Q.etal.RapidandefficientgenemodificationinriceandBrachypodiumusingTALENs.MolecularPlant(2013)，由于煙草內(nèi)源基因NtPVY的靶標片段上存在限制性內(nèi)切酶PvuII的識別序列(5'-CAGCTG-3'），因而實驗中采用限制性內(nèi)切酶PvuII進行PCR/RE檢測實驗。其中，PCR擴增所用引物為：[0263]NtPVY-F:5'-TGGATTAGATGTTTTCAAATGC-3'；[0264]NtPVY-R:5'-CATTCTTTTGGGGACGGACAAA-3'。[0265]PCR/RE實驗分析結(jié)果顯示，將Cas9蛋白和體外轉(zhuǎn)錄的sgRNA同時轉(zhuǎn)入到煙草原生質(zhì)體中，在NtPVY基因靶位點發(fā)生了突變，回收、測序圖中的條帶，測序結(jié)果表明在NtPVY基因的革巴位點都發(fā)生了堿基插入/刪除（：^61'1：；[011/(16161：；[011411(161)類型的突變（圖5中八和B)。另外，再生得到的轉(zhuǎn)基因煙草在NtPVY基因靶位點發(fā)生了突變，回收、測序圖中的條帶，測序結(jié)果表明在NtPVY基因的革EH立點都發(fā)生了堿基插入/刪除（insertion/deletion，indel)類型的突變(圖5中C)。[0266]煙草原生質(zhì)體制備和轉(zhuǎn)化所用溶液如表6-表10所示。[0267]表6:50ml酶解液[0268][0269]表7:500mlW5[0271]表8:10ml轉(zhuǎn)化液[0274]表9:4mlPEG溶液[0275][0276]表10用于煙草原生質(zhì)體分離和培養(yǎng)的儲液【主權(quán)項】1.對植物目的基因中靶標片段進行定點改造的方法，包括如下步驟：向目的植物的細胞或組織或植物體部位中導(dǎo)入非遺傳物質(zhì)，所述非遺傳物質(zhì)為特異于所述靶標片段的核酸酶或表達所述核酸酶的mRNA，在所述核酸酶的作用下，所述靶標片段被剪切，再通過所述植物的自身DNA修復(fù)，完成對所述靶標片段的定點改造。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述核酸酶為TALEN核酸酶、鋅指核酸酶、CRISPR/Cas9核酸酶或所有能實現(xiàn)基因組編輯的核酸酶。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于:所述非遺傳物質(zhì)為所述TALEN核酸酶，或能表達成對TALEN蛋白的mRNA;所述TALEN蛋白由能夠識別所述靶標片段并與其結(jié)合的DNA結(jié)合域和FokI結(jié)構(gòu)域組成。4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于:所述非遺傳物質(zhì)為鋅指核酸酶，或能表達成對ZFN蛋白的mRNA;所述ZFN蛋白由能夠識別所述靶標片段并與其結(jié)合的DNA結(jié)合域和FokI結(jié)構(gòu)域組成。5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于:所述非遺傳物質(zhì)由Cas9蛋白和向?qū)NA組成;所述向?qū)NA為由crRNA和tracrRNA通過部分堿基配對結(jié)合而成的具有回文結(jié)構(gòu)的RNA;所述crRNA含有能夠與所述靶標片段互補結(jié)合的RNA片段。6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于:所述細胞為任何能導(dǎo)入所述非遺傳物質(zhì)并能經(jīng)過組織培養(yǎng)再生為完整植株的細胞;所述組織為任何能導(dǎo)入所述非遺傳物質(zhì)并能經(jīng)過組織培養(yǎng)再生為完整植株的組織;所述植物體部位為任何能導(dǎo)入非遺傳物質(zhì)的存在于整株植物上植物體部位。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于:所述細胞為原生質(zhì)體細胞或懸浮細胞;所述組織為愈傷組織、幼胚或成熟胚;所述植物體部位為葉片、花序、花粉管或莖尖。8.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一所述的方法，其特征在于：向所述目的植物的細胞或組織或植物體部位中導(dǎo)入所述非遺傳物質(zhì)的方法為基因槍法、PEG誘導(dǎo)原生質(zhì)體法、花粉管通道法或其他任何能夠?qū)胨龇沁z傳物質(zhì)的導(dǎo)入方法。9.根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一所述的方法，其特征在于:所述定點改造為:對所述靶標片段的核苷酸進行插入突變、缺失突變和/或替換突變。10.-種培育非轉(zhuǎn)基因突變植物的方法，包括如下步驟:采用權(quán)利要求1-9中任一所述方法對目的植物的目的基因中的靶標片段進行定點改造，進而獲得所述目的基因喪失功能、且基因組中未整合外源基因的植物，即為所述非轉(zhuǎn)基因突變植物?！疚臋n編號】A01H1/06GK105985943SQ201610141846【公開日】2016年10月5日【申請日】2016年3月14日【發(fā)明人】高彩霞,梁振,王延鵬,單奇?zhèn)?宋倩娜【申請人】中國科學院遺傳與發(fā)育生物學研究所