植物源高效轉(zhuǎn)錄激活功能域sac3及應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，提供一種植物源高效轉(zhuǎn)錄激活功能域SAC3及應(yīng)用，其氨基酸序列為DEEGCGTCFDFAENTEQKEFLDNWHFEDDFVDYAQFAVFDDTADSAWDVVNLEAFIDGDYSTSWELETIC。本發(fā)明從杉木的cDNA文庫中分離得到一段高效轉(zhuǎn)錄激活序列SAC3，CPRG結(jié)果顯示其轉(zhuǎn)錄激活功能在酵母中為VP16的19倍左右；以Gal4?UAS為基礎(chǔ)的雙熒光素酶系統(tǒng)結(jié)果顯示：在擬南芥中SAC3的轉(zhuǎn)錄激活活性為VP16的兩倍以上、EDLL的50倍。SAC3可以應(yīng)用于植物的基因工程技術(shù)中，用以精確激活植物體內(nèi)特定基因的表達(dá)，改善植物與該特定基因相關(guān)的重要性狀，大幅提高作物的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。
【專利說明】
植物源高效轉(zhuǎn)錄激活功能域SAC3及應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種植物源高效轉(zhuǎn)錄激活功能域SAC3及應(yīng)用?！颈尘凹夹g(shù)】
[0002]全球人口的日益膨脹和生存環(huán)境的改變，給農(nóng)作物的經(jīng)營和發(fā)展提出了極大的挑戰(zhàn)。興起于上世紀(jì)80年代的基因工程技術(shù)，是大幅改善農(nóng)作物的產(chǎn)量及提高其對(duì)環(huán)境改變的適應(yīng)性的強(qiáng)有力手段。基因技術(shù)在植物中有大規(guī)模的應(yīng)用，常將外源基因直接隨機(jī)整合入目標(biāo)植物基因組中，并以此改善植物一些重要性狀，如抗除草劑和抗蟲性。然而這種方法可能會(huì)產(chǎn)生一些副作用，而且無法達(dá)到精確控制特定基因表達(dá)的效果。
[0003]擬轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)器，Transcript1n activator-like effectors (TALEs)， 是實(shí)現(xiàn)精確控制特定基因表達(dá)最有效和應(yīng)用最廣泛的技術(shù)；以及近年來CRISPR-Cas9 (clustered regularly interspaced short palindromic repeat - CRISPR-associated 9)系統(tǒng)的開發(fā)和應(yīng)用，生物體的研究和改造帶來巨大潛力，這類人工合成的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子為精確控制植物內(nèi)源基因的表達(dá)提供了可靠的工具。然而由于其轉(zhuǎn)錄激活活性的發(fā)揮完全取決于轉(zhuǎn)錄激活功能域。迄今為止應(yīng)用在基因工程中的效果顯著的轉(zhuǎn)錄激活功能域基本來源于動(dòng)物病毒(VP16)，在植物中缺乏完全匹配的工作環(huán)境，使其功能發(fā)揮受到限制。已知的植物中的轉(zhuǎn)錄激活因子主要是對(duì)環(huán)境因素響應(yīng)的蛋白，其中H)LL motif為已報(bào)道的最強(qiáng)植物源轉(zhuǎn)錄激活因子，該功能域的發(fā)現(xiàn)和運(yùn)用讓人們有理由相信植物中存在強(qiáng)大的轉(zhuǎn)錄激活功能域，但其轉(zhuǎn)錄激活功能與VP16相比依然很低，以酵母為篩選載體，本發(fā)明從杉木的cDNA 文庫中分離得到一段高效轉(zhuǎn)錄激活序列SAC3(Strong Activat1n domain from China fir-3)，CPRG結(jié)果顯示其轉(zhuǎn)錄激活功能在酵母中為VP16的19倍左右；以Gal4-UAS為基礎(chǔ)的雙熒光素酶(LUC和REN)系統(tǒng)結(jié)果顯示:在擬南芥中SAC3的轉(zhuǎn)錄激活活性為VP16的兩倍以上、EDLL的50倍。SAC3可以應(yīng)用于植物的基因工程技術(shù)中，用以精確激活植物體內(nèi)特定基因的表達(dá)，改善植物與該特定基因相關(guān)的重要性狀，大幅提高作物的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。
[0004]
【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種植物源高效轉(zhuǎn)錄激活功能域SAC3及應(yīng)用，可以應(yīng)用于植物的基因工程技術(shù)中，用以精確激活植物體內(nèi)特定基因的表達(dá)，改善植物與該特定基因相關(guān)的重要性狀，大幅提高作物的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。
[0006]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:植物源高效轉(zhuǎn)錄激活功能域S A C 3，所述的S A C 3的氨基酸序列為 DEEGCGTCFDFAENTEQKEFLDNWHFEDDFVDYAQFAVFDDTADSAWDVVNLEAFIDGDYSTSWELETICo
[0007]所述的植物源高效轉(zhuǎn)錄激活功能域SAC3在改善植物基因表達(dá)中的應(yīng)用。[〇〇〇8]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于:本發(fā)明從杉木的cDNA文庫中分離得到一段高效轉(zhuǎn)錄激活序列SAC3(Strong Activat1n domain from China fir-3)，CPRG結(jié)果顯不其轉(zhuǎn)錄激活功能在酵母中為VP16的19倍左右；以Gal4-UAS為基礎(chǔ)的雙熒光素酶(LUC和REN)系統(tǒng)結(jié)果顯示:在擬南芥中SAC3的轉(zhuǎn)錄激活活性為VP 16的兩倍以上、EDLL的50倍。SAC3可以應(yīng)用于植物的基因工程技術(shù)中，用以精確激活植物體內(nèi)特定基因的表達(dá)，改善植物與該特定基因相關(guān)的重要性狀，大幅提高作物的經(jīng)濟(jì)價(jià)值?！靖綀D說明】
[0009]圖1 TUP1轉(zhuǎn)錄激活因子篩選系統(tǒng)簡圖。
[0010]圖2杉木文庫在酵母TUP1系統(tǒng)中篩選結(jié)果的自激活能力。
[0011]圖3 SAC3轉(zhuǎn)錄激活功能域的確定。
[0012]圖4植物中SAC3的轉(zhuǎn)錄激活能力?！揪唧w實(shí)施方式】 [〇〇13] 實(shí)施例11.杉木中轉(zhuǎn)錄激活因子的篩選 1.1載體的構(gòu)建本系統(tǒng)篩選載體以pGBKT7(Clontech)為背景，首先將酵母轉(zhuǎn)錄抑制因子構(gòu)建入PGBKT7 中GK)的C端，采用的構(gòu)建方式為將線性化的pGBKT7(引物1:5 ’ -TATGGCCATGGAGGCCGAATTCC-3’；弓I物2:5’- TGCAGGTCCTCCTCTGAGATCAGC-3’)與TUP1 (弓| 物3: 5’-TCAGAGGAGGACCTGCATATG atgactgccagcgtttcgaatacgcag-3’ ； CTCCATGGCCATATG TGCCACGGAAACCTGGGGAGG-3’)通過In-fus1n融合成GBD-TUP1 〇
[0014]將杉木文庫通過In-fus1n插入到GBD-TUP1的BamHI位點(diǎn)(引物5:5’-TATGGCCATGGAGGCCGAAITCC-3 ’；引物6:5 ’ - TGCAGGTCCTCCTCTGAGATCAGC-3 ’)，文庫大小為 2X105〇
[0015]1.2酵母的轉(zhuǎn)化與篩選酵母的轉(zhuǎn)化參照Matchmaker Gold Yeast Two-Hybrid System User Manual (PT4084-1)_092413, Clontech?宿主菌株為Gold,篩選文庫大小為2X106。
[0016]本研究采用的TUP1篩選系統(tǒng)能最大程度分離出轉(zhuǎn)錄激活活性極強(qiáng)的基因片段，通過在SD篩選培養(yǎng)基(SD/-His-Ade-Trp，3-AT，AbA，X-alpha-gal)上的顯色反應(yīng)，鑒定出目的克隆，通過載體引物(T7: 5’-TAATACGACTCACTATAGGGCG-3’； 3’BD: 5’-mTCGITTTAAAACCTAAGAGTC-3’)擴(kuò)增出目的基因片段，并測序。
[0017]2.SAC3轉(zhuǎn)錄激活功能的鑒定SAC3的轉(zhuǎn)錄激活功能用CPRG方法鑒定，將目的片段克隆入pGBKT7中(BamHI位點(diǎn))，并轉(zhuǎn)入酵母Y187中(方法參照1.1 )，用SD/-Trp培養(yǎng)基篩選出陽性克隆，檢測并比較轉(zhuǎn)化菌株的員-galactosidase units (具體方法參照 Yeast Protocols handbook，PT3024_l， Clontech)〇[〇〇18] 3.SAC3轉(zhuǎn)錄激活功能域的確定轉(zhuǎn)錄激活因子SAC3的功能片段的鑒定同樣借助CPRG的方法。首先通過生物信息學(xué)手段，預(yù)測SAC3可能的功能域，而后分別克隆這些功能域到pGBKT7中(BamHI位點(diǎn))，轉(zhuǎn)入酵母Y187中(方法參照1.1)，用SD/-Trp培養(yǎng)基篩選出陽性克隆，檢測并比較轉(zhuǎn)化菌株的P-galactosidase units (具體方法參照 Yeast Protocols handbook，PT3024_l， Clontech)〇
[0019] 4.植物中SAC3的轉(zhuǎn)錄激活功能 4.1載體的構(gòu)建本實(shí)驗(yàn)采用GAL4-UAS系統(tǒng)，首先分別構(gòu)建報(bào)告載體和效應(yīng)載體。報(bào)告載體以 ?6^611110800為背景在1^(:基因序列的5’端插入1^5及迷你355啟動(dòng)子序列(5’-CGGAGTACTGTCCTCCGCGCACAATCCCACTATCCTTCGCAAGACCCTTCCTCTATATAAGGAAGTTCATTTCATTT GGAGAGGACACGCTGGGATCC-3’)，構(gòu)成UAS-mini35S:: LUC (以35S::REN為內(nèi)參)；效應(yīng)載體為 35S::GAL4 (DNA-BD) - AD，以pEarlyGatel04為背景，其中GAL4 (DNA-BD)為酵母GAL4的 DNA binding domain(l-147aa)，AD 分別為SAC3(DEEGCGTCFDFAENTEQKEFLDNWHFEDDFVDYAQ FAVFDDTADSAWDVVNLEAFIDGDYSTSWELETIC) / EDLL(EVFEFEYLDDKVLEELLDSEERKR) / VP16 (413-490 aa)。所有質(zhì)粒均由無內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒制備(0MEGA，D6922-02)。
[0020]4.2瞬時(shí)表達(dá)擬南芥葉肉細(xì)胞原生質(zhì)體的制備以及原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化參照T i w a r i等描述的方法 (PubMed ID: 16739582)，其中效應(yīng)載體的使用量為10微克，報(bào)告載體的使用量為5微克，共轉(zhuǎn)入原生質(zhì)體中。轉(zhuǎn)化后的原生質(zhì)體在黑暗中培養(yǎng)12h后，用雙熒光報(bào)告系統(tǒng)檢測試劑盒 (Promega，E2920)檢測樣品中的LUC表達(dá)量，并以REN表達(dá)量為內(nèi)參比較各樣品中LUC/REN 的值。每個(gè)樣品均作3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)生物學(xué)重復(fù)作3個(gè)技術(shù)重復(fù)。[〇〇21]實(shí)驗(yàn)結(jié)果:1.酵母中SAC3轉(zhuǎn)錄激活功能通過在酵母TUP1系統(tǒng)中對(duì)杉木的文庫進(jìn)行篩選，得到4個(gè)自激活能力大于等于VP16的基因片段，分別命名為SAC1、SAC2、SAC3和SAC4。通過CPRG檢測發(fā)現(xiàn)，SAC3(179aa)在酵母中的自激活能力極顯著高于VP16(19倍以上)。[〇〇22] 2.SAC3的轉(zhuǎn)錄激活功能域通過序列分析，將3403的轉(zhuǎn)錄激活功能域假定為1-60&&、61-110&&、110-179&&和60-179aa，分別檢測這些功能域的轉(zhuǎn)錄激活功能發(fā)現(xiàn):SAC3的轉(zhuǎn)錄激活能力可由C端(110-179aa)完全替代，其氨基酸序列為，DEEGCGTCFDFAENTEQKEFLDNWHFEDDFVDYAQFAVFDDTADSA WDVVNLEAFIDGDYSTSWELETICo [〇〇23] 3.植物中SAC3的轉(zhuǎn)錄激活功能雙螢光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測結(jié)果顯示，SAC3在植物中有顯著較高的轉(zhuǎn)錄激活活性，大概是VP16的2倍和EDLL的8-10倍。
[0024]以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，凡依本發(fā)明申請專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應(yīng)屬本發(fā)明的涵蓋范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.植物源高效轉(zhuǎn)錄激活功能域S A C 3，其特征在于:所述的S A C 3的氨基酸序列為 DEEGCGTCFDFAENTEQKEFLDNWHFEDDFVDYAQFAVFDDTADSAWDVVNLEAFIDGDYSTSWELETICo2.如權(quán)利要求1所述的植物源高效轉(zhuǎn)錄激活功能域SAC3在改善植物基因表達(dá)中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C07K14/415GK105949293SQ201610484782
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2016年6月28日
【發(fā)明人】蘇軍, 岡義人, 楊兆河, 劉伯斌
【申請人】福建農(nóng)林大學(xué)