專利名稱：：氧肟酸類組蛋白去乙?；敢种苿┘捌渲苽浞椒ê陀猛镜闹谱鞣椒?br>技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及藥物化學領(lǐng)域，具體涉及一類氧肟酸類組蛋白去乙酰化酶抑制劑、其制備方法、含其的藥物制劑及其醫(yī)藥用途。
背景技術(shù)：
：真核基因的表達受遺傳調(diào)控(geneticregulation)和表觀遺傳調(diào)控(epigeneticregulation)雙重調(diào)控。遺傳調(diào)控包括基因轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后加工、翻譯以及翻譯后修飾等環(huán)節(jié)；表觀遺傳調(diào)控是指轉(zhuǎn)錄前基因在染色質(zhì)水平上的結(jié)構(gòu)調(diào)K1，它是真核基因組一種獨特的調(diào)控機制。表觀遺傳調(diào)控主要包括DNA甲基化、RNA干涉、組蛋白修飾三方面，可以在不改變DNA編碼序列的前提下使基因發(fā)生可遺傳的沉渠犬(Egger,Liang,AparicioandJones，Epigeneticsinhumandiseaseandprospectsforepigenetictherapy.Jow"a/2004，429:p.457-63.)。由組蛋白修飾所引起的染色體局部構(gòu)象的改變(染色質(zhì)重塑，chromatinremodeling),在真核生物基因表達調(diào)控中發(fā)揮著重要的作用。組蛋白的翻譯后修飾，包括對組蛋白尾部的賴氨酸和精氨酸殘基的乙?；谆?，磷酸化，以及泛素化等，這些修飾構(gòu)成了組蛋白密碼(histonecode)。組蛋白密碼作為一種DNA序列之外的基因信息的儲存和補充機制，大大擴展了基因編碼的信息量。其中，組蛋白的乙?；揎椵^為普遍，也是近年來研究最為深入的組蛋白密碼。組蛋白的乙?；揎棸l(fā)生在N-端進化保守的賴氨酸殘基的s-氨基上，在H3和H4上的修飾較H2A和H2B更為普遍，比較重要的乙酰化位點是H3上的Lys^卩Lys14，以及H4上的Lys5，Lys8，Lys12，Lys16。一般認為，基因的轉(zhuǎn)錄活性與染色體的局部構(gòu)象密切相關(guān)。組蛋白的乙酰化/去乙?；梢愿淖?nèi)旧w的局部構(gòu)象，影響DNA與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的非核小體復(fù)合物之間的相互作用，進而調(diào)控特定基因的表達。在細胞核中，未經(jīng)乙?；馁嚢彼釟埢鶐д姾?，可以與堿性的DNA磷酸骨架緊密結(jié)合，轉(zhuǎn)錄因子，轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)復(fù)合物以及RNA聚合酶不能與DNA結(jié)合，染色體處于異染色質(zhì)(heterochromatin)狀態(tài)，轉(zhuǎn)錄沉默；乙?；?，組蛋白的賴氨酸殘基處于中性，染色體的構(gòu)象更為松散，染色體處于常染色質(zhì)(euchromatin)狀態(tài)，轉(zhuǎn)錄因子及相關(guān)的調(diào)節(jié)因子可以與DNA的啟動子結(jié)合(Acharya，Sparreboom,VenitzandFigg,Rationaldevelopmentofhistonedeacetylaseinhibitorsasanticanceragents:areview.Jo簡a/2005,68:p.917-32.)。一般說來，在基因轉(zhuǎn)錄活躍區(qū)，組蛋白的乙酰化程度偏高，而在基因轉(zhuǎn)錄非活躍區(qū)，組蛋白的乙?；潭绕?。組蛋白的乙酰化狀態(tài)取決于組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶(histoneacetyltransferases,HATs)和組蛋白去乙?；?histonedeacetylases，HDACs)之間的活性競爭。HATs能催化乙酰輔酶A上的乙?；D(zhuǎn)移到組蛋白的N-端賴氨酸殘基，中和正電荷，使DNA與組蛋白之間的相互作用減弱，染色體呈轉(zhuǎn)錄活性的松散結(jié)構(gòu)，有利于轉(zhuǎn)錄因子與DNA結(jié)合，轉(zhuǎn)錄激活。反之，HDACs通過催化組蛋白N-端的去乙?；?，使組蛋白帶正電荷，與帶負電荷的DNA緊密結(jié)合，染色體結(jié)構(gòu)聚集，轉(zhuǎn)錄因子不能接近目標DNA，轉(zhuǎn)錄抑制。HATs和HDACs活性失衡與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，腫瘤細胞中通常發(fā)生由于染色體重塑而導致的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)異常(MahlknechtandHoelzer,Histoneacetylationmodifiersinthepathogenesisofmalignantdisease.Jbw"a/2000,6:p.623-44.)。染色體的重塑與腫瘤發(fā)生的關(guān)系有多種猜測，比較有代表性的有以下三種(Acharya，Sparreboom,VenitzandFigg,Rationaldevelopmentofhistonedeacetylaseinhibitorsasanticanceragents:areview.Jowmtf/2005,68:p.917-32.):1)組蛋白乙?；疆惓Ｆ呖赡軙せ钅承┩ǔＧ闆r下受抑制的啟動子，導致蛋白質(zhì)的異常表達；2)啟動子區(qū)域乙?；狡涂赡軙е履骋伙@型關(guān)鍵的基因轉(zhuǎn)錄沉默；3)HATs/HDACs的異常定位或募集可能會誘發(fā)腫瘤或其它疾病。盡管腫瘤細胞中編碼HDACs的基因并未發(fā)生缺失或異常，但HDACs與多種原癌基因和腫瘤抑制基因密切相關(guān)，HDACs活性異常可能會導致腫瘤的發(fā)生(Kristeleit，Stimson，WorkmanandAheme,Histonemodificationenzymes:noveltargetsforcancerdrugs.Jowr朋/2004，9:p.135-54.)。通過抑制HDACs，某些重要基因得以轉(zhuǎn)錄，可以退出細胞周期，促進細胞分化，以及誘導細胞凋亡。HDACs抑制劑可以抑制白血病或?qū)嶓w腫瘤細胞增殖，并誘導腫瘤細胞分化(Kramer，GottlicherandHeinzel,Histonedeacetylaseasatherapeutictarget.Jiowraa/2001，12:p.294-300。。HDACs抑制劑一般可使腫瘤細胞停滯于Gl期，但有時也會觀察到G2期細胞增多(Qiu，Burgess,Fairiie，Leonard,ParsonsandGabrielli,HistonedeacetylaseinhibitorstriggeraG2checkpointinnormalcellsthatisdefectiveintumorcells.Jowr"a/2000,11:p.2069-83.)。幾乎所有HDACs抑制劑都會激活周期蛋白依賴激酶抑制因子p21api/WAF1(由CDKN1A基因編碼)的轉(zhuǎn)錄，p21OTi/WAFi可以與cydinE《DK2及cyciinA-CDK2復(fù)合物結(jié)合，使其失活；另外，很多HDACs抑制劑還能下調(diào)細胞內(nèi)cyclinA和cycUriD的水平，阻止腫瘤抑制蛋白視網(wǎng)膜母細胞瘤蛋白Rb磷酸化，細胞不能進入S期，細胞周期無法進行(LipinskiandJacks,Theretinoblastomagenefamilyindifferentiationanddevelopment.Jowr朋,1999，18:p.7873-82.)。CDKNlA對于HDACs抑制劑介導的G1期抑制起關(guān)鍵作用，如果細胞缺失CDKN1A基因，則細胞進入S期，DNA復(fù)制，可以檢測到細胞內(nèi)的DNA為4n，細胞易于發(fā)生凋亡。HDACs抑制劑對p2ldPiWAH的激活作用是不依賴于p53的，這點尤為重要，因為腫瘤細胞普遍存在由于p53功能異常而導致的增殖失控(Xiao,HasegawaandIsobe,BothSplandSp3areresponsibleforp21waflpromoteractivityinducedbyhistonedeacetylaseinhibitorinNIH3T3cells.JowmaZ1999,73:p.291-302.)。HDACs抑制劑還能使人正常纖維原細胞以及某些腫瘤細胞產(chǎn)生一個G2期控制點，因此，正常細胞可以以一種安全的方式退出細胞周期，這也可能是HDACs抑制劑對正常細胞或組織幾乎無毒副作用的原因之一。另外，很多研究都觀察到HDACs誘導的凋亡是與蛋白質(zhì)的合成相關(guān)的(HendersonandBrancolini,Apoptoticpathwaysactivatedbyhistonedeacetylaseinhibitors:implicationsforthedrug-resistantphenotype./owm"/2003,6:p.247-56.,Marks,Rifkind，Richon，Breslow，MillerandKelly,Histonedeacetylasesandcancer:causesandtherapies.Jowtw^2001,1:p.194-202.)。如果抑制蛋白質(zhì)的合成，會拮抗HDACs誘導的凋亡。HDACs抑制劑促使細胞退出細胞周期，或者發(fā)生分化或者發(fā)生凋亡等不同的藥理作用是與多種因素相關(guān)的。一般說來，細胞退出細胞周期是發(fā)生分化的前提，當用量較高時，HDACs抑制劑通常具有細胞毒作用，能夠誘導細胞凋亡，而在低劑量時，則會將細胞阻滯于Gl期，使其退出細胞周期。另外，還與細胞的種類有關(guān)，同一劑量可能會促進某一種細胞分化，而誘導另一種細胞凋亡。這可能是由于藥物在具體細胞內(nèi)的吸收和代謝速度不同引起的；也可能是由于某些腫瘤細胞內(nèi)會缺失調(diào)節(jié)細胞周期或發(fā)生凋亡所需的基因，例如，過量表達Bcl2的細胞不再會發(fā)生由HDACs抑制劑誘導的凋亡，但是卻不會影響HDACs抑制劑對細胞周期的〈乍用(Johnstone,Histone-deacetylaseinhibitors:noveldrugsforthetreatmentofcancer.2002,1:p.287-99.)。通常情況下，HDACs抑制劑激活p21apiWAF1,使細胞停滯于G1期，如果細胞缺失CDKN1A基因，或者G1控制點喪失功能，細胞能夠通過G1期控制點，DNA進一歩復(fù)制為4n，則這些細胞很可能會發(fā)生凋亡。除了促進細胞退出細胞周期，發(fā)生分化，誘導細胞凋亡之外，HDACs抑制劑還能通過其它方式影響腫瘤細胞的生長。HDACs抑制劑能夠激活第I類和第II類組織相容性蛋白基因的轉(zhuǎn)錄，還能上調(diào)輔助刺激因子CD40，CD89禾卩CD86，細胞間粘附因子ICAM1，以及I型和H型干擾素的水平，因此可以放大免疫細胞的識別和激活。例如，HDACs抑制劑能夠提高腫瘤細胞對異基因混合白細胞反應(yīng)的敏感度(Maeda，Towatari,KosugiandSaito,Up-regulationofcostimulatory/adhesionmoleculesbyhistonedeacetylaseinhibitorsinacutemyeloidleukemiacells.Jrn/maZ2000，96:p.3847-56.)。另外，由于實體瘤的迅速增殖，需要新生血管提供腫瘤細胞所需的氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)，HDACs抑制劑能夠阻止組織缺氧導致的表皮生長因子(VEGF)的表達，從而抑制新生血管的形成(Sasakawa,Naoe,Noto，Inoue,Sasakawa,Matsuo，MandaandMutoh，AntitumorefficacyofFK228,anovelhistonedeacetylaseinhibitor,dependsontheeffectonexpressionofangiogenesisfactors.Jbwra"/2003,66:p.897-906.，Kim,Kwon,Lee,Baek,Jang,Lee,Moon,Kim，Lee，Chung,KimandKim，Histonedeacetylasesinduceangiogenesisbynegativeregulationoftumorsuppressorgenes.Jowna/2001,7:p.437-43.)?，F(xiàn)有的HDACs抑制劑大多對HDACs的各個亞型不具有選擇性。因此，找到一類能具有選擇性的可以用作HDACs抑制劑的化合物具有非常重大的意義。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明涉及基于組蛋白去乙?；冈O(shè)計的一類氧肟酸類小分子化合物，藥理試驗證明本發(fā)明化合物對于組蛋白去乙?；妇哂泻芎玫倪x擇性，本發(fā)明化合物及其藥用制劑可以用于治療由于組蛋白去乙?；富钚允д{(diào)而導致的一系列疾病，或者可以用于治療與細胞分化或增殖相關(guān)的疾病，例如實體瘤、白血病等疾病。本發(fā)明涉及下列通式I的化合物(I)通式I化合物的立體異構(gòu)體、水合物或藥學上可接受的鹽也包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。其中Ar表示芳香基，具體代表下列基團苯環(huán)、吡啶環(huán)或被1~4個X取代基取代的含有02個氮原子、硫原子或氧原子的五元或六元芳香環(huán)，其中取代基X是氫、卣素、氨基、羥基、硝基、氰基、C廣C4的烴基、C-C4的烷氧基、d-C4的氨基烷基、C,-C4的烷基胺基、Q-C4的?；-C4的酰胺基、Q-C4的垸氧基羰基、與苯環(huán)或含有12個氮原子或1個硫原子或1個氧原子的五元或六元雜環(huán)連接的d-d的烷基或烷氧基；R,表示氫、Q-Q的烴基、與Y取代的苯氧基連接的C2-C6的烴基，Y是氫、d-Q的烴基或d-C4的烴氧基。上述化合物中Ar優(yōu)選表示對甲基苯基。R!優(yōu)選乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、戊基、己基或辛基。Ri還可以優(yōu)選2-(o-甲基苯氧基)乙基、2-苯氧基乙基、2-(p-甲基苯氧基)乙基、3-苯氧基丙基、3-&-甲基苯氧基)丙基、4-苯氧基丁基或4-(p-甲基苯氧基)丁基。本發(fā)明還涉及一類通式II的新中間體，II這類中間體是全新的，用于制備通式I化合物，其Ar，R,的定義同通式I。fc表示氫或CVQ的垸基。本發(fā)明還涉及這一類化合物的制備方法。本發(fā)明所述的化合物的合成方法如下-將化合物(III)與鹵代烴(R,X)進行反應(yīng)得到中間體(11)，中間體(n)再與羥胺溶液反應(yīng)得到通式(I)化合物，(in)化合物(III)與鹵代烴(R!X)進行反應(yīng)的反應(yīng)溫度為03(TC，反應(yīng)時間為212小時。反應(yīng)所用的溶劑為常用溶劑，如DMF等，反應(yīng)液中還需加入堿，如氫化鈉，正丁基鋰等。若R2為氫，通式(II)化合物轉(zhuǎn)化為目標產(chǎn)物(I)的反應(yīng)條件為以二氯甲烷或氯仿作為溶劑，在DMF的催化下，通式(II)化合物先與酰氯反應(yīng)生成活性中間體，將此活性中間體滴加入鹽酸羥胺溶液中，以三乙胺作為堿，鹽酸羥胺溶液由鹽酸羥胺，水和四氫呋喃配制。若R2為d-Q的垸基，通式(II)化合物轉(zhuǎn)化為目標產(chǎn)物(I)的反應(yīng)條件為將通式(II)化合物滴加入新鮮配制的羥胺溶液中，隨即加入氫氧化鉀調(diào)節(jié)反應(yīng)液使成堿性。通式(I)所述的化合物，可以采用常見的分離方法進行純化，如重結(jié)晶、柱層析等。藥理學試驗顯示，本發(fā)明的化合物具有周期抑制和凋亡誘導活性，可以用于治療由于組蛋白去乙?；富钚允д{(diào)而導致的一系列疾病，例如實體瘤、血瘤以及神經(jīng)退行性疾病等。本發(fā)明所述的化合物可以添加藥學上可接受的載體制成常見的藥用制劑，如片劑、膠囊、粉劑、糖漿、液劑、懸浮劑、針劑，可以加入香料、甜味劑、液體或固體填料或稀釋劑等常用藥用輔料。本發(fā)明所說的化合物在臨床上的給藥方式可以采用口服、注射等方式。本發(fā)明的化合物臨床所用劑量為0.01mg500mg/天，也可根據(jù)病情的輕重或劑型的不同偏離此范圍。本發(fā)明的優(yōu)點在于，所述化合物及其藥用制劑能有效調(diào)節(jié)組蛋白去乙?；傅幕钚?，對于不同亞型的組蛋白去乙?；?HDAC1和HDAC4)具有很好的選擇性和抑制活性，其中一個化合物對HDAC1和HDAC4的選擇性高達2282.8倍，是目前已報道的氧肟酸類HDAC抑制劑中對HDAC1和HDAC4選擇性最好的化合物。這些化合物可以用于治療基因表達異常引起的如腫瘤、內(nèi)分泌紊亂、免疫系統(tǒng)疾病、遺傳病和神經(jīng)系統(tǒng)疾病。下面是本發(fā)明化合物部分藥理學實驗及結(jié)果，藥理部分化合物用代號表示，其對應(yīng)的結(jié)構(gòu)式見實施例中相同代號所表示的結(jié)構(gòu)式-一、本發(fā)明化合物對人白血病細胞U937細胞粒細胞分化的影響(參考Nebbioso，A.;Clarke,N.等人報道的方法，Nat.Med.2005，11,77-84.)將U937細胞懸浮于10nL連接有phycoerythrine的CDllc中(CDllc-PE),對照樣品加入至IO^L連接有PE的鼠IgGl中，于黑暗中4'C孵育30分鐘，再懸浮于500^L碘化丙吡的PBS溶液中(0.25嗎/mL)。用FACS流式細胞儀檢測樣品，使用CellQuest軟件(BectonDickinson)獲取并分析數(shù)據(jù)。本發(fā)明化合物1116對人白血病細胞U937細胞粒細胞分化的影響數(shù)據(jù)圖參見附圖1。圖1是藥物濃度為5時，30小時內(nèi)，對照化合物SAHA和本發(fā)明部分化合物對U937細胞的粒細胞分化誘導率，其中SAHA誘導率為42.25%，化合物ll，12,和16的分化誘導率達61.86%，62.06%和68.53%。二、本發(fā)明化合物對人白血病細胞U937細胞細胞周期的影響(參考Nebbioso,A.;Clarke,N.等人報道的方法，NatMed.2005,11,77-84.)收集細胞(2.5X105),懸浮于500^L低滲緩沖溶液(0.1%TritonX-IOO，0."/。擰檬酸鈉,5(Hig/mL碘化丙吡(PI)以及RNAseA)中。于黑暗中(C孵育30分鐘，再懸浮于500碘化丙吡的PBS溶液中(0.25pg/mL)。用FACS流式細胞儀檢測樣品，使用CellQuest軟件(BectonDickinson),及ModFitLT軟件(第3版，Verity)獲取并分析數(shù)據(jù)。所有試驗均進行兩次或兩次以上。本發(fā)明化合物1116對人白血病細胞U937細胞細胞周期的影響數(shù)據(jù)圖參見附圖2。從圖2中可以看出，濃度為5時，30小時內(nèi)，對照化合物SAHA使U937細胞停滯于G2期，化合物1115使細胞周期停滯于G1期，而化合物16使細胞周期停滯于S期。三、本發(fā)明化合物對人白血病細胞U937細胞凋亡的影響(參考Altucci，L.;Rossin，A.等人報道的方法，Nat.Med.2001,7，680-68)以活化的caspase3作為檢測細胞凋亡的指標(B-Bridge)。用FACS流式細胞儀檢測樣品，使用CellQuest軟件(BectonDickinson)獲取并分析數(shù)據(jù)。本發(fā)明化合物1116對人白血病細胞U937細胞凋亡的影響數(shù)據(jù)圖參見附圖2。從圖2中可以看出，濃度為5pM時，30小時內(nèi)，對照化合物SAHA對U937細胞的凋亡誘導率為18.65%，而化合物11對細胞凋亡的誘導率為16.69%。四、本發(fā)明化合物對p21蛋白表達水平的影響(參考Nebbioso，A.;Clarke,N.等人報道的方法，Nat,Med.2005,11,77-84.)約100|xg總蛋白提取物由15%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，Westernblots檢測。以tubulin作為等量蛋白上樣內(nèi)參。結(jié)果見圖3。從圖3中可以看出，本發(fā)明化合物均可不同程度的促進微管蛋白的乙?；?。五、本發(fā)明化合物化合物對a-微管蛋白乙?；降挠绊?參考Mai,A.;Massa,A.等人報道的方法，J.Med.Chem.2005，48，3344-3353.)約50嗎含有a-微管蛋白的總蛋白提取物由10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，Westernblots檢測。以ERKs作為等量蛋白上樣內(nèi)參。結(jié)果見圖3。從圖3中可以看出，本發(fā)明化合物均可不同程度的促進微管蛋白的乙?；?。六、本發(fā)明化合物對HDACs的抑制作用(參考HeltwegB，JungM等所報道方法，AnalBiochem2002;302:175-83.)使用市售的HDACs抑制活性檢測試劑盒(AK-500，BIOMOL)，以FlurordeLysTM作為底物，HeLa細胞的核提取物中含有不同亞型的HDACs，以及其它一些細胞核因子，這個核提取物可以用于檢測化合物對HDACs的一般抑制活性。具體操作步驟為首先用適量DMSO配制化合物的原液，然后按梯度稀釋化合物，每個化合物有5個不同濃度用于檢測。試驗是在96孔的白色聚苯乙烯微孔板上進行的，具體操作是將含有HDACs的HeLa核提取物與FlurordeLysTM底物以及不同濃度的待檢測化合物混合，于25'C孵化，20分鐘后，加入FlurordeLysTM顯色劑，使用熒光檢測器于360460nm檢測微孔板內(nèi)各個小孔的熒光強度，各個濃度的化合物重復(fù)3遍。試驗結(jié)果見表1。表1本發(fā)明化合物對HDACs的抑制作用<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>8>2.217160.057SAHA0.053--七、本發(fā)明化合物對HDAC1和HDAC4的抑制試驗(參考LovelandBE,JohnsTG,MackayIR等人報道的方法，BiochemInt1992;27:501-10)ZR75.1細胞在IP緩沖液(50mMpH值為7.0的Tri-HCl，180mM氯化納溶液，0.15%NP-40,10%甘油，1.5mM氯化鎂溶液，1mM高錳酸鈉溶液以及0.5mM氟化鈉溶液)中裂解，裂解過程中加入蛋白酶抑制劑(Sigma)。加入lmMDTT，0.2mMPMSF，在冰浴中放置10分鐘，于13000rmp離心30分鐘。取1000嗎提取物，加IP緩沖溶液至l毫升，再預(yù)先加入20^LA/Gplus瓊脂糖(SantaCruz)于搖床上4'C下孵育30分鐘至1小時。取上清液至新的試管中，加入抗體(約34嗎)，于搖床上4'C下過夜使充分免疫共沉淀。HDACl的抗體購于Sigma。陰性對照為與純化的IgG(SantaCruz)免疫共沉淀的等量蛋白提取物。次日，分別在各個免疫共沉淀物中加入20pLA/G和瓊脂糖(SantaCruz)，繼續(xù)孵育2小時。簡單離心，并用冷的IP緩沖溶液多次洗滌以回收未結(jié)合的A/G。樣品在PBS中洗滌兩次，再懸浮至20(iL無菌PBS中。HDAC抑制試驗按照試劑盒生產(chǎn)商(Upstate)的使用說明進行。即將與HDACl(或HDAC4)或純化的IgG免疫共沉淀的樣品分別混合均勻。再取10免疫共沉淀物與事先放射標記并連接有strep加vidine瓊脂頭(Upstate)的"H-組蛋白H4共同孵育。每個試管中需要加入120,000cpm乙酰化的3H-組蛋白H4多肽，1XHDAC緩沖溶液，10nL免疫共沉淀物，再加入HDAC抑制劑(或不加抑制劑作為對照)，最終體積約為200pL。樣品在緩慢旋轉(zhuǎn)的狀態(tài)下于37'C孵育過夜。次日，加入50nL反應(yīng)終止溶液，取100pL樣品，經(jīng)簡單離心后用計數(shù)器檢測，重復(fù)兩次檢測。試驗共進行4組。結(jié)果見表2。表2是本發(fā)明化合物對HDAC1和HDAC4的抑制作用<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>從表2可以看出，本發(fā)明化合物對HDAC1的抑制活性比SAHA弱，但化合物12，15和16對HDAC4的抑制活性遠遠強于SAHA，化合物12對HDAC1和HDAC4的選擇性高達2282.8倍，化合物15和16對HDAC1禾BHDAC4的選擇性分別為201.46和716.72,而SAHAHDAC1和HDAC4的選擇性僅為1.09。八、本發(fā)明化合物對腫瘤細胞的抑制試驗共選用四種腫瘤細胞，分別為HCT116，A549，PC3和HEPG2。將細胞接種于96孔的平板中(每孔約有4000個細胞)，24小時后，將不同濃度的化合物加入至細胞中，48小時后，各小孔中分別加入MTT的PBS溶液(濃度為5mg/ml),于37卩孵育4小時，除去MTT，每個小孔中分別加入100nlDMSO(含量為100%)，于570nm下檢測(采用ThermoMultiskanSpectrum)?；衔?10對腫瘤細胞的的抑制活性數(shù)據(jù)參見表3，化合物1116對腫瘤細胞的抑制活性數(shù)據(jù)參見表4?？梢钥闯?，化合物對不同株腫瘤細胞具有選擇性，化合物對HCT119細胞的細胞毒作用普遍較強。表3本發(fā)明化合物對腫瘤細胞的抗增殖作用<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>表4本發(fā)明化合物對腫瘤細胞的抗增殖作用<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>圖1是本發(fā)明化合物對人白血病細胞U937細胞粒細胞分化的影響。圖2是本發(fā)明化合物對人白血病細胞U937細胞細胞周期和凋亡的影響(圖中每個化合物所對應(yīng)柱狀圖中從左至右四個柱子依次代表G1、S、G2、Apo)。圖3是本發(fā)明化合物對p21蛋白表達水平以及a-微管蛋白乙?；降挠绊懢唧w實施方式移取10.6mL甲苯(0.1mol)，溶于150mLCH2Cl2中，再移取7.96mL氯乙酰氯(O.lmol)，冰浴冷卻至0。C，緩慢加入26.7gA1C13(0.2mol),加畢，加熱至微沸，8小時后，停止加熱，室溫攪拌過夜。將所得混合物傾倒入200g碎冰中，分液，取有機層，水層再用CH2Cl2(50mLx2)萃取，合并有機層，用飽和食鹽水(20mL)洗滌，干燥。濃縮得2-氯-p-甲基苯乙酮粗品，直接進行下一步反應(yīng)。將該粗品用95X乙醇溶解(100mL)，加入硫脲11.4g(0.15mol)，攪拌使充分溶解，加熱回流2h，冷卻至室溫。所得的灰白色沉淀過濾，加少量水得濁液，再用2NKOH調(diào)節(jié)pH至堿性，用乙酸乙酯(100mLx3)萃取，合并萃取液，用飽和食鹽水(20mL)洗滌，干燥。濃縮得粗品，重結(jié)晶后得12.3g，產(chǎn)率為69.3%。取5-p-甲基苯基噻唑-2-氨基A5.0g(26.3mmol)和對甲酰基苯甲酸甲酯5.2g(31.6mmol)溶于無水甲苯中，加熱回流，反應(yīng)過程中生成的水用分水器去除，反應(yīng)2h后，將反應(yīng)液冷卻至室溫。將析出的黃色沉淀.抽濾，用少量冷的甲苯洗滌，置入反應(yīng)瓶中，加入甲醇(50mL)，于室溫攪拌10min.，緩慢加入NaBH41.2gG1.6mmol)，隨后，室溫攪拌30min。將反應(yīng)液濃縮至千，加入50mL水，再用乙酸乙酯(30mLx2)萃取，合并乙酸乙酯液，用10mL飽和食鹽水洗滌。在乙酸乙酯液中滴加濃鹽酸使仲胺成鹽，抽濾得產(chǎn)品鹽酸鹽。將鹽酸鹽用2NNaOH溶液游離后，乙酸乙酯(30mLx2)萃取，合并乙酸乙酯液，用lOmL飽和食鹽水洗漆，無水NaS04干燥，蒸除溶劑后得粗品，重結(jié)晶得5.47g，產(chǎn)率為61.3%。實施例15-，甲基苯基噻唑-2-氨基的制備實施例24-((5-p-甲基苯基噻唑-2-胺基)甲基傳甲酸甲酯的制備實施例34-((乙基(5-p-甲基苯基噻唑-2-基)胺基)甲基傳甲酸甲酯的制備4-((5-p-甲基苯基噻唑-2-胺基)甲基)苯甲酸甲酯1.3g(3.85mmol)溶于無水DMF中，冰浴冷卻至0。C，緩慢加入60%NaH0.185g(4.62mmol)，加畢，于室溫攪30min。移取溴乙烷0.56mL(7.7mmo1)，用2mL無水DMF稀釋后，緩慢地加入反應(yīng)液中，加畢，室溫攪拌3h。在反應(yīng)液中加入20mL水，再用乙酸乙酯(50mLx2)萃取。合并有機相，用飽和食鹽水(lOmL)洗滌，干燥，濃縮至干，柱層析得淺黃色油狀物0.84g，產(chǎn)率為59.8%。將(￡)-3-(5-((芐基(乙基)胺基)甲基)呋喃-2-基)丙烯酸乙酯0.35g(1.0mmol)加入至新鮮配制的羥胺溶液中，隨即加入0.03g(0.5mmol)氫氧化鉀，室溫攪拌2h。將反應(yīng)液傾倒至20mL水中，用2N的鹽酸調(diào)節(jié)pH至7，加乙酸乙酯萃取(15mLx2)，合并乙酸乙酯液，依次用飽和NaHC03溶液，水，飽和食鹽水洗滌，無水NaSCV千燥，濃縮，重結(jié)晶得產(chǎn)品0.15g，產(chǎn)率為41.7%。lH畫R(DMSO-A，300MHz，J，ppm)1.18(t，3H)，2.26(s，3H),3.51(q,2H),4.74(s,2H)，7.00(s,1H),7.17(d,2H,J=7.9)，734(d,2H，J=8.0)，7.73(d,4H,J=8.0);MS(ESI)m/z366(M-l);IR(KBr)v(cm-1)=3449,3253,2975,1609,1547。羥胺溶液的配制方法為取鹽酸羥胺1.28g(18.4mmol)，加入3.2mL甲醇，加熱至4(TC，另取1.03g(18.4mmol)氫氧化鉀，加入6.0mL甲醇充分溶解后，傾倒于鹽酸羥胺的甲醇溶液中，攪拌2min，冷卻至0'C,抽濾除去無機鹽，即得羥胺溶液。制備方法將實施例3中的溴乙烷用溴丙烷替換，其它制備方法同實施例3和4。Yield:40.2%;&NMR(DMSO-4300MHz,3,ppm)0.88(t,3H)，1.64(m，2H)，3.43(t，2H)，4.78實施例4A^羥基-4-((乙基(5-，甲基苯基噻唑-2-基)胺基)甲基)苯甲酰胺(1)的制備實施例5JV-羥基-4-((丙基(5-化甲基苯基噻唑-2-基)胺基)甲基)苯甲酰胺(2)的制備(s,2H),7.07(s,1H)，7.17(d,2H,J-7.9),7.40(d,2H，J=8.0)，7.71(d,4H,J=8.0)，8.98(s，1H)，11.13(s,1H);MS(ESI)m/z380(M-l);IR(KBr)v(cm1)=3462，2954,1630,1550。實施例6iV-羥基-4-((異丙基(5-,甲基苯基噻唑-2-基)胺基)甲基)苯甲酰胺(3)的制備<formula>formulaseeoriginaldocumentpage14</formula>制備方法將實施例3中的溴乙烷用2-溴丙烷替換，其它制備方法同實施例3和4。Yield:38.5%;'H薩R(DMSO-4300MHz,<5，ppm)1.23(s,3H)，1.26(s，3H),2.29(s,3H),4.36(m，1H)，4.67(s，2H),7.05(s，1H),7.16(d，2H,J=8.0)，7.42(d,2H,J=8.3),7.68(d,2H,J=8.1),7.70(d,2H，J=8.3),8.90(s，1H)，11.08(s,1H);MS(ESI)m/z382(M+1);IR(KBr)v(cm")=3439:2975,1658,1644。實施例7W-羥基-4-((丁基(5-p-甲基苯基噻唑-2-基)胺基)甲基)苯甲酰胺(4)的制備<formula>formulaseeoriginaldocumentpage14</formula>制備方法將實施例3中的溴乙烷用溴丁烷替換，其它制備方法同實施例3和4。Yield:40.5%;'H麗R(DMSCW6,300MHz,J，ppm)0.89(t，3H),1.33(m,2H)，1.61(m，2H)，2.29(s,3H)，3,46(t,2H),4.77(s,2H)，7.07(s，1H),7.17(d,2H，J=8.1)，7.40(d，2H，J=8.1),7.72(d:4H,J=7.2),9.04(s,1H)，U.20(s，1H);MS(ESI)m/z418(M+Na);IR(KBr)v(cm")=3288，292，2854,1687。實施例8W-羥基-4-((異丁基(5卞-甲基苯基噻唑-2-基)胺基)甲基)苯甲酰胺(5)的制備<formula>formulaseeoriginaldocumentpage14</formula>制備方法將實施例3中的溴乙垸用異溴丁烷替換，其它制備方法同實施例3和4。Yield:41.7%;&NMR(DMSO-4300MHz,3,ppm)0.90(s，3H),0.92(s,3H)，2.16(m，1H),2.3(s,3H)，4.81(s，2H),5.75(s,2H),7.07(s,1H),7.18(d,2H，J=8.1)，7.39(d，2H，J=8.4),7.71(d，4H,J=8.1)，9.0(s,1H),11.14(s,IH);MS(ESI)m/z3%(M+l);IR(KBr)v(cm。=3286,2922,2850,1627。實施例9AL羥基-4-((戊基(5-p-甲基苯基噻唑-2-基)胺基)甲基)苯甲酰胺(6)的制備<formula>formulaseeoriginaldocumentpage15</formula>制備方法將實施例3中的溴乙垸用溴戊烷替換，其它制備方法同實施例3和4。Yield:42.4%;丄HNMR(DMSO-A,300MHz，&ppm)0.85(t,3H),1.27(m,4H)，1.63(m,2H),2.3(s,3H)，3.46(t,2H)，4,78(s，2H)，7.08(s，IH)，7.1(d，2H，J=8.1),7.4(d，2H，J=7.8)，7.71(d，4H，J=8.1),9.02(s,IH),lU9(s,IH);MS(ESI)m/z410(M+l);IR(KBr)v(cm-1)=3281,2960，2946,1619，1639。實施例10AL羥基-4-((己基(5-，甲基苯基噻唑-2-基)胺基)甲基)苯甲酰胺(7)的制備<formula>formulaseeoriginaldocumentpage15</formula>制備方法將實施例3中的溴乙烷用溴己烷替換，其它制備方法同實施例3和4。Yield:44.1%;'HNMR(DMSO-^,300MHz,<5，ppm)0.84(t,3H),1.27(m，6H),1.61(m,2H),2.3(s,3H)，3.46(t，2H),4.77(s,2H)，7.07(s，IH)，7.17(d,2H,J=8.1)，7.39(d，2H,J=8.1)，7.72(t，4H,J=8.1)，9.01(s，IH)，11.18(s，IH);MS(ESI)ra/z424(M+l);IR(KBr)v(cm")=3217，2932，2854,1687。實施例11iV-羥基-4-((辛基(5-p-甲基苯基噻唑-2-基)胺基)甲基)苯甲酰胺(8)的制備制備方法將實施例3中的溴乙烷用溴辛烷替換，其它制備方法同實施例3和4。Yield:44.6%;'HNMR(DMSO-c4，300MHz,&ppm)0.84(t,3H)，1.25(m,10H),1.61(m,2H)，2.3(s,3H)，3.46(t，2H)，4.77(s，2H),7.08(s,1H),7.17(d,2H，J-7.8),7.39(d,2H，J=7.8)，7.71(d,4H,J=7.8),9.0(s，1H),1.7(s,1H);MS(ESI)m/z450(M-1);IR(KBr)v(cm")=3288，2932,2847，1616,1538。實施例12A^羥基-4-((苯甲基(5-，甲基苯基噻唑-2-基)胺基)甲基)苯甲酰胺(9)的制備制備方法將實施例3中的溴乙烷用溴芐替換，其它制備方法同實施例3和4。Yield:42.5%;NMR(DMSO-《，300MHz,&ppm)2.3(s,3H),4.77(s,2H),4.80(s,2H)，7.09(s:1H)，7.18(d，2H，J=8.0)，7;287.36(m，5H),7.39(d，2H，J=8.1),7.71(d,2H,J=7.9),7.73(d,2H,J=7.9)，8,99(s，1H),11.16(s，1H);MS(ESI)m/z428(M-1);IR(KBr)v(cm")=3443，2925，2847,1634。實施例13^-羥基-4-(((2-(0-甲基苯氧基)乙基)(4-/7-甲基苯基噻唑-2-基)胺基)甲基)苯甲酰胺(10)的制備制備方法將實施例3中的溴乙烷用2-(o-甲基苯氧基)乙基溴替換，其它制備方法同實施例3和4。Yield:41.9%;'HNMR(DMSO-^，300MHz,&ppm)2.1(s,3H)，2.3(s,3H),3.98(t,2H),4.27(t,2H),4.88(s,2H)，6.83(t,1H),6.97(d，1H,J=7.8),7.09(s,1H),7.09~7.13(m,2H),7.17(d,1H,J-8.0),7.41(d,1H，J=8.0),7.71(dd，4H,J-6.7),8.96(s，1H),11.14(s,IH);MS(ESI)m/z472(M-1);IR(KBr)v(cm-1)=3438,2932，1648，1541。實施例14iV-羥基-4-(((2-苯氧基乙基)(4，甲基苯基噻唑-2-基)胺基)甲基)苯甲酰胺(11)的制備制備方法將實施例3中的溴乙烷用2-苯氧基乙基溴替換，其它制備方法同實施例3和4。Yield:41.2%;'HNMR(DMSO-^，300MHz,<5，ppm)2.31(s,3H),3.94(t，2H)，4.28(t，2H)，4.86(s,2H),6.91~6.97(m，3H),7.12(s,IH)，7.18(d，2H,J=8.1),7.25~7.31(m,2H)，7.42(d,2H,J=8.1):7.71(d,2H，J=8.1)，7.72(d,2H,J=7.8)，9.02(s，1H)，lU8(s,IH);MS(ESI)m/z458(M-1);IR(KBr)v(cm4)=3447,2925,1638,1541。實施例15;V-羥基-4-(((2-(p-甲基苯氧基)乙基)(4，甲基苯基噻唑-2-基)胺基)甲基)苯甲酰胺(12)的制備制備方法將實施例3中的溴乙烷用2-(p-甲基苯氧基)乙基溴替換，其它制備方法同實施例3和4。Yield:45.2%;^NMR(DMSO-^，300MHz,5,ppm)2.22(s，3H)，2.25(s,3H),3.91(t,2H),4.24(t,2H)，4.84(s,3H),6.84(d,2H,J=8.4)，7.07(d,2H，J=8.1),7.12(s,1H),7.18(d，2H,J=8.1),7.41(d,2H,J=8.1),7.72(d,2H,J=8.1)，7.73(d，2H，J=8.1),9.05(s,1H),11.17(s，IH);MS(ESI)m/z472(M-1);IR(KBr)v(cm-1)=3615，3566,3459,2911，1648。實施例16W-羥基-4-(((3-苯氧基丙基)(4，甲基苯基噻唑-2-基服基)甲基)苯甲酰胺(13)的制備制備方法將實施例3中的溴乙烷用3-苯氧基丙基溴替換，其它制備方法同實施例3和4。Yield:43.3%;NMR(DMSO-t/6，300MHz,&ppm)2.11(m,2H),2.30(s,3H)，3.67(t,2H),4.02(t，2H)，4.79(s，3H)，6.90~6.93(m，3H)，7.09(s,1H),7.16(d,2H，J-7.8),7.25~7.30(m，2H)，7.40(d,2H，J=7.8),7.72(t,4H),9.0(s，1H)，1L17(s,1H);MS(ESI)m/z472(M-l);IR(KBr)v(cm—1)=3459，1633,1548。實施例17W-羥基-4-(((3-(p-甲基苯氧基)丙基)(4，甲基苯基噻唑-2-萄胺基)甲基)苯甲酰胺(14)的制備制備方法將實施例3中的溴乙垸用3-(p-甲基苯氧基)丙基溴替換，其它制備方法同實施例3和4。Yield:46.1%;!HNMR(DMSO-cf6，300MHz，&ppm)2.06(m，2H)，2.22(s,3H),2.30(s,3H),3.66(t,2H)，3.98(t,2H),4.78(s,2H),6.81(d,2H,J=8.7),7.65(d,2H,J=8.4)，7.09(s，1H),7.16(d，2H,J=8.1),7.39(d，2H，〗=8.1),7.71(d,2H,J=8.1)，7.72(d，2H，J=8.1),9.10(s,1H),11.2(s，1H);MS(ESI)m/z486(M-l);IR(KBr)v(cm—1)=3444,2918,1634,1548。實施例18^-羥基-4-(((4-苯氧基丁基)(4-/;-甲基苯基噻唑-2-基)胺基)甲基)苯甲酰胺(15)的制備<formula>formulaseeoriginaldocumentpage19</formula>制備方法將實施例3中的溴乙垸用4-苯氧基丁基溴替換，其它制備方法同實施例3和4。Yield:43.5%;'H畫R(DMSO-rf6，300MHz,J,ppm)1.62(m，4H)，2.14(s，3H)，3.41(t，2H),3,84(s,2H),4.63(s,2H)，6.73~6.78(m，3H),6.93(s,1H),6.99(d,2H，J=8.1),7.03~7.14(m，2H),7.25(d,2H，J=8.1)，7.56(d,4H，J=8.2)，8.86(s，1H)，11.02(s,1H);MS(ESI)m/z488(M+1);IR(KBr)v(cm')=3594,3416,2847,1644。實施例19^-羥基-4-(((4-0>甲基苯氧基)丁基)(4，甲基苯基噻唑-2-基)胺基)甲基)苯甲酰胺(16)的制備制備方法將實施例3中的溴乙烷用4-(/7-甲基苯氧基)丁基溴替換，其它制備方法同實施例3和4。Yield:41.3%;NMR(DMS0-4，300MHz,(5,ppm)1.76(m,4H),2.22(s,3H),2.97(s,3H)，3.57(t,2H),3.95(t,2H)，4.78(s,2H),6.84(d,2H,J=8.4)，7.06(d，2H,J=8.4),7.08(s，1H)，7.15(d，2H,J=8.1),7.39(d，2H，J-8.1)，7,71(d，2H,J=8.1)，7.72(d,2H,J=8.1)，9.07(s，1H)，11.19(s，1H);MS(ESI)m/z502(M+1);IR(KBr)v(cm-1)=3594,3409,2932,2678,1633。權(quán)利要求1、通式(I)的化合物、其立體異構(gòu)體、水合物或藥學上可接受的鹽其中Ar表示苯環(huán)、吡啶環(huán)或被1～4個X取代基取代的含有0～2個氮原子、硫原子或氧原子的五元或六元芳香環(huán)，其中取代基X是氫、鹵素、氨基、羥基、硝基、氰基、C1-C4的烴基、C1-C4的烷氧基、C1-C4的氨基烷基、C1-C4的烷基胺基、C1-C4的?；1-C4的酰胺基、C1-C4的烷氧基羰基、與苯環(huán)或含有1～2個氮原子或1個硫原子或1個氧原子的五元或六元雜環(huán)連接的C1-C4的烷基或烷氧基；R1表示氫、C1-C8的烴基、與Y取代的苯氧基連接的C2-C6的烴基，Y是氫、C1-C4的烴基或C1-C4的烴氧基。2、權(quán)利要求l的化合物，其中Ar表示對甲基苯基。3、權(quán)利要求1的化合物，其中R,表示乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、戊基、己基或辛基。4、權(quán)利要求l的化合物，其中R!表示2-(o-甲基苯氧基)乙基、2-苯氧基乙基、2-(p-甲基苯氧基)乙基、3-苯氧基丙基、3-(p-甲基苯氧基)丙基、4-苯氧基丁基或4-(p-甲基苯氧基)丁基。5、一種通式UI)的化合物中間體<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>(II)其中Ar、R!的定義同權(quán)利要求l;R2表示氫或d-Q的烷基。6、一種藥物組合物，其中含有權(quán)利要求1的化合物和藥學上可接受的載體。7、權(quán)利要求l的化合物用于制備治療與細胞分化或增殖相關(guān)的疾病的藥物的用途。8、權(quán)利要求7的用途，其中與細胞分化或增殖相關(guān)的疾病是實體瘤或白血病。全文摘要本發(fā)明涉及藥物化學領(lǐng)域，具體涉及一類氧肟酸類組蛋白去乙酰化酶抑制劑(I)，本發(fā)明還公開了這些化合物的制備方法、含其的藥物制劑及其醫(yī)藥用途。文檔編號A61K31/426GK101230049SQ20081002020公開日2008年7月30日申請日期2008年2月27日優(yōu)先權(quán)日2008年2月27日發(fā)明者盧塞爾·安徒生,安吉拉·奈伯遜,尤啟冬,波楊,紅蘇申請人:中國藥科大學