一種用于早期診斷克柔念珠菌的lamp試劑盒及其專用引物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種用于早期診斷克柔念珠菌的LAMP試劑盒及其專用引物，該引物是針對克柔念珠菌標(biāo)準(zhǔn)菌株的ADE2序列為靶序列設(shè)計(jì)的，通過有效性、特異性、敏感性實(shí)驗(yàn)證實(shí)，本發(fā)明的引物能用于早期診斷克柔念珠菌感染，而且具有快速、簡便、操作性強(qiáng)、結(jié)果判讀方便的特點(diǎn)，解決了臨床上克柔念珠菌感染確診時間周期長、對檢測人員技術(shù)和實(shí)驗(yàn)室平臺條件要求高等問題，可制備成試劑盒，在臨床上可用來早期診斷克柔念珠菌感染。
【專利說明】
一種用于早期診斷克柔念珠菌的LAMP試劑盒及其專用引物
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及分子檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，是一種用于早期診斷克柔念珠菌的 LAMP試劑盒及其專用引物。
【背景技術(shù)】
[0002] 侵襲性真菌?。↖nvasive fungal diseases，IFDs)是病原真菌侵犯心、肝、脾、肺、 腎、腦、血液等各系統(tǒng)內(nèi)臟器官而引起的系統(tǒng)感染性疾病。近二十年來，由于免疫抑制劑、各 種體內(nèi)置管技術(shù)的廣泛使用及HIV的持續(xù)蔓延，IFDs的發(fā)病率及死亡率在全球范圍內(nèi)呈持 續(xù)上升的趨勢，中國醫(yī)院感染監(jiān)測網(wǎng)數(shù)據(jù)顯示IFDs現(xiàn)已成為我國院內(nèi)感染第2位的中重要 組成(約占24.1% )，在侵襲性真菌病中以念珠菌為主的酵母樣真菌占91.4%。近年來，侵襲 性念珠菌病的致病菌菌譜亦發(fā)生了較大的變化，白念珠菌感染呈下降趨勢，非白念珠菌病 發(fā)病率有所上升，占所有念珠菌感染的65 %，其中克柔念珠菌發(fā)病率逐年上升，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道 發(fā)病率可達(dá)10%，由于其天然對氟康唑耐藥，但所致的死亡率可高達(dá)49 %，高于白念珠菌侵 襲性感染導(dǎo)致的死亡率(約28% )。
[0003] 克柔念珠菌感染尤其是侵襲性感染的預(yù)后與能否早期診斷密切相關(guān)，因此及時開 發(fā)出快速、特異且易于操作的診斷技術(shù)方法，是目前臨床上所迫切需要解決的重要問題。對 于克柔念珠菌的診斷，國內(nèi)外臨床真菌實(shí)驗(yàn)室目前均主要采用科瑪嘉酵母顯色培養(yǎng)基、 API-20C試劑盒來鑒定克柔念珠菌，其特異性可以較好的滿足臨床需求，但存在假陰性率較 高、耗時長(培養(yǎng)時間至少>1周）等缺陷，因此臨床迫切需要研發(fā)早期、特異、靈敏、廉價、操 作簡便的克柔念珠菌病的早期診斷技術(shù)。
[0004] 目前，以培養(yǎng)、病理檢查為代表的病原真菌形態(tài)學(xué)診斷方法仍然是診斷克柔念珠 菌感染的金標(biāo)準(zhǔn)，但耗時長、陽性率低等局限也嚴(yán)重制約臨床診治水平的提高。近年來，核 酸檢測等分子生物學(xué)技術(shù)方法已經(jīng)在真菌診斷領(lǐng)域有一定的應(yīng)用，這些方法較好地克服了 形態(tài)學(xué)診斷的缺點(diǎn)，操作簡單，可重復(fù)性，有較高的敏感性和特異性，具有較強(qiáng)的臨床應(yīng)用 價值。
[0005] 目前分子生物學(xué)技術(shù)方法主要包括基于核酸和蛋白檢測兩種，其中基于蛋白檢測 的為MALDI - T0F，基于核酸的技術(shù)主要是針對特異性DNA序列，如基于PCR擴(kuò)增的技術(shù)、分子 雜交以及核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)。Mette D.Jacobsen等利用ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、NMT1、TRP1 這6個特異性基因位點(diǎn)來對克柔念珠菌進(jìn)行分型。
[0006] 綜上所述，基于DNA序列分析，嘗試找出一種可以快速、簡便、操作性強(qiáng)、結(jié)果判讀 方便的快速早期診斷克柔念珠菌感染的技術(shù)方法，將為臨床上早期診斷和及時治療提供便 利，對于解決臨床上克柔念珠菌感染確診時間周期長、對檢測人員技術(shù)和實(shí)驗(yàn)室平臺條件 要求高等問題具有十分重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種可早期診斷克柔念珠菌感染的 引物組。
[0008] 本發(fā)明的再一的目的是，提供如上所述引物組的用途。
[0009] 本發(fā)明的另一的目的是，提供一種可用于早期診斷克柔念珠菌的試劑盒。
[0010] 本發(fā)明的第四個目的是，提供如上所述試劑盒的用途。
[0011] 本發(fā)明的第五個目的是，提供一種克柔念珠菌快速檢測的方法。
[0012] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：
[0013] -種可早期診斷克柔念珠菌感染的引物組，，所述的引物組包括外引物F3、外引物 B3、內(nèi)引物FIP、內(nèi)引物BIP、環(huán)引物L(fēng)B，其核苷酸序列分別如下所示：
[0019] 為實(shí)現(xiàn)上述第二個目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：
[0020] 如上所述的引物組在制備早期診斷克柔念珠菌感染的試劑中的用途。
[0021] 如上所述的引物組在制備早期診斷克柔念珠菌感染的試劑盒中的用途。
[0022] 如上所述的引物組制備試劑中的用途，所述試劑用于從白色念珠菌、近平滑念珠 菌、熱帶念珠菌、光滑念珠菌、星形假絲酵母、葡萄牙假絲酵母、杜氏假絲酵母、小紅酵母、紅 色毛癬菌、煙曲霉菌、新生隱球菌、格特隱球菌、紫色毛癬菌、阿薩希毛孢子菌、膠紅酵母、小 紅酵母中鑒別出克柔念珠菌。
[0023]為實(shí)現(xiàn)上述第三個目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：
[0024] -種可用于早期診斷克柔念珠菌的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包含下列核 苷酸序列：SEQN0.6、SEQN0.7、SEQN0.8、SEQN0.9、SEQN0.10所示的核苷酸序列 [0025]優(yōu)選地，所述試劑盒包括以下組分：
[0026] (1)引物溶液：由SEQ ID N0.6-10所述的5條引物配置的引物溶液，所述外引物 ADE2-F3、外引物ADE2-B3、內(nèi)引物ADE2-FIP、內(nèi)引物ADE2-BIP、環(huán)引物ADE2-LB的濃度依次為 5ymol/L、5ymol/L、40ymol/L、40ymol/L、5ymol/L;
[0027] (2)鏈置換 DNA 聚合酶(8,000units/ml)
[0028] (3)dNTPs 溶液（2.5mol/L)
[0029] (4)10X反應(yīng)緩沖液：200mM Tris-HCl，100mM(NH4)2S〇4，100mM KCl，20mM MgS〇4， l%Triton Χ-100，ρΗ8·8。
[0030] 為實(shí)現(xiàn)上述第四個目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：
[0031] 如上所述的試劑盒在制備早前診斷克柔念珠菌感染試劑中的應(yīng)用。
[0032] 為實(shí)現(xiàn)上述第五個目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：
[0033 ] -種克柔念珠菌快速檢測的方法，包括以下步驟：
[0034] (1)提取待檢測樣品DNA;
[0035] (2)以提取的DNA為模板，利用SEQ ID N0.6-10所述的LAMP引物組進(jìn)行LAMP擴(kuò)增；
[0036] (3)LAMP擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后按照以下任意一種方式觀察結(jié)果：
[0037] 1)向擴(kuò)增產(chǎn)物中加入顯色劑，輕晃混勻，反應(yīng)結(jié)束后，擴(kuò)增產(chǎn)物具有綠色熒光，表 明樣本中含有克柔念珠菌；
[0038] 2)取擴(kuò)增產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠電泳中電泳，EB染色，在紫外燈下觀測，擴(kuò)增產(chǎn)物 呈梯形條帶，表明樣本中含有克柔念珠菌；
[0039]所述LAMP擴(kuò)增反應(yīng)體系所用的引物混合液由SEQ ID N0.6-10所示的5條引物配 置，所述外引物ADE2-F3、外引物ADE2-B3、內(nèi)引物ADE2-FIP、內(nèi)引物ADE2-BIP、環(huán)引物ADE2-LB 的濃度依次為 5ymol/L、5ymol/L、40ymol/L、40ymol/L、5ymol/L。
[0040]本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)在于：
[0041 ] 1、本發(fā)明針對克柔念珠菌的特異ADE2序列為靶序列，設(shè)計(jì)出數(shù)套引物，通過實(shí)驗(yàn) 從中篩選出反應(yīng)速率最快，擴(kuò)增效率最高的引物組(SEQ ID N0.6-10)。
[0042] 2、在對引物進(jìn)行篩選之后，通過對6株克柔念珠菌標(biāo)準(zhǔn)株驗(yàn)證其有效性，同時與其 他常見致病真菌如念珠菌屬其他常見致病菌、隱球菌（Cryptococcus )、毛孢子菌 (Trichosporon)、膠紅酉孝母（Rhodotorula mucilaginosa)、煙曲霉 (Aspergillusfumigatus)等分別反應(yīng)驗(yàn)證擴(kuò)增的特異性;并且對克柔念珠菌DNA進(jìn)行稀釋， 檢測反應(yīng)的敏感性，獲得最低陽性檢出率的濃度。
[0043] 3、結(jié)果證明本發(fā)明的引物能用于克柔念珠菌感染的早期診斷。并且較培養(yǎng)、鏡檢 等方法更快、更方便，且這種方法可操作性強(qiáng)，結(jié)果判讀方便，解決了在臨床上克柔念珠菌 感染確診周期長，對實(shí)驗(yàn)室及檢測人員要求高等問題，可制備成試劑盒，為臨床上克柔念珠 菌感染的早期診斷和及時治療提供便利。
【附圖說明】
[0044]附圖1為LAMP技術(shù)擴(kuò)增原理圖。圖1A:FIP引物與模板DAN互補(bǔ)鏈上的互補(bǔ)區(qū)段結(jié)合 (即FIP的F2與互補(bǔ)鏈F2c區(qū)段結(jié)合），通過鏈置換DNA聚合酶作用，以FIP引物的3'末端為一 點(diǎn)，與模板DNA鏈相同序列的一條DNA單鏈便合成了，F(xiàn)3引物從FIP引物外側(cè)與互補(bǔ)鏈F3c區(qū) 段結(jié)合，以F3引物的3'末端為起點(diǎn)，通過鏈置換DNA酶的作用將剛由FIP引物合成的DNA鏈剝 離，一邊合成新的DNA鏈，通過堿基配對延伸，形成了與互補(bǔ)鏈互補(bǔ)的雙鏈，而剛才被F3引物 合成的DNA剝離的單鏈由于在其5'末端含有互補(bǔ)的F1和Flc區(qū)段，通過堿基互補(bǔ)形成環(huán)狀結(jié) 構(gòu);BIP引物與形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)的DNA鏈進(jìn)行堿基配對，以BIP引物的3 '末端為合成起點(diǎn)，合成 互補(bǔ)DNA鏈并將循環(huán)結(jié)構(gòu)剝離延伸成直線結(jié)構(gòu)，接著B3引物從BIP引物外側(cè)插入進(jìn)行堿基配 對，以3'末端為起點(diǎn)，一邊剝離之前合成的BIP引物DNA鏈DNA合成;而以BIP引物為模板合成 的單鏈剝離下后，由于其3'端有互補(bǔ)的Flc和F1區(qū)段，5'端有互補(bǔ)的B1和Blc區(qū)段，所以整條 鏈自動彎曲形成啞鈴狀結(jié)構(gòu)，這就是LAMP反應(yīng)的起始結(jié)構(gòu)。圖1B:為四條引物的結(jié)構(gòu)和其分 別與靶基因 DNA雙鏈結(jié)合的位置。其中BIP由B2和Blc組成，B2是和靶序列互補(bǔ)鏈所對應(yīng)的位 置完全相同的一段序列，Blc則和靶序列的Blc段完全相同序列；同理，在與靶序列互補(bǔ)鏈 上，F(xiàn)IP由F2和Flc組成，F(xiàn)2是和靶序列對應(yīng)的位置完全相同的一段序列，即與互補(bǔ)鏈互補(bǔ)， 而Flc則和靶序列的Blc段互補(bǔ)，即與該互補(bǔ)鏈的Blc段完全相同。在此基礎(chǔ)上，在啞鈴狀5' 末端的環(huán)狀單鏈部分導(dǎo)入具有互補(bǔ)序列的環(huán)引物B Loop Primer，以此增加 DNA合成的起 點(diǎn)，在一定程度上可以縮短反應(yīng)時間。
[0045] 附圖2為根據(jù)克柔念珠菌的ADE2序列設(shè)計(jì)出的兩套引物以及陽性和陰性對照樣本 擴(kuò)增曲線圖。其中系列1和5為ATCC2159菌株的DNA分別在第一套和第二套引物作用下的反 應(yīng)結(jié)果；系列2和6為ATCC14053菌株的DNA分別在第一套和第二套引物作用下的反應(yīng);3和7 為ATCC22019菌株的DNA分別在第一套和第二套引物作用下的反應(yīng);4和8則為ddH 20的陰性 對照。
[0046] 附圖3為克柔念珠菌及其他菌株的凝膠電泳圖。其中：1、ATCC(F)C6d(克柔念珠 菌），2、ATCC 2159(克柔念珠菌），3、SCZ50016(克柔念珠菌），4、SCZ50018(克柔念珠菌），5、 SCZ50019(克柔念珠菌），6、SCZ50020(克柔念珠菌），7、SCZ60037(白念珠菌），8、SCZ50048 (光滑念珠菌），9、SCZ60053(熱帶念珠菌），10、ATCC22019(近平滑念珠菌），11、SCZ50021 (平 滑假絲酵母），12、ATCC10667(星型假絲酵母），13、SCZ50145(新生隱球菌），14、SCZ60093(紅 色毛癬菌），15、CBS319(小紅酵母），16、SCZ50113(阿薩希毛孢子菌）。
[0047] 附圖4為LAMP反映后各管濁度表現(xiàn)結(jié)果。其中：l、ddH20,2、SCZ501453、ATCC22019， 4、SCZ60053，5、SCZ50048，6、SCZ60037，7、ATCC 2159，8、ATCC(F)C6d。
[0048]附圖5為不同的克柔念珠菌及其他菌株DNA的可見性實(shí)驗(yàn)反應(yīng)結(jié)果。由左至右依次 為：l、ddH20,2、SCZ50145,3、ATCC22019,4、SCZ60053,5、SCZ50048,6、SCZ60037,7、ATCC 2159,8、ATCC(F)C6d;在LAMP反應(yīng)條件下，63°C，60分鐘后，陽性樣本表現(xiàn)為熒光綠。
[0049]附圖6為不同濃度克柔念珠菌DNA擴(kuò)增后電泳圖。其中：1、20ng，2、2ng，3、200pg，4、 20pg，5、2pg，6、200fg，7、20fg，8、ddH2〇。
[0050]附圖7為不同濃度克柔念珠菌DNA擴(kuò)增速率曲線圖。
【具體實(shí)施方式】
[0051]下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā) 明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明記載的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù) 人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限 定的范圍。
[0052]實(shí)施例1用于早期診斷克柔念珠菌感染引物的篩選及其特異性和敏感性驗(yàn)證 [0053] 一、主要實(shí)驗(yàn)材料及設(shè)備 [0054] 1.菌株
[0055] 選擇包括6株克柔念珠菌的標(biāo)準(zhǔn)菌株、臨床菌株，分別為:ATCC(F)C6d、ATCC 2159、 SCZ50016、SCZ50018、SCZ50019、SCZ50020,以及用于驗(yàn)證LAMP法特異性的其他臨床常見菌 株，共20株標(biāo)準(zhǔn)株及20株臨床株，所有菌株來至于上海市醫(yī)學(xué)真菌分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 菌種庫，共計(jì)46株。
[0056] 2.設(shè)備
[0057] 超凈工作臺：CA-1390-1垂直層流潔凈工作臺，上海上凈凈化設(shè)備有限公司；生物 安全柜:NUAIRE Biological Safefy Cabinet Class II;隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱:Heraeus B5060EKC02;純水機(jī)：HITECH water purification system;微量移液槍：0.5 ~10μ1 (EppendorfResearch)，0~200μ1(EppendorfResearch)，ΙΟΟΟμΙ(EppendorfResearch);高 壓消毒鍋:SANYOAutoCLAVE MLS-3020;Colibri :上海達(dá)邁生物科技公司；Loopamp LA-320C 實(shí)時池度儀：北京藍(lán)譜生物科技有限公司；高速離心機(jī)：Eppendorf centrifuge 5810R， EppendorfNorth America, Inc.;制冰機(jī):Scotsman AF100;恒溫水浴箱:上海精密儀器;PCR 儀器:BIORAD ClOOOTouch，美國產(chǎn)；電泳儀:TAN ETS 300,國產(chǎn);凝膠成像分析系統(tǒng):FR-980 復(fù)生物電泳圖像分析系統(tǒng)。
[0058] 3.試劑及培養(yǎng)基
[0059] YPD 培養(yǎng)基：l%Yeast Extract(酵母提取物）：0X0ID，2%Peptone(蛋白胨）： 0X0ID，2%Dextr〇se(葡萄糖）：上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。
[0060] 馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA): 20%馬鈴薯，2%葡萄糖，2%瓊脂，100ml水，將馬 鈴薯洗凈，去皮并切成小塊，立即投入水中煮沸20分鐘，紗布過濾，保留濾液并加入其他成 分，加熱使瓊脂融化，補(bǔ)足水量，分裝，121°C滅菌20分鐘，冷卻至60 °C左右，每個無菌培養(yǎng)皿 分裝15~20ml，凝固后倒置，4°C冰箱保存。
[0061 ] 沙堡弱氏培養(yǎng)基（SDA):l%Peptone(蛋白胨）：(《010,4%〇61杜〇86(葡萄糖）：上海 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，1.5%瓊脂粉:上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。
[0062] 科瑪嘉培養(yǎng)基:法國科瑪嘉生物科技公司。
[0063] Loopamp DNA amplification kit:日本榮研化學(xué)株式會社。
[0064] Loopamp焚光目視檢測試劑盒：日本榮研化學(xué)株式會社。
[0065] ADE2序列引物：上游引物ADE2F: 5-GTCACTTCTCAGTTTGAAGC-3(SEQ IDN0 · 11);下游 引物ADE2R: 5-ACACCATCTAAAGTAGAGCC-3 (SEQ ID NO. 12)，引物由上海生工合成。
[0066] TIANGEN 2Xpfu PCR MasterMix高保真酶，北京天根生物科技有限公司。
[0067] DNAMarker(Trans2K plus II):上海寶生物工程有限公司（TAKARA)。
[0068] 分析純氯化芐:生工上海生物科技有限公司。
[0069] 真菌DNA抽提液：lmL 1M Tris .Hcl，4mL 500mM EDTA，加 ddH2〇定容至 10mL。
[0070] AR級3MNaAc，20 % SDS溶液，異丙醇溶液，70 %乙醇溶液。
[0071] 4.其他耗材
[0072] 12CM培養(yǎng)皿:上海卓康生物科技有限公司；微量移液器吸頭:上海卓康生物科技有 限公司;EP管（1.5ml、5ml):上海卓康生物科技有限公司;PCR八連管:Bio-Rad公司。
[0073]二、試驗(yàn)方法
[0074] 1.革巴序列的確定及引物設(shè)計(jì)
[0075] 1.1靶序列為克柔念珠菌標(biāo)準(zhǔn)菌株的ADE2序列
[0076] 來自于Jacob sen，M · D · Gow · N. A.Maiden，M · C · Shaw，D · J · Odds，F(xiàn) · C ·等所著論文 "train typing and determination ofpopulation structure ofCandida krusei by multilocus sequence typing."JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY,Feb.2007,p.317-3230095-1137/07/$08·OOOdoi:10·1128/JCM.01549-06·
[0077] 1.2引物設(shè)計(jì)
[0078] 設(shè)計(jì)出多條ADE2對應(yīng)的LAMP反應(yīng)引物，通過敏感性及特異性比較，篩選出2套具有 代表性的引物，序列如下所示。
[0079] 第一套引物序列如下：

[0091] 上述引物與靶序列結(jié)合并成環(huán)的結(jié)構(gòu)位點(diǎn)如圖1(A、B)所示。
[0092] 1.3引物篩選
[0093]將上述涉及的兩套引物分別于模板DNA按照LAMP反應(yīng)體系加樣，置于Loopamp LA-320C實(shí)時濁度儀中反應(yīng)，預(yù)設(shè)反應(yīng)溫度為63°C，反應(yīng)時間為60min。LAMP反應(yīng)體系如下:總體 積25yL，包括lyL FIP(40ymol/L)、lyL BIP(40ymol/L)、lyL F3(5ymol/L)、lyL B3(5ymol/ L)、lyL環(huán)引物（5ymol/L)、12.5yL2XReaction Mix、lyL Bst DNAPolymerase、5.5yL ddH20、lyL DNA。反應(yīng)結(jié)束后觀察兩套引物的反應(yīng)擴(kuò)增曲線，并對所選引物進(jìn)行敏感性和特 異性的驗(yàn)證。
[0094] 2待驗(yàn)證菌株全基因組DNA抽提
[0095] 2.1菌株的復(fù)蘇與培養(yǎng)
[0096] (1)各標(biāo)準(zhǔn)株的復(fù)蘇與培養(yǎng):取出-80°C保藏的隱球菌標(biāo)準(zhǔn)株及臨床株，置于20°C 下復(fù)蘇24小時，使其恢復(fù)繁殖活力。在無菌條件下，分別將ATCC(F)C6d、ATCC 2159等6株克 柔念珠菌標(biāo)準(zhǔn)株及所選定的其他標(biāo)準(zhǔn)菌株及臨床菌株轉(zhuǎn)種到沙堡氏培養(yǎng)基(SDA)斜面培養(yǎng) 基，30 °C孵育培養(yǎng)48-72小時。
[0097] (2)臨床分離株的培養(yǎng)和鑒定:臨床標(biāo)本來源菌株均來自于長征醫(yī)院真菌檢驗(yàn)室， 經(jīng)過SDA培養(yǎng)基或PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)，念珠菌屬轉(zhuǎn)至科瑪嘉培養(yǎng)基培養(yǎng)，通過培養(yǎng)觀察培養(yǎng)基 變色情況初步判斷為熱帶念珠菌、近平滑念珠菌;絲狀真菌通過鏡檢及培養(yǎng)等表型檢測初 步判斷，所有隱球菌通過墨汁染色初步判斷并轉(zhuǎn)至咖啡酸培養(yǎng)基培養(yǎng)。
[0098] 2.2氯化芐法抽提各標(biāo)準(zhǔn)菌株及部分臨床隱球菌全基因組DNA
[0099] (1)EP管中加入500yL真菌DNA抽提液，從SDA培養(yǎng)基中挑取火柴頭大小體積菌落， 后劇烈震蕩lmin;
[0100] (2)在EP管中加入50yL 20%SDS和300yL氯化芐溶液，劇烈震蕩，至溶液呈乳狀，將 EP管置于50°C水浴一小時，每十分鐘震蕩混合一次；
[0101] (3)水浴結(jié)束，加入300yL 3M NaAc(醋酸鈉)冰水浴15分鐘；
[0102] (4)將冰水浴后的EP管置于高速離心機(jī)中，選擇6000rpm轉(zhuǎn)速，15min后，小心吸出 上清并轉(zhuǎn)移至干凈EP管中；
[0103] (5)在已轉(zhuǎn)移出的上清中加入等體積預(yù)冷的異丙醇，室溫下沉淀20min，再次離心， 轉(zhuǎn)速為 lOOOOrpm，15min;
[0104] ( 6 )取出EP管，小心棄上清，并在沉淀中加入等體積預(yù)冷的7 0 %乙醇，再次 lOOOOrpm，lOmin離心；
[0105] (7)離心結(jié)束后，棄上清，小心將沉淀置于室溫下風(fēng)干，并50yL TE溶解。將上述DNA 置于-20°C冰箱冷藏保存。
[0106] 2.3分光分度計(jì)檢測各菌株基因組DNA及其濃度利用Eppendorf Biophotometer分 光分度計(jì)，按操作手冊操作檢測基因組DNA的濃度。
[0107] 3特異性實(shí)驗(yàn)
[0108] 3.1LAMP 反應(yīng)
[0109]將篩選出的兩套引物分別與上述步驟已準(zhǔn)備好的兩株克柔念珠菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(ATCC (F)C6d和ATCC2159)的DNA、一株白念珠菌臨床菌株(SCZ60037)DNA及雙蒸水按照LAMP體系， 63°C，60min進(jìn)行反應(yīng)，觀察分別的擴(kuò)增反應(yīng)情況。其中克柔念珠菌為陽性對照，白念珠菌和 雙蒸水為陰性對照。
[0110] LAMP反應(yīng)體系如下：總體積25yL，包括lyL FIP(40ymol/L)、lyL BIP(40ymol/L)、l yL F3(5ymol/L)、lyL B3(5ymol/L)、lyLLB(5ymol/L)、12.5yL2XReaction Mix、lyL Bst DNAPolymerase、5.5yL ddH2〇、lyL DNA〇
[0111] 3.2LAMP凝膠電泳檢查
[0112] (1)用HE120電泳儀提供的灌膠模具灌制12X6厘米的1.5%瓊脂糖凝膠:在燒杯中 加入1.5g瓊脂糖，1M TAE，定容至100mL后充分混勻，加熱煮沸，立即將膠液加入灌膠板中， 避免產(chǎn)生大量氣泡，室溫放置至凝膠凝固；
[0113] (2)在裝有 1 XTAE緩沖液(40mM Tris-Acetic acid，pH8.0，lmM EDTA)的電泳槽 內(nèi)，小心平放入瓊脂凝膠，使其浸沒；
[0114] (3)每個PCR反應(yīng)體系中抽取10yL，分別與5yL Ladder Buffer充分混合后上樣于 1.5 %的瓊脂凝膠；
[0115] (4)120 伏電壓電泳 30min;
[0116] (5)將瓊脂凝膠浸入EB溶液15min;
[0117] (6)小心取出后浸入雙蒸水中l(wèi)Omin;
[0118] (7)取出瓊脂凝膠經(jīng)FR-980復(fù)日生物電泳圖像分析系統(tǒng)拍照。
[0119] 3.3LAMP可見性實(shí)驗(yàn)
[0120] 重復(fù)上述特異性實(shí)驗(yàn)，在LAMP管中依次加入F3、B3、FIP、BIP、LB引物，緩沖液，鏈置 換DNA聚合酶等，依次加入兩株克柔念珠菌標(biāo)準(zhǔn)菌株以及其他種屬的標(biāo)準(zhǔn)株或臨床標(biāo)本中 分離出的菌株，在配好各組LAMP反應(yīng)體系后，在LAMP管中依次加入lyL鈣黃綠素以指示實(shí)驗(yàn) 結(jié)果。63 °C，60min反應(yīng)結(jié)束后，取出反應(yīng)管觀察各組顏色變化。
[0121] 4敏感性試驗(yàn)
[0122] 4.1擴(kuò)增曲線
[0123] 將克柔念珠菌ATCC2159全基因組DNA濃度分別十倍梯級稀釋數(shù)次，使DNA含量分別 為20ng、2ng、0 · 2ng、0.02ng、2pg、0 · 2pg、0 · 02pg、2fg、0 · 2fg、0.02fg、0.002fg。將上述不同 濃度梯度的DNA分別按照LAMP體系，63°C，60min反應(yīng)，結(jié)束后觀察擴(kuò)增情況。最后一管設(shè)立 不含DNA組為陰性對照。
[0124] 4.2LAMP可見性實(shí)驗(yàn)
[0125] LAMP可見性重復(fù)上述步驟，在配好各組LAMP反應(yīng)體系后，在LAMP管中依次加入lyL 鈣黃綠素以指示實(shí)驗(yàn)結(jié)果。63°C，60min反應(yīng)結(jié)束后，取出反應(yīng)管觀察各組顏色變化。
[0126] 4.3LAMP產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳檢查
[0127] (1)用HE120電泳儀提供的灌膠模具灌制12X6厘米的1.5%瓊脂糖凝膠:在燒杯中 加入1.5g瓊脂糖，1M TAE，定容至100mL后充分混勻，加熱煮沸，立即將膠液加入灌膠板中， 避免產(chǎn)生大量氣泡，室溫放置至凝膠凝固；
[0128] (2)在裝有 1 XTAE緩沖液(40mM Tris-Acetic acid，pH8.0，lmM EDTA)的電泳槽 內(nèi)，小心平放入瓊脂凝膠，使其浸沒；
[0129] (3)每個PCR反應(yīng)體系中抽取10yL，分別與5yL Ladder Buffer充分混合后上樣于 1.5 %的瓊脂凝膠；
[0130] (4)120 伏電壓電泳 30min;
[0131] (5)將瓊脂凝膠浸入EB溶液15min;
[0132] (6)小心取出后浸入雙蒸水中l(wèi)Omin;
[0133] (7)取出瓊脂凝膠經(jīng)FR-980復(fù)日生物電泳圖像分析系統(tǒng)拍照。
[0134] 三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0135] 1引物驗(yàn)證及篩選
[0136] 兩套引物和陽性對照、陰性對照樣本擴(kuò)增曲線如圖2所示。結(jié)果表明：⑴根據(jù)ADE2 序列設(shè)計(jì)出的兩套引物均可以引起擴(kuò)增反應(yīng)，其中ADE2-1套引物引起擴(kuò)增反應(yīng)時間起始較 晚，（2)根據(jù)ADE2設(shè)計(jì)出的兩套引物中的第一套出現(xiàn)了非特異性擴(kuò)增。
[0137] 2特異性實(shí)驗(yàn)
[0138] 2.1將篩選出的第二套引物分別與各標(biāo)準(zhǔn)株及臨床株的DNA按照LAMP反應(yīng)體系進(jìn) 行反應(yīng)，分別觀察擴(kuò)增反應(yīng)情況。具體反應(yīng)結(jié)果如表1和表2所示。
[0139] 表1LAMP實(shí)驗(yàn)用標(biāo)準(zhǔn)株及其LAMP反應(yīng)結(jié)果
[0141] 注:P表示陽性反應(yīng)，N表示陰性反應(yīng)。
[0142] 表2LAMP實(shí)驗(yàn)用臨床株及其LAMP反應(yīng)結(jié)果
[0143]

[0145] 注:SCZ表示來源于長征醫(yī)院皮膚科門診患者或其他科室送至我科真菌檢查室標(biāo) 本。
[0146] 2.2針對所選定的特異性引物，6株克柔念珠菌標(biāo)準(zhǔn)菌株及部分其他標(biāo)準(zhǔn)或臨床菌 株LAMP反應(yīng)后凝膠電泳圖3所示。
[0147] 由上述結(jié)果可知:第二套引物在LAMP反應(yīng)體系具有良好的特異性，除了克柔念珠 菌外，其他菌株包括SCZ60037(白念珠菌）、SCZ50048(光滑念珠菌）、SCZ60053(熱帶念珠 菌）、ATCC22019(近平滑念珠菌）、SCZ50021(平滑假絲酵母）、ATCC10667(星型假絲酵母）、 SCZ50145(新生隱球菌）、SCZ60093(紅色毛癬菌）、CBS319(小紅酵母）、SCZ50113(阿薩希毛 孢子菌)均未出現(xiàn)擴(kuò)增反應(yīng)，說明該引物對克柔念珠菌具有較好的特異性。
[0148] 2.3可見性試驗(yàn)
[0149] (1)針對第二套引物，LAMP反應(yīng)后各管的濁度如圖4所示?？筛鶕?jù)擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后 LAMP管濁度的變化判斷是否發(fā)生的擴(kuò)增，如果反應(yīng)管渾濁則表示該管內(nèi)含有目的基因，發(fā) 生了擴(kuò)增反應(yīng);反之，如果反應(yīng)管清亮，則表示該管內(nèi)不含有目的基因，未發(fā)生擴(kuò)增反應(yīng)。
[0150] (2)針對第二套引物，在反應(yīng)過程中加入熒光染料，反應(yīng)結(jié)束后各管反應(yīng)如圖5所 不。
[0151] 3敏感性試驗(yàn)
[0152] 3.1擴(kuò)增曲線
[0153] 針對選定的第二套引物，使用不同濃度的ATCC2159DNA與引物反應(yīng)后擴(kuò)增曲線如 圖 6 所示，編號 1 -8 分別表示的 DNA 濃度為：20ng、2ng、200pg、20pg、2pg、200f g、20f g、ddH2〇。 由圖6的擴(kuò)增曲線可以看出，基于克柔念珠菌標(biāo)準(zhǔn)菌株的ADE2序列的LAMP敏感性可達(dá)到 200pg。附圖7為不同濃度克柔念珠菌DNA擴(kuò)增速率曲線圖。
[0154] 實(shí)施例2用于早期診斷克柔念珠菌的試劑盒
[0155] 試劑盒中包含有下列試劑盒材料：
[0156] 1、引物溶液:ADE2-F3(SEQ ID N0.6,5ymol/L)、ADE2-B3(SEQ ID N0.7,5ymol/L)、 ADE2-BIP(SEQ ID N0.9,40ymol/L)、ADE2-FIP(SEQ ID N0.8,40ymol/L)、ADE2-LB(SEQ ID NO.10,5ymol/L)〇
[0157] 2、dTNPs(2.5mol/L)。
[0158] 3、鏈置換DNA聚合酶(8，OOOunits/ml)。
[0159] 4、10\反應(yīng)緩沖液，組成包括:200111]\11^8-!1(：1，1001111(順4)2304，10011111((：1，20111]\1 MgS〇4，l%Triton Χ-100，ρΗ8·8〇
[0160] 以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人 員，在不脫離本發(fā)明方法的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和補(bǔ)充，這些改進(jìn)和補(bǔ)充也應(yīng)視為 本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種可早期診斷克柔念珠菌感染的引物組，其特征在于，所述的引物組包括外引物 F3、外引物B3、內(nèi)引物FIP、內(nèi)引物BIP、環(huán)引物L(fēng)B，其核苷酸序列分別如下所示： 外引物ADE2-F3: AGACATAGAACCCGAAACA(SEQ ID NO · 6); 外引物ADE2-B3:TTGCTTTTCTACTCCCCAA(SEQ ID N0.7); 內(nèi)引物ADE2-FIP: CAAGCGCTTCTGTCTATCTTTACGGGTTAACATGACCCATTTTTCTCT( SEQ ID NO.8)； 內(nèi)引物ADE2-BIP : TGCTCTTCTACAAAGTTCAAGTTCGACAAATGCCATTATGCTCAA( SEQ ID NO.9)； 環(huán)引物ADE2-LB: CCATTTGGCACATCAGACCC(SEQ ID NO · 10)。2. 權(quán)利要求1所述的引物組在制備早期診斷克柔念珠菌感染的試劑中的用途。3. 權(quán)利要求1所述的引物組在制備早期診斷克柔念珠菌感染的試劑盒中的用途。4. 權(quán)利要求1所述的引物對在制備試劑中的用途，其特征在于，所述試劑用于從白色念 珠菌、近平滑念珠菌、熱帶念珠菌、光滑念珠菌、星形假絲酵母、葡萄牙假絲酵母、杜氏假絲 酵母、小紅酵母、紅色毛癬菌、煙曲霉菌、新生隱球菌、格特隱球菌、紫色毛癬菌、阿薩希毛孢 子菌、膠紅酵母、小紅酵母中鑒別出克柔念珠菌。5. -種可用于早期診斷克柔念珠菌的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包含下列核苷 酸序列：SEQ NO.6、SEQ NO. 7、SEQ NO.8、SEQ NO.9、SEQ NO. 10所示的核苷酸序列。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括以下組分： (1) 引物溶液：由權(quán)利要求1所述的5條引物配置的引物溶液，外引物ADE2-F3、外引物 ADE2-B3、內(nèi)引物ADE2-FIP、內(nèi)引物ADE2-BIP、環(huán)引物ADE2-LB的濃度依次為5ymol/L、5ymol/ L、40ymol/L、40ymol/L、5ymol/L; (2) 鏈置換DNA聚合酶(8，OOOunits/ml); (3) dNTPs 溶液（2.5mol/L); (4) 10X 反應(yīng)緩沖液：200mM Tris-HCl，100mM(NH4)2S〇4，100mM KCl，20mM MgS〇4，l% Triton X-100?pH8.8〇7. 權(quán)利要求5或6所述的試劑盒在制備早期診斷克柔念珠菌感染試劑中的應(yīng)用。8. -種克柔念珠菌快速檢測的方法，其特征在于，包括以下步驟： (1) 提取待檢測樣品DNA; (2) 以提取的DNA為模板，利用權(quán)利要求1所述的LAMP引物組進(jìn)行LAMP擴(kuò)增； (3) LAMP擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后按照以下任意一種方式觀察結(jié)果： 1) 向擴(kuò)增產(chǎn)物中加入顯色劑，輕晃混勻，反應(yīng)結(jié)束后，擴(kuò)增產(chǎn)物具有綠色熒光，表明樣 本中含有克柔念珠菌； 2) 取擴(kuò)增產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠電泳中電泳，EB染色，在紫外燈下觀測，擴(kuò)增產(chǎn)物呈梯 形條帶，表明樣本中含有克柔念珠菌； 所述LAMP擴(kuò)增反應(yīng)體系所用的引物混合液由權(quán)利要求1所述的5條引物配置，所述外引 物ADE2-F3、外引物ADE2-B3、內(nèi)引物ADE2-FIP、內(nèi)引物ADE2-BIP、環(huán)引物ADE2-LB的濃度依次 為5ymol/L、5ymol/L、40ymol/L、40ymol/L、5ymol/L〇
【文檔編號】C12N15/11GK105950740SQ201610369663
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2016年5月30日
【發(fā)明人】陳敏, 劉加, 方文捷, 洪南, 潘煒華, 廖萬清
【申請人】中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)