一種用于檢測豬細小病毒的lamp引物組、試劑盒及檢測方法
【專利摘要】一種用于檢測豬細小病毒的LAMP引物組、試劑盒及檢測方法，該LAMP引物組序列分別為引物F3：5’?ACGGAGGTAAAATTGGACA?3’；引物B3：5’?TCCCTTTAGCTTTTTTTTTAGC?3’；FIP：5’?GAGATGTAGTTGGTGAGTCTGTTTTTTTTTCTTCAGAGCAAAGCGTG?3’；引物BIP：5’?CAACCAGAGGTAAGAAGATCGCTTTTAAAAATATGTCTTGGAGCAGGT?3’。本發(fā)明還提供了含有上述引物組的檢測試劑盒及檢測方法，通過向LAMP反應產(chǎn)物中加入熒光染料后的顏色變化來判斷被測樣品是否含有PPV，實現(xiàn)了可視化，反應結(jié)果易判定，非常易于臨床推廣。
【專利說明】
-種用于檢測豬細小病毒的LAMP引物組、試劑盒及檢測方法
技術(shù)領域
[0001] 本發(fā)明屬于獸用生物制品領域，具體設及一種用于檢測豬細小病毒的LAMP引物 組、試劑盒及檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 豬細小病毒(Porcine Parvoviru，PPV)，它是屬于細小病毒科的細小病毒屬。豬細 小病毒會引起豬的一種繁殖障礙性疾病，受到該病感染的母豬，特別是受到該病感染的初 產(chǎn)母豬會出現(xiàn)產(chǎn)死胎、崎形胎、木乃伊胎及病弱仔豬、偶有流產(chǎn)的特征，而母豬本身并無明 顯癥狀。
[0003] 豬細小病毒病在世界各地分布廣泛并且在大多數(shù)豬場流行，豬細小病毒可W通過 多種途徑對豬感染，比如水源、食物、交配和胎盤等。豬細小病毒對熱、消毒藥和酸堿的抵抗 力均很強，pH適應范圍很廣。病毒對外界環(huán)境的抵抗力也很大，能在被污染的豬舍內(nèi)生存數(shù) 月之久，容易造成長期連續(xù)傳播。當被污染的圈舍按照常規(guī)消毒方法處理后，再放入易感染 豬時，仍有被病毒感染的可能。由于該病難W防治，給養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大損失和危害，因此，建 立一種快速、特異、靈敏并且適合在基層推廣的檢測方法就非常必要，將運種檢測方法研制 成試劑盒進行推廣使用更具有很強的實用價值。
[0004] 國內(nèi)外豬細小病毒現(xiàn)有常用診斷技術(shù)主要包括：臨床診斷、病原診斷、血清學診 斷、分子生物學診斷等。臨床診斷主要依據(jù)流行病學、臨床癥狀和尸體剖檢來判斷疾病種 類，難W做到確診。病原分離是最經(jīng)典和可靠的病原診斷方法，特異性高，可直接確診，但病 毒分離所需時間較長，成本較高。
[0005] 血清學診斷技術(shù)主要包括:血清中和試驗(Neu化alization test,NT)、凝集性試 驗(Agglutination test,AT)、巧光抗體技術(shù)(Fluorescent-labelled abt;Lbody technic, FA)、酶聯(lián)免疫吸附試驗化LISA)、斑點金免疫滲濾法、膠體金免疫層析法(Colloidal gold immimochromatogra地y assay ,CGICA)等。應用最多的血清學方法主要是E：LISA，該方法具 有靈敏、特異性強、快速、簡便等特點，常被用于大規(guī)模的血清學檢查，且目前己經(jīng)建立了檢 測PPV的化ISA方法。但由于PPV已經(jīng)在豬場廣泛存在，所W，ELISA的檢測結(jié)果不能作為判定 豬群發(fā)生豬細小病毒相關疾病的決定性依據(jù)。
[0006] 分子生物學診斷技術(shù)包括聚合酶鏈式反應(Polymerase chain reaction,PCR)、 反牽專錄-聚合酉每鏈式反應（Reverse transcription polymerase chain reaction,RT- PCR)、實時巧光定量PCR(Real-time fluorescence 如anti化tive PCR，F(xiàn)Q-PCR)、實時巧光 定量RT-PCR(Rea]_-time fluorescence Quanti1:ative RT-PCR,RQ-RT-PCR)、環(huán)介導等溫擴 增化oop-mediated isothermal amplification,LAMP)技術(shù)、依賴于核酸序列擴增 (Nucleic acid sequence-based amplification,NASBA)技術(shù)、核酸探針技術(shù)、基因忍片檢 測技術(shù)等。核酸探針技術(shù)特異性強，準確可靠，可用于不同毒株的分離和鑒定，但診斷費用 較高?；蛉唐╟DNA忍片、寡核巧酸忍片、基因組忍片等，主要目標是用于DNA序列的測 定、基因表達譜鑒定、基因突變體的檢測分析，W及基因組的功能研究等。它們都是比較理 想的檢測方法，但是也存在耗時費力、設備要求特殊等局限性。LAMP是2000年開發(fā)的一種新 穎的恒溫核酸擴增方法，具有簡單、快速、特異性強的特點。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的在于提供一種用于檢測豬細小病毒(PPV)的LAMP引物組、試劑盒及 檢測方法，利用LAMP技術(shù)，實現(xiàn)豬細小病毒的可視化、快速檢測。
[000引為達到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是：
[0009] -種用于檢測豬細小病毒的LAMP引物組，其包括如下引物： 引物 F3: 5'-ACGGAGGTAAAATTGGACA-3'; 引物 B3; 5 '-TCCCTTTAGCTTTTTTTTTAGC-3 '; . 5 '-GAG ATGTAGTTGGTG AGTCTGTTTTTTTT
[0010] 引物的P:; TCTTCAGAGCA AAGCGTG-3 ' ； L 5 '-CA ACC AGAGGTA AGA AGATCGCTTTT A A 引物班P:; AAATATGTCTTGGAGCAGGT-3 '。
[0011]本發(fā)明所述用于檢測豬細小病毒的LAMP引物組在制備豬細小病毒的LAMP檢測試 劑盒中的應用。
[001^ 本發(fā)明所述包含上述LAM巧I物組的豬細小病毒的LAMP檢現(xiàn)聯(lián)劑盒。
[OOU] 本發(fā)明所述LAMP檢測試劑盒還包括LAMP反應體系：該LAMP反應體系包括:MgS〇4、 dNTP、buf f er緩沖液、引物FIP、引物BIP、引物F3、引物B3、甜菜堿、模板、Bst酶。
[0014] 優(yōu)選的，所述25化LAMP反應體系中各成分的用量為：MgS〇4:2〇-30nmol，dNTP: 0. 5-1. Onmol，10 Xbuffer，引物FIP: 5-40pmol，引物BIP: 5-40pmol，引物F3:2.5-40pmol，引 物 B3:2.5-40pmo 1，甜菜堿：15-25μπιο 1，Bs t酶：6.4-9.6U。
[001引更優(yōu)選的，所述25化LAMP反應體系中各成分的用量為：MgS04:20nmol，dNTP: 1. Onmol，10 X buffer，F(xiàn)IP: 5pmol，BIP: 5pmol，F(xiàn)3:20pmol，B3:20pmol，甜菜堿：25皿01，Bst 酶：9.抓。
[0016]本發(fā)明所述LAMP檢測試劑盒還包括:顯色劑、陽性對照、無模板對照。
[0017]優(yōu)選的，所述顯色劑為SY服Green I染料;所述陽性對照為PPV質(zhì)粒。
[0018]本發(fā)明所述LAMP檢測試劑盒的檢測反應程序為：首先59-65Γ恒溫30-60min，再 80-85 °C 恒溫 3-5min。
[0019]優(yōu)選的，所述lamp檢測試劑盒的檢測反應程序為：首先59°C恒溫45min，再80°C恒 溫3min。
[0020] -種檢測豬細小病毒的LAMP檢測方法，其包括如下步驟：
[0021] 1)提取豬細小病毒DNA作為反應模板；
[0022] 2)配制LAMP檢測體系
[0023] LAMP檢測體系包含如下成分，按總體積25化配制：1旨504:20-30醒〇1，(1卿？:0.5- 1. Onmol，10 X buff er，引物FIP: 5-40pmol，引物BIP: 5-40pmol，引物F3: 2.5-40pmol，引物 B3:2.5-40pmol，甜菜堿：15-25皿〇1，Bst酶:6.4-9.6U;還包括步驟1)提取的DNA模板；
[0024] 3) LAMP 反應
[00巧]LAMP反應程序為：首先59-65Γ恒溫30-60min，再80-85Γ恒溫3-5min;
[0026] 4)步驟3)LAMP反應結(jié)束后，向反應物中加入SYBR Green I染料，觀察顏色變化:顯 色為綠色的樣品為陽性，含有豬細小病毒;顯色為橘紅色的樣品為陰性，不含豬細小病毒。
[0027] 優(yōu)選的，所述LAMP檢測體系中各成分的用量為:MgS〇4:20nmol，dNTP: 1 .Onmol，10 Xbuffe;r，F(xiàn)IP:5pmol，BIP:5pmol，F(xiàn)3:20pmol，B3:20pmol，甜菜堿：25皿〇1，Bst酶：9.6U。
[002引優(yōu)選的，所述LAMP反應程序為:首先59°C恒溫45min，再80°C恒溫3min。
[0029] 本發(fā)明利用LAMP技術(shù)建立針對豬細小病毒的檢測方法，該方法具有多引物同時擴 增，并在兩端形成了帶有引物功能的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，運種多引物結(jié)合和可自產(chǎn)生引物的原理使 其具有了靈敏度高、特異性強等特點，由于lamp反應操作步驟簡單及反應產(chǎn)物中包含大量 核酸和焦憐酸儀的沉淀，巧光劑顯色后可W用肉眼觀察判定反應結(jié)果，適用于各種實驗條 件下檢測工作的使用。
[0030] 本發(fā)明根據(jù)LAMP的工作原理，WPPV的VP1基因為目標基因，在優(yōu)化相關反應條件 的基礎上，建立了適用于臨床應用的用于檢測豬細小病的LAMP方法，并將該方法研制成診 斷試劑盒進行推廣應用，為豬細小病毒的防控提供必要的技術(shù)。
[0031] 本發(fā)明的有益效果：
[0032] 本發(fā)明根據(jù)豬細小病毒的VP1基因序列，設計合成4個引物，通過對LAMP條件的優(yōu) 化，W及敏感性、特異性試驗，建立豬細小病毒的LAMP檢測方法，通過向LAMP反應產(chǎn)物中加 入巧光染料后的顏色變化來判斷被測樣品是否含有PPV，為豬細小病毒的現(xiàn)場快速診斷提 供了一種簡便快速的方法，該方法具有反應條件簡單、結(jié)果讀判方便、敏感性高、特異性強、 快速等優(yōu)點。
[0033] 本發(fā)明的優(yōu)勢還在于已經(jīng)將運種LAMP檢測方法研制成試劑盒，并進行推廣應用。 該試劑盒特異性強，靈敏度高，檢測限為1〇1拷貝。
[0034] 本發(fā)明所提供的豬細小病毒的LAMP快速檢測試劑盒，操作簡單，且直接通過產(chǎn)物 顏色變化進行判定，實現(xiàn)了可視化，使反應結(jié)果易判定，非常易于臨床推廣。
【附圖說明】
[0035] 圖1為本發(fā)明實施例2的LAMP檢測的可視化結(jié)果。
[0036] 圖2為本發(fā)明實施例4靈敏度試驗的可視化結(jié)果。
[0037] 圖3為本發(fā)明實施例5特異性試驗的可視化結(jié)果。
【具體實施方式】
[0038] 下面結(jié)合實施例和附圖對本發(fā)明做進一步說明，但不作為對本發(fā)明的限制。
[0039 ] 實施例1檢巧UPPV的LAMP引物組設計
[0040] PPV有Ξ種結(jié)構(gòu)蛋白VPUVP2和VP3,其VP3是VP2水解后的產(chǎn)物，而VP2完全重疊于 VP1中。根據(jù)GenBank中的豬細小病毒(PPV)的VP1基因序列（如SEQ ID NO. 1所示），針對祀基 因的六個不同的區(qū)域，基于祀基因3'端的F3c、F2c和Flc區(qū)W及5'端的B1、B2和B3區(qū)共6個不 同的位點設計4種引物，具體序列如表1所示。
[0041] 表 1
[0042]
[0043] 實施例2PPV的LAMP檢測方法的建立和驗證，包括如下步驟：
[0044] 1)病毒DNA的提取
[0045] 參照EZgeneTM Blood Viral DNA/RNA Miniperp Kit(VR6511)試劑盒說明書，對 上海市農(nóng)業(yè)科學院畜牧研究所李春華老師提供的含有PPV的豬血清樣品進行DNA提取，將提 取的DNA放在4°C保存。
[0046] 2)LAMP反應體系的建立
[0047] 最終優(yōu)化的反應體系如下：
[004引 LAMP反應體系（2化L)的配置為：d地20 5.扣L，濃度25mmol/L的MgS04 0.祉L，濃度 2.5mmol/L 的 IXdNTP 4.0yL，10Xbuffer 2.扣 L，濃度 lOpmol/yL 的 FIP 0.扣 L，濃度 10口11101/化的引物81?0.化^濃度10口11101/化的引物尸3 2.化^濃度10口11101/化的引物83 2. OyL，濃度如mol/化甜菜堿化L，模板化L，811/化的Bst酶1.化L。
[0049] 反應程序：59°C45min，80°C3min。
[0050] W陽性對照模板(步驟1)提取PPV DNA，即陽性質(zhì)粒）、無模板對照分別進行LAMP反 應。反應結(jié)束后，向兩個反應的LAMP產(chǎn)物里加入化L的SYBR Green I染料，觀察顏色變化，顯 色結(jié)果如圖1所示。圖1中顯示：陽性質(zhì)粒的反應產(chǎn)物顏色變?yōu)榫G色，無模板對照（圖1中陰性 質(zhì)粒組)的反應產(chǎn)物不發(fā)生顏色變化，為橘紅色。由此可見，本發(fā)明的LAMP反應結(jié)果易判定， 易于臨床推廣。
[0051] 實施例3PPV LAMP檢測試劑盒的組裝
[0052] 根據(jù)W上LAMP反應體系組裝檢測試劑盒，W方便使用。
[0053] 1)試劑盒的包裝規(guī)格為200次/盒，試劑盒組成如表2所示：
[0054] 表 2
[ο化5]
[0化6]
[0057] 2)試劑盒運輸及保存方法
[005引低溫運輸，短期使用放至4°C避光保存，長期保存請置于-20°C或-80°C冰箱避光保 存。
[0059] 實施例4PPV LAMP檢測試劑盒的使用
[0060] 1)樣品DNA的提取
[0061 ]參照EZgeneTM Blood Viral DNA/RNA Miniperp Kit(VR6511)試劑盒說明書，提 取待測豬血清樣品DNA作為模板。
[0062] 2)反應液的配置
[0063] 取表1中各成分進行配置，具體取d地2〇 5.5化，PPV預混合液12.3化，引物FIP 0.5 yL，引物BIP 0.扣L，引物F3 2.化L，引物B3 2.化L，模板化L加入反應小管中，混勻后在95°C 水浴鍋中加熱5min，放置冰上冰浴5min;然后加入1.化L Bst酶混合均勻。
[0064] 3)反應的進行
[0(?日]LAMP反應程序為:先59 Γ恒溫45min，再80 Γ恒溫3min;
[0066] 4)結(jié)果判定
[0067] LAMP反應結(jié)束后，向反應物中加入化L SYBR Green I染料，觀察顏色變化:顯色為 綠色的樣品為陽性，含有豬細小病毒;顯色為橘紅色的樣品為陰性，不含豬細小病毒。
[0068] 實施例5豬細小病毒LAMP檢測試劑盒的靈敏度試驗
[0069] 首先將實施例2步驟1)中所得病毒DNA通過轉(zhuǎn)化將目的片段連接至T3Cloning Vector(T3克隆載體)上，參照博滿生物柱離屯、式質(zhì)粒小量快速抽提試劑盒說明書制備質(zhì) 粒，并測其濃度，按照病毒學方法計算對應的拷貝數(shù)，-20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0070] 將提取到的質(zhì)PPV粒制備9個樣品：1:無模板對照，2:PPV質(zhì)粒10叫考貝，3:PPV質(zhì)粒 1〇1拷貝，4: PPV質(zhì)粒1〇2拷貝，5: PPV質(zhì)粒1〇3拷貝，6: PPV質(zhì)粒1〇4拷貝，7: PPV質(zhì)粒1〇5拷貝，8: PPV質(zhì)粒ΙΟ6拷貝，9:PPV質(zhì)粒ΙΟ7拷貝。使用實施例3組裝的檢測試劑盒并參照實施例4的使用 方法對上述9個樣品進行3次重復性LAMP檢測試驗，具體結(jié)果參見圖2,圖2中豎向為同一樣 品重復3次的顯示結(jié)果，橫向為不同樣品的顯示結(jié)果。
[0071] 由圖2可知，樣品1-2均為橘紅色，樣品3-9 (1〇1拷貝-107拷貝）均呈明顯綠色，且隨 著模板濃度的升高，綠色越來越深，最低DNA濃度為PPV質(zhì)粒1〇1拷貝。
[0072] W上證明本發(fā)明所提供PPV的LAMP檢測方法和試劑盒針對PPV模板的擴增具有很 高的效率，即建立的PPV的LAMP檢測下限為10墻貝，符合日常檢測要求。
[0073] 實施例6豬細小病毒LAMP檢測試劑盒的特異性試驗
[0074] 特異性實驗測試材料設置7個樣品分別為：1:無模板對照，02:PCV2病毒(豬圓環(huán)病 毒)樣品，3:PRRSV病毒(豬藍耳病病毒)樣品，4:PRV病毒(豬偽狂犬病病毒)樣品，5:CSFV病 毒(豬攝病毒)樣品，6: PPV病毒樣品，7: PPV質(zhì)粒。將2-6號樣品DNA提取方法同實施例4步驟 1)。
[0075] 用本發(fā)明的豬細小病毒LAMP檢測試劑盒對供試的特異性實驗測試7種材料樣品 DNA進行LAMP檢測，共Ξ次重復試驗，具體結(jié)果參見圖3,圖3中豎向為同一樣品重復3次的顯 示結(jié)果，橫向為不同樣品的顯示結(jié)果。
[0076] 由圖3可知，本發(fā)明提供的PPV引物組(FIP、BIP、F3和B3)在非PPV病毒樣品（樣品1- 5)中顏色反應均為橘紅色，而在所有供試PPV病毒樣品（樣品6-7)中顏色反應均為綠色，說 明本發(fā)明設計的PPV引物組特異于PPV病毒樣品檢測，本發(fā)明提供的LAMP檢測方法和試劑盒 對PPV病毒具有良好的特異性。
[0077] 實施例6PPV LAMP檢測試劑盒的臨床應用試驗
[0078] 使用本發(fā)明提供的LAMP檢測試劑盒檢測1100個血清樣品是否感染PPV。結(jié)果檢出 其中有320個臨床樣品感染ΡΡν,ΡΡν感染率29%。
【主權(quán)項】
1. 一種用于檢測豬細小病毒的LAMP引物組，其包括如下引物： 引物 F3: 5，-ACGGAGGTAAAATTGGACA-3，； 引物 B3: 5^tccctttagctttttttttagc-S'； L Si-GAGATGTAGTTGGTGAGTCTGTTTTTTTTTCTT 引物FIP. CAGAGCA AAGCGTG-3，； …k 5，-CAACCAGAGGTAAGAAGATCGCTTTTAAAAA 引物BIP: TATGTCTTGG AGC AGGT-3，。2. 如權(quán)利要求1所述用于檢測豬細小病毒的LAMP引物組在制備豬細小病毒的LAMP檢測 試劑盒中的應用。3. -種包含權(quán)利要求1所述的LAMP引物組的豬細小病毒的LAMP檢測試劑盒。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的LAMP檢測試劑盒，其特征在于，所述LAMP檢測試劑盒包含LAMP 反應體系，該LAMP反應體系包括:MgS〇4、dNTP、buffer^^FIP^^BIPd^F3d^B3、 甜菜堿、模板、Bst酶。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的LAMP檢測試劑盒，其特征在于，所述25yL LAMP反應體系中各 成分的用量為:MgS〇4:20-30nmol，dNTP: O · 5-1 · Onmol，10 X buffer，引物FIP: 5-40pmol，弓丨 物BIP: 5-40pmol，引物F3: 2 · 5-40pmo 1，引物B3: 2 · 5-40pmol，甜菜堿：15-25μπιοI，Bst酶： 6.4-9.6U〇6. 根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的豬細小病毒的LAMP檢測試劑盒，其特征在于，所述25yL LAMP反應體系中各成分的用量為:MgS〇4:20nmoI，dNTP: 1 · Onmol，10 X buff er，F(xiàn)IP: 5pmo 1， BIP:5pmol，F(xiàn)3:20pmol，B3:20pmol，甜菜喊：25ymol，Bst酶：9.6U。7. 根據(jù)權(quán)利要求3-6所述的豬細小病毒的LAMP檢測試劑盒，其特征在于，所述LAMP檢測 試劑盒還包括:顯色劑、陽性對照、無模板對照。8. -種檢測豬細小病毒的LAMP檢測方法，其包括如下步驟： 1) 提取待測樣品DNA作為模板； 2) 配制LAMP檢測體系 LAMP檢測體系包含如下成分，按總體積25yL配制：]\^3〇4:2〇-3〇11111〇1，(1町？：0.5-1 · Onmol，10 X buffer，引物FIP: 5-40pmol，引物BIP: 5-40pmol，引物F3: 2 · 5-40pmol，引物 B3:2.5-40pmol，甜菜堿：15-25μπιο1，Bst酶:6.4-9.6U;還包括步驟1)提取的DNA模板;其中， 引物FIP、引物BIP、引物F3、引物Β3的序列如權(quán)利要求1所述； 3. LAMP反應 LAMP反應程序為:首先59-60 °C恒溫30-60min，再80-85 °C恒溫3-5min; 4) 步驟3)LAMP反應結(jié)束后，向反應物中加入SYBR Green I染料，觀察顏色變化:顯色為 綠色的樣品為陽性，含有豬細小病毒;顯色為橘紅色的樣品為陰性，不含豬細小病毒。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的豬細小病毒的LAMP檢測方法，其特征在于，所述LAMP檢測體系 中各成分的用量為：MgS〇4:20nmoI，dNTP: 1 · OnmoI，10 X buf f er，F(xiàn)IP: 5pmoI，BIP: 5pmoI，F(xiàn)3: 20pmol，B3:20pmol，甜菜喊：25ymol，Bst酶：9.6U。10. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的豬細小病毒的LAMP檢測方法，其特征在于，所述LAMP反應程 序為：首先59 °C恒溫45min，再80 °C恒溫3min。
【文檔編號】C12N15/11GK106011314SQ201610613054
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年7月29日
【發(fā)明人】趙凱, 倪建平, 李春華, 趙笑, 胡瑞麗, 杜亞楠, 趙慶, 趙斌安, 史斌, 趙桓震, 潘磊, 范小瑞, 趙本進, 蔣風英, 張春玲
【申請人】上海佳牧生物制品有限公司, 上海市農(nóng)業(yè)科學院