一種基于沸石吸附的抗阿爾茲海默癥藥物的篩選方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種基于沸石吸附的抗阿爾茲海默癥藥物的篩選方法，該方法基于沸石的親和選擇?液質(zhì)譜篩選，通過將乙酰膽堿酯酶吸附到沸石上，對藥用植物提取物中的乙酰膽堿酯酶抑制劑進行篩選。本發(fā)明對影響吸附的因素，如:沸石類型、溶液pH值、吸附時間、吸附溫度等因素進行了系統(tǒng)優(yōu)化，并且還對篩選藥物的影響因素，如：孵育液pH、孵育液離子強度、孵育液溫度、孵育時間等因素進行了系統(tǒng)優(yōu)化，建立了能高效、正確、靈敏、重復(fù)性高的篩選抗阿爾茲海默癥成分的方法，具有重要的應(yīng)用價值。
【專利說明】
一種基于沸石吸附的抗阿爾茲海默癥藥物的篩選方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一種藥物的篩選方法，具體涉及一種篩選效率高、基于沸石吸附的抗 阿爾茲海默癥藥物的篩選方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 目前，基于親和選擇-質(zhì)譜的方法在藥用植物活性成分篩選中的應(yīng)用越來越多，該 法通過靶標(biāo)親和選擇，發(fā)現(xiàn)混合物中的靶標(biāo)結(jié)合物，然后對結(jié)合物進行鑒定，可以大大加快 篩選的過程。這些方法包括親和超濾法、磁珠法、渦流色譜法、親和細胞膜色譜法等。根據(jù)選 用靶點存在的狀態(tài)，可以將這些方法分為兩類:溶液化酶和固定化酶。固定化酶的方法可以 模擬膜粘連的酶或蛋白真實存在的環(huán)境，并且可以快速與篩選對象進行分離(如磁珠法）， 但是，并不是所有酶都適合進行固定，有些酶固定之后可能會失去活性。溶液化酶方法需要 離心機或栗來施加壓力，使溶液通過分離膜。有些化合物可能會吸附分離膜上，從而導(dǎo)致假 陽性的結(jié)果。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 發(fā)明目的:本發(fā)明的目的在于提供一種基于沸石吸附的抗阿爾茲海默癥藥物的篩 選方法，該方法通過將乙酰膽堿酯酶吸附到沸石上，然后和待篩選的藥物共孵育，先用PBS 緩沖液清洗，再用變性清洗液進行變性洗脫，最后對變性洗脫物進行液質(zhì)分析、鑒定。篩選 出具有抗阿爾茲海默癥的藥物。本發(fā)明提供的方法，篩選效率高，篩選準(zhǔn)確度高，靈敏度高， 對于新的抗阿爾茲海默癥藥物的篩選具有重要應(yīng)用價值。
[0004] 技術(shù)方案，為實現(xiàn)以上目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案為：
[0005] -種基于沸石吸附的抗阿爾茲海默癥藥物的篩選方法，包括以下步驟：
[0006] (1)將沸石和靶標(biāo)蛋白一起混合、孵育，應(yīng)用物理吸附技術(shù)在沸石表面上吸附靶標(biāo) 蛋白得到吸附靶標(biāo)蛋白的沸石，然后將未吸附的靶標(biāo)蛋白分離，得到吸附靶標(biāo)蛋白的沸石；
[0007] (2)將步驟（1)得到的吸附靶標(biāo)蛋白的沸石和待篩選的藥物混合、孵育；孵育結(jié)束 后先用PBS緩沖液清洗，再用變性清洗液進行變性洗脫；
[0008] (3)對步驟(2)的變性洗脫物進行液質(zhì)分析，獲取靶標(biāo)結(jié)合物的相關(guān)信息，篩選出 具有抗阿爾茲海默癥作用的藥物。
[0009] 作為優(yōu)選方案，以上所述的基于沸石吸附的抗阿爾茲海默癥藥物的篩選方法，步 驟(1)沸石和靶標(biāo)蛋白孵育條件為:pH值為8.0，孵育溫度為25°C，孵育時間為20min。
[0010] 作為優(yōu)選方案，以上所述的基于沸石吸附的抗阿爾茲海默癥藥物的篩選方法，步 驟(2)所述的變性清洗液為乙腈水溶液或甲醇水溶液。
[0011] 作為優(yōu)選方案，以上所述的基于沸石吸附的抗阿爾茲海默癥藥物的篩選方法，步 驟(2)孵育結(jié)束后先用PBS緩沖液清洗4次，變性清洗液為體積濃度50 %的甲醇水溶液。
[0012] 作為優(yōu)選方案，以上所述的基于沸石吸附的抗阿爾茲海默癥藥物的篩選方法，步 驟(2)將吸附靶標(biāo)蛋白的沸石和待篩選的藥物在37°C下孵育20min。
[0013] 作為優(yōu)選方案，以上所述的基于沸石吸附的抗阿爾茲海默癥藥物的篩選方法，步 驟(2)將吸附靶標(biāo)蛋白的沸石和待篩選的藥物，混合，加入PBS緩沖液，使溶液的pH值在7.4 時進行孵育。
[0014] 作為優(yōu)選方案，以上所述的基于沸石吸附的抗阿爾茲海默癥藥物的篩選方法，步 驟(2)將吸附靶標(biāo)蛋白的沸石和待篩選的藥物，混合，加入PBS緩沖液，使溶液的的離子強度 為1〇11^，？!1值在7.4時進行孵育。
[0015] 作為優(yōu)選方案，以上所述的基于沸石吸附的抗阿爾茲海默癥藥物的篩選方法，其 特征在于，所述的沸石為β型沸石。
[0016] -種基于沸石吸附的抗阿爾茲海默癥藥物的篩選方法，其特征在于，包括以下步 驟：
[0017] (1)稱取延胡索粉末，加入水中，回流提取，得提取液，過濾，得濾液，離心，吸取上 清液，得延胡索提取液，備用；
[0018] (2)將乙酰膽堿酯酶溶解在PBS緩沖液中，加入沸石，加入PBS緩沖液，攪拌，調(diào)節(jié)溶 液的pH值為8.0，在25°C條件下孵育20min，應(yīng)用物理吸附技術(shù)在沸石表面上吸附乙酰膽堿 酯酶得到吸附乙酰膽堿酯酶的沸石，然后將未吸附的乙酰膽堿酯酶溶液吸除，得到吸附乙 酰膽堿酯酶的沸石；
[0019] (3)將步驟(1)提取得到的延胡索提取液和步驟(2)得到的吸附乙酰膽堿酯酶的沸 石混合，加入PBS緩沖液，使離子強度為10mM，pH值為7.4，37°C孵育20分鐘，離心吸出孵育 液，加入PBS緩沖液清洗沸石四次，最后加入體積濃度為50%甲醇水溶液洗脫沸石，吸取 50 %甲醇水溶液洗脫液，進行液質(zhì)分析。
[0020] 作為優(yōu)選方案，以上所述的基于沸石吸附的抗阿爾茲海默癥藥物的篩選方法，其 特征在于，液質(zhì)分析條件為:4 · 6mm X 150mm，5μηι的Kromas i 1 C18柱，流動相:A相為用甲酸調(diào) 制pH3.5的10mM醋酸銨溶液，B相為乙腈;梯度洗脫:Omin，5%B; 5min，15; lOmin，20%B; 20min，25 % B; 30min，100 % B; 35min，100 % B，流速0 · 6mL · min - 1，柱溫30 °C，進樣體積5yL; [0021 ]液質(zhì)分析參數(shù)：正離子模式，毛細管溫度325 °C，離子源電壓+4.5kV，噴霧氣壓 379.21kPa，去簇電壓+60V，加熱氣壓379.21kPa，離子源溫度550°C，一級質(zhì)譜掃描范圍m/z 100-1500,二級質(zhì)譜激活類型CID。
[0022]有益效果:本發(fā)明提供的基于沸石吸附的抗阿爾茲海默癥藥物的篩選方法具有以 下優(yōu)點：
[0023]本發(fā)明提供的基于沸石吸附的抗阿爾茲海默癥藥物的篩選方法工藝設(shè)計合理，通 過大量實驗篩選出最佳的孵育溫度、孵育時間、孵育時溶液的pH和離子強度和變性清洗液。 [0024]本發(fā)明可應(yīng)用于篩選和評價天然產(chǎn)物以及化學(xué)合成藥物中阿爾茲海默癥治療作 用物質(zhì)。與傳統(tǒng)紫外篩選方法相比，可顯著提高篩選效率、縮短篩選時間，并且能夠發(fā)現(xiàn)化 合物之間的協(xié)同效應(yīng)。同時，本發(fā)明的篩選方法具有快速、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好、靈敏度高等特 征。
【附圖說明】
[0025]圖1為不同類型沸石在不同的孵育時間、pH值及溫度下對乙酰膽堿酯酶吸附影響 的曲線圖。
[0026] 圖2為不同清洗次數(shù)對沸石上吸附的化合物的清洗情況的柱狀圖。
[0027] 圖3為不同變性洗脫液對吸附在沸石上的乙酰膽堿酯酶清洗情況的柱狀圖。
[0028] 圖4為在不同的pH值、孵育時間、離子強度和溫度下乙酰膽堿酯酶對黃連堿溶液吸 附情況的柱狀圖。
【具體實施方式】
[0029] 下面結(jié)合具體實施例，進一步闡明本發(fā)明，應(yīng)理解這些實施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍，在閱讀了本發(fā)明之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員對本發(fā)明的各種等價 形式的修改均落于本申請所附權(quán)利要求所限定的范圍。
[0030] 以下實施例所用試劑：
[0031] 乙酰膽堿酯酶(sigma，EC3.1.1.7)，乙酰硫代膽堿（sigma)，黃連堿、四氫非洲防 己堿、原阿片堿、別隱品堿、延胡索乙素、黃連堿、紫堇堿、小檗堿、脫氫紫堇堿、非洲防己堿、 四氫黃連堿、紫堇靈、去氫海罌粟堿、四氫小檗堿(成都瑞芬思生物科技有限公司），鹽酸巴 馬汀(上海源葉生物科技有限公司），沸石(天津市實鉛化工有限公司），加蘭他敏(天津美侖 生物技術(shù)有限公司）。
[0032]以下實施例所用儀器:AB Sciex 5600液質(zhì)聯(lián)用儀器(AB Sciex公司）。
[0033]實施例1吸附乙酰膽堿酯酶沸石的制備方法優(yōu)選 [0034] 1、實驗方法：
[0035] 將5ml配制好的乙酰膽堿酯酶溶液(2mg/ml)，溶解在200mM pH8.0的PBS緩沖液中， 將5mg沸石放入緩沖液中，輕輕地攪拌，每隔一定時間取出20μ1孵育液，用Bradford法測定 孵育液中剩余的蛋白量。
[0036] 分別對影響吸附的3個因素進行考察:首先取不同類型的沸石(Y型，ZSM-5型，Beta 型）和一定量的乙酰膽堿酯酶溶液(5mL，2mg/mL)進行孵育，考察不同類型沸石對吸附的影 響。其次，考察不同pH值(5.8,6.2,6.8,7.2和8.0)的PBS緩沖液對吸附的影響。第三，考察不 同孵育溫度(25°C、30°C、37°C、45°C)對乙酰膽堿酯酶吸附的影響。
[0037]然后使用X光譜衍射、透射電鏡、掃描電鏡、紅外、激光粒徑儀對乙酰膽堿酯酶吸附 沸石進行性狀表征。
[0038] 2、實驗結(jié)果：
[0039] 2.1乙酰膽堿酯酶吸附的沸石的電鏡圖表明沸石表面布滿白色物質(zhì)是因為吸附 了乙酰膽堿酯酶。
[0040] 2.2乙酰膽堿酯酶吸附沸石紅外圖譜表明，沸石吸附乙酰膽堿酯酶后出現(xiàn)新的酰 胺帶（1640ΟΙΓ 1)，表明沸石成功地吸附了乙酰膽堿酯酶。
[0041] 2.3不同類型沸石、孵育時間、pH及溫度對乙酰膽堿酯酶吸附的影響，如圖1的結(jié) 果表明：吸附過程中的四個參數(shù)，分別為不同類型的沸石、吸附時間、緩沖液的pH以及吸附 溫度。最優(yōu)條件為選取β型沸石作為吸附材料，孵育時間20min，緩沖液pH為8.0，孵育溫度為 25。。。
[0042] 實施例2基于沸石吸附的抗阿爾茲海默癥藥物的篩選方法的各因素研究
[0043] 1、實驗方法
[0044] 1.1將5ml配制好的乙酰膽堿酯酶溶液(2mg/ml)，溶解在200mM pH8.0的PBS緩沖 液中，將5mg沸石放入緩沖液中，輕輕地攪拌，25°C下孵育20min，吸除溶液，用roS緩沖液沖 洗沸石，得到吸附乙酰膽堿酯酶的沸石。
[0045] 1.2在離心管中，加入20yL的黃連堿溶液（lmg/mL)，加入步驟1.1制備得到的吸附 乙酰膽堿酯酶的沸石0. 〇25mg，加入200yL的roS緩沖液，調(diào)節(jié)溶液到不同的pH值(5.7，6.2， 6.8,7.4,8.0)和不同的離子強度（10、50、100、200、500、100011^)、然后在不同的孵育溫度 (20、25、30、37、45°〇下，水浴孵育不同的時間（5、10、20、30、4011^11)，分別吸出孵育液，加入 200yL的roS緩沖液清洗沸石（1、2、3、4、5次），最后加入不同的變性洗脫溶劑（10 %、30 %、 50 %、70 %、90 %乙腈-水溶液(v/v)及10 %、30 %、50 %、70 %、90 %甲醇-水溶液)洗脫結(jié)合 化合物，吸取洗脫液進行液質(zhì)分析。
[0046] 2、實驗結(jié)果
[0047] 2.1清洗次數(shù)和變性洗脫溶劑的條件優(yōu)化考察結(jié)果
[0048] 清洗的目的在于排除沒有鍵合或非特異性的化合物產(chǎn)生的干擾，對不同的清洗次 數(shù)進行考察，結(jié)果表明，如圖2所示，清洗四次可以足夠消除未吸附的化合物。
[0049]如圖3的所示，變性洗脫將吸附在沸石上的乙酰膽堿酯酶清洗下來，結(jié)果表明， 50% (v/v)甲醇一水洗脫溶劑洗脫效率優(yōu)于其他洗脫溶劑。
[0050] 2.2 pH值，孵育時間，離子強度和溫度的條件優(yōu)化考察結(jié)果
[00511溶液的pH值對酶活性有影響，pH值的變化可能改變電荷使它經(jīng)受不住催化從而不 能吸附到沸石材料上，乙酰膽堿酯酶的等電點是5.0,黃連堿的PKa值為10.7,乙酰膽堿酯酶 在5.7~8.0之間帶負電荷，黃連堿在5.7~8.0之間帶正電荷，靜電吸引力增加了乙酰膽堿 酯酶和黃連堿之間的反應(yīng)，如圖4中A所示，pH在7.4時，反應(yīng)程度最大。
[0052]孵育時間的長短是影響反應(yīng)的因素之一，如圖4中B所示，最佳孵育時間為20min， 孵育時間增加會不利于反應(yīng)的進行，20min孵育時間已達到飽和。
[0053] 如圖4中C所示，PBS緩沖液濃度從1 OmM增加到1 OOOmM，黃連堿抑制率下降，可能是 由于乙酰膽堿表面電荷中和了過多的PBS，導(dǎo)致黃連堿與乙酰膽堿酯酶之間的靜電作用減 少，因此，10mM的PBS濃度最適宜。
[0054] 酶是一種催化劑，減少反應(yīng)所需的活化能，提高溫度能減少活化能，但也可能使酶 變性，如圖4中D所示，37°C最為適宜。
[0055] 實施例3延胡索提取物中抗阿爾茲海默癥成分的篩選
[0056] 1、實驗方法
[0057] 1.1、稱取lg延胡索粉末，加入50ml水，回流lh，過濾，濾液13400rpm離心10min，吸 取上清液備用。
[0058] 1.2、將5ml配制好的乙酰膽堿酯酶溶液（2mg/ml)，溶解在200mM pH8.0的roS緩沖 液中，將5mg沸石放入緩沖液中，輕輕地攪拌，25°C下孵育20min，吸除溶液，用roS緩沖液沖 洗沸石，得到吸附乙酰膽堿酯酶的沸石。
[0059] 1.3、在1.5mL的離心管中，加入步驟1提取得到的20yL的延胡索提取物溶液（1 Omg/ mL)和步驟2得到的吸附乙酰膽堿酯酶的沸石，加入180yL的PBS緩沖液(使離子強度為1 OmM， pH值為7.4)，37 °C孵育20分鐘，離心吸出孵育液，加入200yLPBS緩沖液清洗沸石四次，最后 加入體積濃度為50 %甲醇-水溶液(ν/ν)200μL洗脫結(jié)合化合物，振搖10分鐘后，吸取洗脫液 進行液質(zhì)分析。另設(shè)變性乙酰膽堿酯酶吸附沸石作為對照，排除特異性結(jié)合。
[0060] 液質(zhì)分析條件:液相條件:Kromasil C18柱(4.6mmX 150mm，5ym)，流動相：用甲酸 調(diào)制pH3.5的1 OmM醋酸銨溶液(A)和純乙腈(B)，梯度洗脫(Omin，5 % B; 5min，15 % B; 1 Omin， 20%8;2011^11，25%8;3011^11，100%8;3511^11，100%8)，流速0.61111^11^11 - 1，柱溫30。(：，進樣 體積5yL。
[0061 ]液質(zhì)分析參數(shù)：正離子模式，毛細管溫度325 °C，離子源電壓+4.5kV，噴霧氣壓 379.21kPa，去簇電壓+60V，加熱氣壓379.21kPa，離子源溫度550°C，一級質(zhì)譜掃描范圍m/z 100-1500,二級質(zhì)譜激活類型CID。
[0062] 2、實驗結(jié)果
[0063] 通過在線液-質(zhì)聯(lián)用技術(shù)篩選延胡索提取物中抗阿爾茲海默癥成分，如表1所示， 發(fā)現(xiàn)14個活性成分，其中10個成分的活性為首次發(fā)現(xiàn)。和基于磁珠的篩選方法相比，該方法 不使用鍵合試劑，具有省錢、方便等優(yōu)點。
[0064] 表1延胡索提取物中化合物對乙酰膽堿酯酶活性的抑制作用
[0067]本發(fā)明基于沸石的親和選擇-質(zhì)譜篩選系統(tǒng)，通過將乙酰膽堿酯酶吸附到沸石上， 對藥用植物提取物中的乙酰膽堿酯酶抑制劑進行篩選。對影響吸附的因素，如:沸石類型、 溶液pH值、吸附時間、吸附溫度等因素進行了系統(tǒng)優(yōu)化。并且還對篩選藥物的影響因素，如： 孵育液PH、孵育液離子強度、孵育液溫度、孵育時間等因素進行了系統(tǒng)優(yōu)化，建立了能高效、 正確、靈敏、重復(fù)性高的篩選抗阿爾茲海默癥成分的方法，具有重要的應(yīng)用價值。
[0068]以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人 員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應(yīng) 視為本發(fā)明的保護范圍。
【主權(quán)項】
1. 一種基于沸石吸附的抗阿爾茲海默癥藥物的篩選方法，其特征在于，包括以下步驟： (1) 將沸石和靶標(biāo)蛋白一起混合、孵育，應(yīng)用物理吸附技術(shù)在沸石表面上吸附靶標(biāo)蛋白 得到吸附靶標(biāo)蛋白的沸石，然后將未吸附的靶標(biāo)蛋白分離，得到吸附靶標(biāo)蛋白的沸石； (2) 將步驟（1)得到的吸附靶標(biāo)蛋白的沸石和待篩選的藥物混合、孵育;孵育結(jié)束后先 用PBS緩沖液清洗，再用變性清洗液進行變性洗脫； (3) 對步驟(2)的變性洗脫物進行液質(zhì)分析，獲取靶標(biāo)結(jié)合物的相關(guān)信息，篩選出具有 抗阿爾茲海默癥作用的藥物。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于沸石吸附的抗阿爾茲海默癥藥物的篩選方法，其特征在 于，步驟(1)沸石和靶標(biāo)蛋白孵育條件為:pH值為8.0,孵育溫度為25°C，孵育時間為20min。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于沸石吸附的抗阿爾茲海默癥藥物的篩選方法，其特征在 于，步驟(2)所述的變性清洗液為乙腈水溶液或甲醇水溶液。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于沸石吸附的抗阿爾茲海默癥藥物的篩選方法，其特征在 于，步驟(2)孵育結(jié)束后先用PBS緩沖液清洗4次，變性清洗液為體積濃度50 %的甲醇水溶 液。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于沸石吸附的抗阿爾茲海默癥藥物的篩選方法，其特征在 于，步驟(2)將吸附靶標(biāo)蛋白的沸石和待篩選的藥物在37°C下孵育20min。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于沸石吸附的抗阿爾茲海默癥藥物的篩選方法，其特征在 于，步驟⑵將吸附靶標(biāo)蛋白的沸石和待篩選的藥物，混合，加入PBS緩沖液，使溶液的pH值 在7.4時進行孵育。7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的基于沸石吸附的抗阿爾茲海默癥藥物的篩選方法，其特征在 于，步驟(2)將吸附靶標(biāo)蛋白的沸石和待篩選的藥物，混合，加入PBS緩沖液，使溶液的的離 子強度為10mM，pH值在7.4時進行孵育。8. 根據(jù)權(quán)利要求1~7任一項所述的基于沸石吸附的抗阿爾茲海默癥藥物的篩選方法， 其特征在于，所述的沸石為β型沸石。9. 一種基于沸石吸附的抗阿爾茲海默癥藥物的篩選方法，其特征在于，包括以下步驟： (1) 稱取延胡索粉末，加入水中，回流提取，得提取液，過濾，得濾液，離心，吸取上清液， 得延胡索提取液，備用； (2) 將乙酰膽堿酯酶溶解在PBS緩沖液中，加入沸石，加入PBS緩沖液，攪拌，調(diào)節(jié)溶液的 pH值為8.0,在25 °C條件下孵育20min，應(yīng)用物理吸附技術(shù)在沸石表面上吸附乙酰膽堿酯酶 得到吸附乙酰膽堿酯酶的沸石，然后將未吸附的乙酰膽堿酯酶溶液吸除，得到吸附乙酰膽 堿酯酶的沸石； (3) 將步驟（1)提取得到的延胡索提取液和步驟(2)得到的吸附乙酰膽堿酯酶的沸石混 合，加入PBS緩沖液，使離子強度為10mM，pH值為7.4，37 °C孵育20分鐘，離心吸出孵育液，加 入PBS緩沖液清洗沸石四次，最后加入體積濃度為50 %甲醇水溶液洗脫沸石，吸取50 %甲醇 水溶液洗脫液，進行液質(zhì)分析。10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的基于沸石吸附的抗阿爾茲海默癥藥物的篩選方法，其特征在 于，液質(zhì)分析條件為：4 · 6mm X 150mm，5μηι的Kromasi 1 C18柱，流動相：A相為用甲酸調(diào)制 口!13.5的1〇11^醋酸銨溶液，8相為乙腈;梯度洗脫：〇1^11，5%8 ;51^11，15%8;1〇1^11，20%8; 20min，25 % B; 30min，100 % B; 35min，100 % B，流速0 · 6mL · min - 1，柱溫30 °C，進樣體積5yL;
【文檔編號】G01N30/02GK106018599SQ201610345506
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年5月20日
【發(fā)明人】陶益, 蔣妍慧, 李偉東, 蔡寶昌
【申請人】南京中醫(yī)藥大學(xué)