一種解木糖賴氨酸芽孢桿菌及其制備α-酮酸的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種解木糖賴氨酸芽孢桿菌及應(yīng)用該菌株轉(zhuǎn) 化L-氨基酸制備α -酮酸的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 生物體內(nèi)，α-酮酸既是糖代謝的中間體，也參與必需氨基酸的生物合成。α-酮 酸是一類雙官能團(tuán)化合物，是有機(jī)合成、藥物合成及生物合成的關(guān)鍵中間體，廣泛用于生物 醫(yī)藥、食品、化妝品、飼料等領(lǐng)域。如由4種α-酮酸鈣鹽（α-酮異己酸鈣、α-酮異戊酸 鈣、α -酮-β -甲基戊酸鈣、苯丙酮酸鈣）、1種羥基酸鈣鹽（消旋羥蛋氨酸鈣）、5種L-氨 基酸（L-賴氨酸醋酸鹽、L-蘇氨酸、L-色氨酸、L-組氨酸、L-酪氨酸）組成的復(fù)方α -酮 酸片（開(kāi)同）用于預(yù)防和治療因慢性腎功能不全而造成蛋白質(zhì)代謝失調(diào)引起的損害。丙酮 酸鈣作為膳食補(bǔ)充劑，具有加速脂肪消耗、減輕體重、增強(qiáng)人體耐力等功效，對(duì)心臟也有特 殊的保護(hù)作用。L-精氨酸-α -酮戊二酸鹽（AKG)作為功能性護(hù)肝藥物和營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑，能維 持肝臟的正常功能，促進(jìn)肌肉的快速增長(zhǎng)和恢復(fù)。α-酮異己酸（KIC)是支鏈氨基酸的中間 代謝產(chǎn)物，能夠抑制胰高血糖素分泌并促進(jìn)胰島素分泌，具有促進(jìn)肌肉蛋白合成、防止肌肉 分解的雙重作用。α-丁酮酸、α-酮異戊酸等是食品風(fēng)味物質(zhì)。在功能性護(hù)膚化妝品中， α -酮酸能起到很好的保濕、防皺、防縮、抗老化和抗過(guò)敏作用。
[0003] α -酮酸的制備方法主要有化學(xué)合成法和生物技術(shù)法?；瘜W(xué)合成法主要包括雙羰 基化法及海因法。雙羰基化法以鹵代烴和一氧化碳為原料，八羰基二鈷和零價(jià)鈀的絡(luò)合物 為催化劑，在氫氧化鈣存在下，一步合成α-酮酸。該法操作簡(jiǎn)便，產(chǎn)物易分離，產(chǎn)品收率和 純度高，缺點(diǎn)是使用昂貴的催化劑，不適合規(guī)?；a(chǎn)。海因法以醛、酮和海因?yàn)樵系玫?亞烴基海因，然后水解為α-酮酸，缺點(diǎn)是海因價(jià)格昂貴?；瘜W(xué)法合成α-酮酸普遍存在原 料復(fù)雜、成本高、環(huán)境污染大，雜質(zhì)多等缺點(diǎn)，很難被生物醫(yī)藥、食品、化妝品等工業(yè)所接受。
[0004] 生物技術(shù)法包括發(fā)酵法和生物轉(zhuǎn)化法。發(fā)酵法以糖質(zhì)原料如葡萄糖或其它碳源 為發(fā)酵前體，利用中心代謝途徑加強(qiáng)α -酮酸合成途徑的通量，阻斷其他分支代謝以及 α-酮酸向氨基酸代謝的酶途徑，保證α -酮酸的大量累積。發(fā)酵法制備丙酮酸已經(jīng)實(shí)現(xiàn) 工業(yè)化。利用谷氨酸棒桿菌發(fā)酵制備α-酮戊二酸，目前達(dá)到的最高產(chǎn)量為47. 2g/L，發(fā) 酵時(shí)間32h(CN102391977A)。同樣，利用谷氨酸棒桿菌發(fā)酵制備α-酮異戊酸，產(chǎn)量達(dá)到 25.7g/L(Krause F S,Blombach BM, Eikmanns B.App Environ Microbiol, 2010, 76(24)： 8053-8061.)。發(fā)酵法制備a -酮酸具有條件溫和、工藝簡(jiǎn)單、環(huán)境友好等特點(diǎn)，但也存在生 產(chǎn)周期長(zhǎng)，產(chǎn)量低，雜酸多，提取和精制工藝復(fù)雜等缺點(diǎn)。
[0005] 生物轉(zhuǎn)化法以L-氨基酸脫氨酶或L-氨基酸氧化酶為生物催化劑，發(fā)酵生產(chǎn)的廉 價(jià)的天然L-氨基酸為原料制備a -酮酸。L-氨基酸脫氨酶法主要集中于a -酮戊二酸的 制備。劉龍等（Liu L，Hossain GS, Shin HD et al.J Biotechnol, 2013, 164:97-104.)利 用奇異變形桿菌（Proteus vulgaris) L-氨基酸脫氨酶催化L-谷氨酸脫氨生成α-酮戊二 酸，產(chǎn)量為12.6g/L。陳堅(jiān)等（CN 103911400A)通過(guò)易錯(cuò)PCR或定點(diǎn)飽和突變改造奇異變形 桿菌L-氨基酸脫氨酶基因并表達(dá)在枯草芽孢桿菌中，以重組菌全細(xì)胞轉(zhuǎn)化L-谷氨酸制備 α -酮戊二酸，轉(zhuǎn)化率為85. 2%。敲除sucA后的表達(dá)L-氨基酸脫氨酶重組枯草芽孢桿菌 轉(zhuǎn)化L-谷氨酸鈉，其α -酮戊二酸的產(chǎn)量可達(dá)12. 2g/L，而以未敲除sucA的重組枯草芽孢 桿菌為生物催化劑，其α-酮戊二酸的產(chǎn)量為8. 6g/L(CN 103937842A)。中國(guó)專利申請(qǐng)（CN 103789247A)公開(kāi)了異源表達(dá)L-氨基酸脫氨酶的重組菌細(xì)胞轉(zhuǎn)化L-亮氨酸制備α-酮異 己酸的方法，L-亮氨酸轉(zhuǎn)化率為97.5%，α-酮異己酸產(chǎn)量為12. 7g/L。盡管L-氨基酸脫 氨酶能夠特異地催化L-氨基酸脫氨，無(wú)過(guò)氧化氫生成，避免了過(guò)氧化氫催化α -酮酸進(jìn)一 步脫羧，但高濃度L-氨基酸和產(chǎn)物α -酮酸對(duì)L-氨基酸脫氨酶有顯著的抑制作用，α -酮 酸的生產(chǎn)強(qiáng)度不高，很難實(shí)現(xiàn)工業(yè)化。
[0006] L-氨基酸氧化酶立體特異地催化L-氨基酸氧化脫氨形成α -酮酸并伴隨過(guò)氧化 氫產(chǎn)生。L-氨基酸氧化酶/過(guò)氧化氫酶組合體系能夠有效實(shí)現(xiàn)過(guò)氧化氫的原位清除，累積 高濃度α_酬酸。夏仕文等（ZL 201210045591.5)以奠產(chǎn)喊桿菌（Alcaligenes faecalis CGMCC 1. 1799)的通透細(xì)胞轉(zhuǎn)化L-丙氨酸制備丙酮酸，產(chǎn)量為64. Og/L，收率91 %。劉立明 等（CN 102994467A)以鏈霉菌（Streptomyces ghanaensis FMME067)發(fā)酵產(chǎn)生的胞外L-谷 氨酸氧化酶轉(zhuǎn)化L-谷氨酸鈉制備α -酮戊二酸，α -酮戊二酸產(chǎn)量為14. 5g/L。以不透明 紅球菌（Rhodococcus opacus DSM43250)野生細(xì)胞轉(zhuǎn)化L-谷氨酸鈉，采用分批補(bǔ)料策略制 備α -酮戊二酸，轉(zhuǎn)化率90%，α -酮戊二酸產(chǎn)量達(dá)到16. 8g/L(CN 103352058A)。重組產(chǎn)生 的不透明紅球菌DSM43250 L-氨基酸氧化酶轉(zhuǎn)化10g/L L-谷氨酸鈉為5. 3g/L α -酮戊二 酸，轉(zhuǎn)化率53% (CN103555642A)。范文超等（CN 104131041Α)構(gòu)建了谷氨酸消旋酶基因工 程菌和D-氨基酸氧化酶基因工程菌。利用兩個(gè)基因工程菌的混合菌轉(zhuǎn)化100g/L L-谷氨 酸鈉，轉(zhuǎn)化率為達(dá)到85. 5%，α -酮戊二酸產(chǎn)量為85. 2g/L。陶榮盛等（CN 104109698 A) 利用固定化重組L-谷氨酸氧化酶/過(guò)氧化氫酶體系轉(zhuǎn)化L-谷氨酸鈉，轉(zhuǎn)化率為90. 7%， α -酮戊二酸產(chǎn)量為ll〇g/L。
[0007] L-氨基酸氧化酶法目前只局限于制備少數(shù)幾個(gè)α-酮酸丙酮酸、α-酮戊二酸 等，而且需要采用來(lái)源于不同菌株的L-氨基酸氧化酶。獲得底物特異性寬廣的適用于多個(gè) α -酮酸制備的產(chǎn)L-氨基酸氧化酶菌株，對(duì)于L-氨基酸氧化酶法生產(chǎn)α -酮酸具有重要價(jià) 值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的是公開(kāi)一株解木聚糖賴氨酸芽孢桿菌，分類并命名為解木聚糖賴 氨酸芽孢桿菌（Lysinibacillus xylanilyticus)XX_2。該菌于2015年9月10日保藏于 中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏中心地址為：中國(guó)湖北省武漢市武漢大學(xué)，保藏號(hào)為CCTCC N〇:M2015520。本發(fā)明同時(shí)提供利用該菌的全細(xì)胞轉(zhuǎn)化L-氨基酸制備α -酮酸的方法。
[0009] 本發(fā)明的解木糖賴氨酸芽孢桿菌在制備α -酮酸中的應(yīng)用。其中解木糖賴氨酸芽 孢桿菌制備α -酮酸的方法為：在產(chǎn)酶培養(yǎng)基中培養(yǎng)解木糖賴氨酸芽孢桿菌ΧΧ-2細(xì)胞，離 心收集菌體，磷酸鹽緩沖液洗滌菌體，得到濕菌體；將濕菌體懸浮在磷酸鹽緩沖液中制備菌 懸液；再向菌懸液中加入底物L(fēng)-氨基酸，經(jīng)生物轉(zhuǎn)化后獲得產(chǎn)物α -酮酸。
[0010] 本發(fā)明的解木糖賴氨酸芽孢桿菌ΧΧ-2是通過(guò)以下程序從土壤中篩選獲得的。
[0011] (1)富集：從不同地區(qū)采集的20個(gè)土樣經(jīng)自然風(fēng)干并碾碎，分別取5g碎土樣加入 到含50ml無(wú)菌水的錐形瓶中，30°C下?lián)u床振蕩（200轉(zhuǎn)/分）20min，靜置，取lml上清液梯 度稀釋，然后將50 μ 1稀釋液涂布于裝載固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿上，30°C下培養(yǎng)3天。用于富 集的固體培養(yǎng)基為：蛋白胨l〇g/L、牛肉膏3g/L、氯化鈉5g/L、瓊脂15g/L，pH7. 2。
[0012] (2)篩選：分別挑取步驟（1)中固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)出的單菌落，接種到含5ml無(wú)菌 液體培養(yǎng)基中，30 °C下?lián)u床振蕩（200轉(zhuǎn)/分）培養(yǎng)24h。取lml菌液，采用2, 4-二硝基苯 肼檢測(cè)丙酮酸。陽(yáng)性菌株接種至步驟（1)中的固體培養(yǎng)基上，30°C下培養(yǎng)1天，然后接種至 5ml無(wú)菌液體培養(yǎng)基中，30 °C下?lián)u床振蕩（200轉(zhuǎn)/分）培養(yǎng)48h獲得預(yù)培養(yǎng)液。預(yù)培養(yǎng)液 接種至50ml液體培養(yǎng)基中，30°C下?lián)u床振蕩（200轉(zhuǎn)/分）培養(yǎng)48h，離心、生理鹽水洗滌2 次，重新懸浮在生理鹽水中，以L-丙氨酸為底物，米用2, 4-二硝基苯餅法檢測(cè)L-氨基酸氧 化酶活性，對(duì)活性最高的菌株進(jìn)一步鑒定。用于篩選的液體培養(yǎng)基為：蛋白胨l〇g/L、牛肉 膏3g/L、磷酸二氫鉀2g/L、磷酸氫二鈉 lg/L、硫酸鎂0. 5g/L、氯化鈉5g/L、L-丙氨酸10g/ L，pH7. 2。通過(guò)篩選、鑒定得到本發(fā)明的解木糖賴氨酸芽孢桿菌XX-2。
[0013] 采用上述解木糖賴氨酸芽孢桿菌XX-2全細(xì)胞轉(zhuǎn)化L-氨基酸制備α -酮酸的具體 方法如下：
[0014] 1.菌株培養(yǎng)：
[0015] 斜面培養(yǎng)基為：3g/L牛肉膏、5g/L酵母膏、5g/L氯化鈉、15g/L瓊脂，ρΗ6·0。
[0016] 種子培養(yǎng)基為：3g/L牛肉膏、5g/L酵母膏、5g/L氯化鈉，ρΗ6. 0。
[0017] 產(chǎn)酶培養(yǎng)基為：3g/L牛肉膏、5g/L酵母膏、5g/L氯化鈉，3g/L L-丙氨酸，ρΗ6.0。
[0018] 斜面培養(yǎng)：將篩選得到的木糖賴氨酸芽孢桿菌XX-2接種于斜面培養(yǎng)基上，30°C培 養(yǎng)48小時(shí)；
[0019] 種子培養(yǎng)：將斜面培養(yǎng)的菌株，無(wú)菌條件下用接種環(huán)接種于5ml發(fā)酵培養(yǎng)基中， 30°C下?lián)u床振蕩（180轉(zhuǎn)/分）培養(yǎng)48小時(shí)，制得種子液；
[0020] 搖瓶培養(yǎng)：以10 %接種量將種子液接入新鮮的產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，30°C下?lián)u床振蕩 (180rpm)培養(yǎng)48小時(shí)。
[0021] 2.菌體收集：步驟（1)中搖瓶培養(yǎng)的菌液在4°C、8000轉(zhuǎn)/分條件下離心5分鐘， 收集菌體，用磷酸鈉緩沖液（100mm〇l/L，pH8. 0)洗滌2次，得到濕菌體。
[0022] 3.生物氧化實(shí)驗(yàn)：步驟（2)中的濕菌體重新懸浮于磷酸鈉緩沖液（100mm〇l/L， pH8. 0)中制成細(xì)胞濃度為20~50g/L (干重）的菌懸液，加入終濃度為26~160g/L的 L-氨基酸，在30°C下，搖床振蕩（180轉(zhuǎn)/分）反應(yīng)24~48小時(shí)。反應(yīng)液離心，分別采用 柱前手性衍生-HPLC和2, 4-二硝基苯肼法測(cè)定L-氨基酸轉(zhuǎn)化率和α -酮酸產(chǎn)率。
[0023] 柱前手性衍生-HPLC條件為：反應(yīng)上清液中加入4g/L三乙胺乙腈溶液和2g/L 2, 3, 4, 6-四-0-乙?；?β -D-吡喃葡萄糖異硫氰酸酯（GITC)乙腈溶液，30°C下水浴加熱 20min。離心，采用HPLC測(cè)定上清液中的L-氨基酸濃度，根據(jù)校正曲線計(jì)算轉(zhuǎn)化率。色譜 柱：C18柱；流動(dòng)相：0. 1 %三氟乙酸水溶液/甲醇（51:49, v/v)，pH 2. 5 ;流速：1. 0ml/min ; 檢測(cè)波長(zhǎng)：254nm ;柱溫：25°C。
[0024] 2, 4-二硝基苯肼法：反應(yīng)上清液與1. 5mol/L氫氧化鈉溶液、2, 4-二硝基苯肼溶 液按體積比1:1:5混勾，37°C下