防治十字花科根腫病解淀粉芽孢桿菌Bam22的發(fā)酵方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物農(nóng)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種防治十字花科根腫病解淀粉芽抱桿 菌Bam22的發(fā)酵方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 僅幾十年來(lái)，十字花科根腫病在全球范圍內(nèi)迅速蔓延，嚴(yán)重影響了十字花科作物 的生長(zhǎng)，造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。
[0003] 鑒于使用化學(xué)農(nóng)藥對(duì)環(huán)境有害且存在食品安全隱患，生防技術(shù)日益受到研究者和 農(nóng)業(yè)從業(yè)者的青睞。然而，由于十字花科根腫病菌不能離體培養(yǎng)的特性在一定程度上限制 了該病生防菌株的篩選，因此現(xiàn)有的對(duì)十字花科根腫病有較好防治功效的菌株只有寥寥幾 種，嚴(yán)重的限制了生防方法在十字花科根腫病防治工作的進(jìn)一步開(kāi)展。
[0004] 本發(fā)明的發(fā)明人經(jīng)過(guò)大量的實(shí)驗(yàn)摸索研究，獲得了一株對(duì)十字花科(特別是油菜） 根腫病具有高效防治功效、且施用劑量少的生防菌株，于2015年9月6日保藏于中國(guó)微生 物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中屯、，保藏號(hào)為CGMCCNo. 11329。將其更好的應(yīng)于于實(shí) 際防治工作中，需要對(duì)其發(fā)酵培養(yǎng)方法進(jìn)行摸索。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種防治十字花科根腫病解淀粉芽抱桿菌Bam22的發(fā)酵 方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟： 1) 挑取經(jīng)過(guò)在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)后的解淀粉芽抱桿菌Bam22單菌落，置于液體培養(yǎng)基 中，于30-32°C震蕩培養(yǎng)10-12小時(shí)，轉(zhuǎn)速為200-220rpm，作為種子液；所述液體培養(yǎng)基的 成分按質(zhì)量百分?jǐn)?shù)計(jì)包括：酵母提取物0. 2-0. 3%、牛肉浸膏0. 1-0. 2%、蛋白腺0. 7-0.8%、 化Cl0. 3-0.6%、余量為水，pH=7. 0-7. 2 ; 2) 將步驟1)所得物置入發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵40-50小時(shí)，罐溫為27-30°C，發(fā)酵罐攬拌 速度為220-25化pm，空氣流量0.8 :1-1:1(VAm);發(fā)酵罐中的培養(yǎng)基的成分按質(zhì)量百 分?jǐn)?shù)計(jì)包括：豆粉4-5%、蛋白腺0. 1-0. 15%、葡萄糖0. 5-0. 7%、淀粉2-3%、硫酸儘0. 1%、硫酸 亞鐵0. 06%、憐酸氨二鐘0. 2%、碳酸巧0. 1%、消泡劑0. 01%、余量為水，pH=7. 0-7. 4 ; 所述高抗十字花科根腫病解淀粉芽抱桿菌Bam22于 2015年9月6日保藏于位于北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所的 中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中屯、，保藏號(hào)為CGMCCNo. 11329。
[0006] 本發(fā)明提供的發(fā)酵方法能夠很好的對(duì)解淀粉芽抱桿菌Bam22進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，使得 該生防菌具有十分優(yōu)良的活性，易于開(kāi)展十字花科根腫病的防治工作。
[0007] 優(yōu)選的，所述方法在步驟1)之前還包括步驟：試管種的培養(yǎng)，所述試管種的培 養(yǎng)方法為：將解淀粉芽抱桿菌Bam22置于斜面培養(yǎng)基中于30°C下培養(yǎng)36小時(shí)；所述斜面 培養(yǎng)基的成分按質(zhì)量百分?jǐn)?shù)計(jì)包括：酵母提取物0. 2-0. 3%、牛肉浸膏0. 1-0. 2%、蛋白腺 0. 7-0.8%、化Cl0. 3-0.6%、瓊脂 2%，余量為水，pH=7. 0-7. 2。
[0008] 優(yōu)選的，所述步驟I)中，所述液體培養(yǎng)基的成分按質(zhì)量百分?jǐn)?shù)計(jì)為：酵母提取物 0. 25%、牛肉浸膏0. 12%、蛋白腺0. 75%、化Cl0. 5%、余量為水，pH=7. 2。
[000引優(yōu)選的，所述步驟1)中，培養(yǎng)溫度為30°C，培養(yǎng)時(shí)間為12小時(shí)。
[0010] 優(yōu)選的，所述步驟2)中，發(fā)酵罐中的培養(yǎng)基的成分按質(zhì)量百分?jǐn)?shù)計(jì)為：豆粉4. 5%、 蛋白腺0. 12%、葡萄糖0.6%、淀粉2. 5%、硫酸錠0. 1%、碳酸巧0. 1%、消泡劑0. 01%、余量為水， 抑=7. 8。
[0011] 優(yōu)選的，所述步驟2)中，罐溫為28°C，發(fā)酵時(shí)間為48小時(shí)。
[0012] 本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明的發(fā)酵方法對(duì)解淀粉芽抱桿菌Bam22的培養(yǎng)十分有 利，獲得的芽抱多，且具有良好的生物活性。
【具體實(shí)施方式】
[0013] 下面通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行具體描述，有必要在此指出的是W下實(shí)施例只是用 于對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的說(shuō)明，不能理解為對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，該領(lǐng)域的技術(shù)熟練 人員根據(jù)上述
【發(fā)明內(nèi)容】
所做出的一些非本質(zhì)的改進(jìn)和調(diào)整，仍屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0014] 下述實(shí)施例中所用的細(xì)菌于2015年9月6日保藏于位于北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1 號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所的中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中屯、，保 藏號(hào)為CGMCCNo. 11329。
[001引 實(shí)施例1 1) 挑取經(jīng)過(guò)在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)后的解淀粉芽抱桿菌Bam22單菌落，置于液體培養(yǎng) 基中，于31°C震蕩培養(yǎng)11小時(shí)，轉(zhuǎn)速為200巧m，，作為種子液；所述液體培養(yǎng)基的成分按 質(zhì)量百分?jǐn)?shù)計(jì)為：酵母提取物0. 2%、牛肉浸膏0. 1%、蛋白腺0. 7%、化Cl0. 3 %、余量為水， 抑=7. 0 ; 2) 將步驟1)所得物置入發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵40小時(shí)，罐溫為30°C，發(fā)酵罐攬拌速度為 250巧m，空氣流量0.8 : 1 (V/Vm);發(fā)酵罐中的培養(yǎng)基的成分按質(zhì)量百分?jǐn)?shù)計(jì)為：豆粉4%、 蛋白腺0. 1%、葡萄糖0. 5%、淀粉2%、硫酸儘0. 1%、硫酸亞鐵0. 06%、憐酸氨二鐘0. 2%、碳酸巧 0. 1%、消泡劑0. 01%、余量為水，pH=7. 0。
[001引實(shí)施例2 1) 挑取經(jīng)過(guò)在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)后的解淀粉芽抱桿菌Bam22單菌落，置于液體培養(yǎng) 基中，于32°C震蕩培養(yǎng)10小時(shí)，轉(zhuǎn)速為220rpm，作為種子液；所述液體培養(yǎng)基的成分按 質(zhì)量百分?jǐn)?shù)計(jì)為：酵母提取物0. 3%、牛肉浸膏0. 2%、蛋白腺0. 8%、化Cl0. 6%、余量為水， 抑=7. 0 ; 2) 將步驟1)所得物置入發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵50小時(shí)，罐溫為27°C，發(fā)酵罐攬拌速度為 220巧m，空氣流量0.9 : 1 (V/Vm);發(fā)酵罐中的培養(yǎng)基的成分按質(zhì)量百分?jǐn)?shù)計(jì)為：豆粉5%、 蛋白腺0. 15%、葡萄糖0. 7%、淀粉3%、硫酸儘0. 1%、硫酸亞鐵0. 06%、憐酸氨二鐘0. 2%、碳酸 巧0. 1%、消泡劑0. 01%、余量為水，pH=7. 4。
[0017]實(shí)施例3 1)挑取經(jīng)過(guò)在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)后的解淀粉芽抱桿菌Bam22單菌落，置于液體培養(yǎng)基 中，于30°C震蕩培養(yǎng)12小時(shí)，轉(zhuǎn)速為210rpm，作為種子液；所述液體培養(yǎng)基的成分按質(zhì)量 百分?jǐn)?shù)計(jì)為：酵母提取物0.25 %、牛肉浸膏0.12 %、蛋白腺0.75 %、化Cl0.5 %、余量為水， 抑=7.O; 2)將步驟I)所得物置入發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵48小時(shí)，罐溫為28°C，發(fā)酵罐攬拌速度為 220巧m，空氣流量1:I(VAm);發(fā)酵罐中的培養(yǎng)基的成分按質(zhì)量百分?jǐn)?shù)計(jì)為：豆粉4. 5%、 蛋白腺0. 12%、葡萄糖0. 6%、淀粉2. 5%、硫酸儘0. 1%、硫酸亞鐵0. 06%、憐酸氨二鐘0. 2%、 碳酸巧0. 1%、消泡劑0. 01%、余量為水，pH=7.3。
[001引對(duì)比實(shí)施例 除了液體培養(yǎng)基中成分為牛肉浸膏0. 3%，酵母提取物0. 1%，蛋白腺0. 5%，葡萄糖 1. 0%，余料為水，pH7. 5,培養(yǎng)溫度為28°C;W及發(fā)酵罐罐溫為25°C之外，其余與實(shí)施例1 一 致。
[0019] 經(jīng)檢測(cè)，實(shí)施例1、實(shí)施例2、實(shí)施例3所得菌液含芽抱量分別為6. 5X1〇9C化/ml、 7. 3X10?cfu/ml、8. 2X10?cfu/ml，而對(duì)比實(shí)施例所得菌液的菌濃僅為1.2Xl〇scfu/ml。
[0020] 實(shí)驗(yàn)例 實(shí)施例3所得菌液用于十字花科根腫病的防治實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)對(duì)象：油菜、白菜、青花菜。
[0021] 將所得菌液稀釋200倍、500倍、800倍、1000倍，利用灌根法，移栽時(shí)每植株誘 100mL菌液稀釋液，移栽后7天第二次灌根，移栽后15天第=次灌根。
[0022] 病情分級(jí)： 0級(jí)：根部無(wú)腫瘤，根系發(fā)育正常； 1級(jí)：1-30%的根著少許腫瘤，有小的結(jié)節(jié)狀腫塊，相互不連接； 2級(jí)：31-60%的根著生腫瘤，有大的結(jié)節(jié)狀或球狀腫塊，相互連接； 3級(jí)：61-100%的根著生腫瘤，膨大到形成紡鍵形瘤，大的瘤塊一直延伸到下胚軸，植株 矮小，停止生長(zhǎng)或死亡。
[0023] 病情指數(shù)=[(各級(jí)病株數(shù)X相對(duì)級(jí)數(shù)值）/最高級(jí)別X調(diào)查總株數(shù)]X 100。
[0024] 相對(duì)防效=(對(duì)照病情指數(shù)-處理病情指數(shù)）X 100/對(duì)照病情指數(shù)。
[0025] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1、表2和表3:

【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種防治十字花科根腫病解淀粉芽孢桿菌Bam22的發(fā)酵方法，其特征在于，所述方 法包括如下步驟： 1) 挑取經(jīng)過(guò)在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)后的解淀粉芽孢桿菌Bam22單菌落，置于液體培養(yǎng)基 中，于30-32°C震蕩培養(yǎng)10-12小時(shí)，轉(zhuǎn)速為200-220 rpm，作為種子液；所述液體培養(yǎng)基的 成分按質(zhì)量百分?jǐn)?shù)計(jì)包括：酵母提取物〇. 2-0. 3%、牛肉浸膏0. 1-0. 2%、蛋白胨0. 7-0. 8%、 NaCl 0· 3-0. 6%、余量為水，ρΗ=7· 0-7. 2 ; 2)將步驟1)所得物置入發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵40-50小時(shí)，罐溫為27-30°C，發(fā)酵罐攪拌 速度為220-250rpm，空氣流量0.8 : 1-1: 1(ν/ν·πΟ;發(fā)酵罐中的培養(yǎng)基的成分按質(zhì)量百 分?jǐn)?shù)計(jì)包括：豆粉4-5%、蛋白胨0. 1-0. 15%、葡萄糖0. 5-0. 7%、淀粉2-3%、硫酸錳0. 1%、硫酸 亞鐵0. 06%、磷酸氫二鉀0. 2%、碳酸鈣0. 1%、消泡劑0. 01%、余量為水，ρΗ=7. 0-7. 4 ; 所述解淀粉芽孢桿菌Bam22于2015年9月6日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員 會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCC No. 11329。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的發(fā)酵方法，其特征在于，所述方法在步驟1)之前還包括步驟： 試管種的培養(yǎng)，所述試管種的培養(yǎng)方法為：將解淀粉芽孢桿菌Bam22置于斜面培養(yǎng)基中于 30°C下培養(yǎng)36小時(shí)；所述斜面培養(yǎng)基的成分按質(zhì)量百分?jǐn)?shù)計(jì)包括：酵母提取物0. 2-0. 3%、 牛肉浸膏 〇· 1-0. 2%、蛋白胨0· 7-0. 8%、NaCl 0· 3-0. 6%、瓊脂2%，余量為水，ρΗ=7· 0-7. 2。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的發(fā)酵方法，其特征在于，所述步驟1)中，所述液體培養(yǎng)基的成 分按質(zhì)量百分?jǐn)?shù)計(jì)為：酵母提取物〇. 25%、牛肉浸膏0. 12%、蛋白胨0. 75%、NaCl0. 5%、余量 為水，pH=7. 2。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的發(fā)酵方法，其特征在于，所述步驟1)中，培養(yǎng)溫度為30°C，培 養(yǎng)時(shí)間為12小時(shí)。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的發(fā)酵方法，其特征在于，所述步驟2)中，發(fā)酵罐中的培養(yǎng)基的 成分按質(zhì)量百分?jǐn)?shù)計(jì)為：豆粉4. 5%、蛋白胨0. 12%、葡萄糖0. 6%、淀粉2. 5%、硫酸銨0. 1%、碳 酸鈣0. 1%、消泡劑0. 01%、余量為水，pH=7. 3。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的發(fā)酵方法，其特征在于，所述步驟2)中，罐溫為28°C，發(fā)酵時(shí) 間為48小時(shí)。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供了一種防治十字花科根腫病解淀粉芽孢桿菌Bam22的發(fā)酵方法，該方法包括：1）挑取經(jīng)過(guò)在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)后的解淀粉芽孢桿菌Bam22菌落，置于液體培養(yǎng)基中，于30-32℃震蕩培養(yǎng)10-12小時(shí)，轉(zhuǎn)速為200-220rpm，作為種子液；2）將步驟1）所得種子液接入發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵40-50小時(shí)，種子液接入量為8%-10%，罐溫為27-30℃，發(fā)酵罐攪拌速度為220-250rpm，空氣流量0.8﹕1-1﹕1（V/V?m）；所述高效十字花科根腫病芽孢桿菌Bam22于2015年9月6日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCC？No.11329。本發(fā)明的發(fā)酵方法對(duì)芽孢桿菌Bam22的培養(yǎng)十分有利，獲得的細(xì)菌數(shù)多，且細(xì)菌具有良好的活性。CGMCC No.1132920150906
【IPC分類(lèi)】A01P3/00, C12R1/07, C12N1/20
【公開(kāi)號(hào)】CN105296392
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510725765
【發(fā)明人】劉勇, 黃小琴, 張蕾, 伍文憲, 劉紅雨, 周西全
【申請(qǐng)人】四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所
【公開(kāi)日】2016年2月3日
【申請(qǐng)日】2015年11月2日