一種交聯(lián)鹵醇脫鹵酶聚集體的制備方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種交聯(lián)鹵醇脫鹵酶聚集體的制備方法，屬于生物化工領(lǐng)域。本發(fā)明在冰浴條件下，向鹵醇脫鹵粗酶液中添加了牛血清白蛋白制劑作為保護(hù)劑，以硫酸銨溶液為沉淀劑，戊二醛作為交聯(lián)劑制備交聯(lián)鹵醇脫鹵酶聚集體；其中鹵醇脫鹵粗酶液通過(guò)構(gòu)建重組菌進(jìn)行原核體外誘導(dǎo)表達(dá)制備。本發(fā)明實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)單，成本低廉，制備出的交聯(lián)鹵醇脫鹵酶聚集體具有較高的機(jī)械強(qiáng)度、較好的耐熱性并可實(shí)現(xiàn)重復(fù)利用，經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí),最優(yōu)制備條件下固定化酶量可達(dá)總酶量的80％以上，交聯(lián)鹵醇脫鹵酶聚集體酶活力為470.2U/g，與游離粗酶的酶活相比，相對(duì)酶活力可達(dá)91.36％，可廣泛應(yīng)用于有機(jī)鹵化物等環(huán)境污染物的降解及手性藥物合成過(guò)程中的催化。
【專(zhuān)利說(shuō)明】
一種交聯(lián)鹵醇脫鹵酶聚集體的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于生物化工領(lǐng)域，具體公開(kāi)了一種交聯(lián)鹵醇脫鹵酶聚集體的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著現(xiàn)代社會(huì)化工業(yè)的飛速發(fā)展，大量的工業(yè)廢物不正當(dāng)排出，以及人工合成鹵化物在化工合成和農(nóng)業(yè)上的廣泛應(yīng)用，使得有機(jī)鹵化物成為當(dāng)今重要的環(huán)境污染物之一。自然界中，有機(jī)鹵化物主要存在于土壤和地下水中，具有很強(qiáng)的穩(wěn)定性，絕大部分異生鹵化物的自然降解能力很差，可在自然界中存在百年之久。傳統(tǒng)的物理化學(xué)方法的治理效果往往較低，且容易造成二次污染，因此，應(yīng)用生物降解該類(lèi)化合物已成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。
[0003]生物降解是指利用微生物產(chǎn)生的酶對(duì)有毒污染物進(jìn)行有效降解的過(guò)程。由于生物降解的方法相對(duì)傳統(tǒng)的化學(xué)方法降解的效率增高，且引起的污染較低，已成為當(dāng)今世界新一代降解有毒污染物的方法。
[0004]齒醇脫齒酶(HheC)于1999年發(fā)現(xiàn)于放射形土壤桿菌Agrobacterium rad1bacterADl中，參與了鹵醇(ECH)，I，3_二氯-2-丙醇(I，3-DCP)等在內(nèi)的許多重要環(huán)境含鹵化合物的生物降解途徑，在污水治理方面發(fā)揮了巨大的作用。此外，鹵醇脫鹵酶的另外一個(gè)應(yīng)用是它可以催化鄰鹵醇與環(huán)氧化物之間的轉(zhuǎn)化反應(yīng)，而且可以高選擇性地催化接受鹵離子以及其它一系列非自然親核試劑所介導(dǎo)的環(huán)氧化物開(kāi)環(huán)反應(yīng)，因此它可以用來(lái)催化合成一些具有光學(xué)純的化學(xué)中間體，這些化合物中間體可以應(yīng)用到制藥和生物活性基團(tuán)的合成過(guò)程中，這使得它具有很高的應(yīng)用價(jià)值。
[0005]眾所周知，酶應(yīng)用領(lǐng)域存在的一個(gè)主要問(wèn)題是:缺少在廣泛的pH和溫度范圍內(nèi)保持穩(wěn)定，對(duì)有機(jī)溶劑具有高度耐受性的固定化酶;且固定化使用的試劑和載體成本高昂、固定效率偏低，在工業(yè)上具有應(yīng)用價(jià)值的酶在真正投入工業(yè)化應(yīng)用時(shí)受到了限制。此外，鹵醇脫鹵酶(HheC)而言存在的巨大問(wèn)題是獲取較難，僅由細(xì)菌培養(yǎng)表達(dá)純化得到的酶量很小，所以高純度的鹵醇脫鹵酶(HheC)溶液使用成本非常高。在實(shí)際應(yīng)用時(shí)常常需要在反應(yīng)之后將酶與反應(yīng)體系分離，因此，酶的可回收性需要特別關(guān)注。綜上所述，進(jìn)一步開(kāi)發(fā)更簡(jiǎn)便、更適用的固定化方法以提高鹵醇脫鹵酶(HheC)的性能以及應(yīng)用范圍是生物化工領(lǐng)域追求的目標(biāo)。
[0006]目前，尚沒(méi)有一種通用的方法適用于所有酶的固定，而且固定化酶對(duì)活性和穩(wěn)定性的改變通常都是矛盾的，也就是說(shuō)活性被提高的同時(shí)換來(lái)了較低的穩(wěn)定性，且回收重復(fù)使用幾乎是不可能的；相反穩(wěn)定性得到改善往往活性就會(huì)受到限制。試圖通過(guò)一種方法提高酶的所有性能幾乎是無(wú)法做到的，因此針對(duì)酶的固定化，探索和優(yōu)化固定化酶的載體和方法將一直受到重視，同時(shí)也應(yīng)該根據(jù)各自不同的需要有針對(duì)性地對(duì)其中的一些性質(zhì)進(jìn)行改善。
[0007]交聯(lián)酶聚集體(CLEA)是最近幾年受到研究者們的關(guān)注的一種新型的無(wú)載體固定化技術(shù)。該技術(shù)采用物理方法使酶分子聚集、再經(jīng)交聯(lián)劑交聯(lián)而成，具有操作簡(jiǎn)單、可采用多酶反應(yīng)體系、具有較高的酶活回收率和生產(chǎn)能力及較好的穩(wěn)定性等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)的分離和純化及酶固定化等方面。
[0008]因此，使用交聯(lián)酶聚集體技術(shù)對(duì)鹵醇脫鹵酶(HheC)及多酶體系進(jìn)行固定化，并在此基礎(chǔ)上優(yōu)化固定化條件以得到穩(wěn)定性好，活性保持久，回收率及回收次數(shù)高的鹵醇脫鹵酶的固定化酶體系具有現(xiàn)實(shí)意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]針對(duì)目前制備固定化鹵醇脫鹵酶(HheC)存在的不足，本發(fā)明公開(kāi)了一種運(yùn)用新型無(wú)載體固定化技術(shù)一一交聯(lián)酶聚集體(CLEAs)技術(shù)對(duì)鹵醇脫鹵酶進(jìn)行高效固定化的方法。本發(fā)明在冰浴條件(0°C)下，在鹵醇脫鹵酶的粗酶液中先加入牛血清白蛋白作為保護(hù)劑，混合均勻后，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%?90%的飽和硫酸銨溶液進(jìn)行沉淀分離形成鹵醇脫鹵酶聚集體，然后加入戊二醛交聯(lián)固定鹵醇脫鹵酶聚集體。經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，本發(fā)明固定化的酶量回收率達(dá)84 %以上，交聯(lián)的固定化酶的酶活力回收達(dá)90 %以上。
[0010]為實(shí)現(xiàn)上述技術(shù)效果，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:
[0011]—種交聯(lián)鹵醇脫鹵酶聚集體的制備方法，包括以下步驟:
[0012]步驟A:制備鹵醇脫鹵粗酶液；
[0013]步驟B:聚集體的形成;冰浴條件下，在步驟A制得的粗酶液中加入牛血清白蛋白形成混合液，然后加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50 %?90 %的飽和硫酸銨溶液對(duì)所述混合液進(jìn)行沉淀分離，得到混合體系；其中，所述牛血清白蛋白與鹵醇脫鹵酶的質(zhì)量比為I?20:10，所述飽和硫酸銨溶液與所述混合液體積比為2.5?15:1;
[0014]步驟C:聚集體的交聯(lián);在步驟B所得混合體系中加入戊二醛交聯(lián)鹵醇脫鹵酶，優(yōu)選地，戊二醛的濃度0.1%?3.0%，交聯(lián)反應(yīng)時(shí)間為2?12小時(shí);交聯(lián)反應(yīng)完成后進(jìn)行離心處理，離心所得沉淀經(jīng)磷酸鹽緩沖液反復(fù)沖洗至清洗液檢測(cè)不出任何酶活力，制得交聯(lián)鹵醇脫鹵酶聚集體。
[0015]目前，野生型鹵醇脫鹵酶存在活性低和選擇性較差的缺陷，使其應(yīng)用受到限制。通過(guò)基因工程和分子定向進(jìn)化技術(shù)，改造天然的鹵醇脫鹵酶，并在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中高效表達(dá)，可以提高鹵醇脫鹵酶的酶活性、底物選擇性和產(chǎn)量。因此本發(fā)明所述步驟A采用構(gòu)建重組大腸桿菌制備粗酶液，具體制備步驟如下:
[0016]步驟Al:將重組鹵醇脫鹵酶基因轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞E.coli MC1061中，得到重組菌E.coli MC1061；
[0017]步驟A2:將步驟Al制得的重組菌E.coli MC1061進(jìn)行原核體外誘導(dǎo)表達(dá)，得到誘導(dǎo)菌，對(duì)誘導(dǎo)菌進(jìn)行離心處理，得到菌體，然后加入磷酸鹽緩沖液，并進(jìn)行超聲破碎，再進(jìn)行離心處理，收集上清，制得粗酶液。
[0018]其中，所述步驟Al可以將野生型鹵醇脫鹵酶的基因克隆到表達(dá)載體pBAD-TLX中，即能得到重組鹵醇脫鹵酶基因；
[0019]其中，所述步驟A2中重組菌E.coli MC1061進(jìn)行原核體外誘導(dǎo)表達(dá)是通過(guò)控制菌體溶液在600nm的波長(zhǎng)處吸光度值即0D_以調(diào)節(jié)粗酶液中鹵醇脫鹵酶的濃度，鹵醇脫鹵粗酶液的濃度優(yōu)選為18?25mg/ml，具體采用如下操作步驟實(shí)現(xiàn):
[0020]將重組菌E.coliMC1061單克隆接種到含有濃度為100yg/ml的氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，放于溫度為37 0C、轉(zhuǎn)速為180rpm的搖床中過(guò)夜培養(yǎng)，待細(xì)菌生長(zhǎng)至OD6qq值為1.5?2.5時(shí)，在無(wú)菌條件下取占總體積I %的菌體進(jìn)行大量培養(yǎng)，待細(xì)菌生長(zhǎng)至OD6qq為0.6?0.8時(shí)，加入阿拉伯糖誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)，使其在溶液中濃度為50yg/ml，待菌體生長(zhǎng)至OD6qq值為
2.2?2.9時(shí)，進(jìn)行離心處理，收集菌體，采用磷酸鹽緩沖液重懸菌體后進(jìn)行超聲破碎，進(jìn)行離心處理，收集上清液，最終制得鹵醇脫鹵酶濃度為18?25mg/ml的粗酶液。
[0021]本發(fā)明通過(guò)將鹵醇脫鹵酶基因序列轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞大腸桿菌E.coli MC1061中，得到重組菌，再通過(guò)誘導(dǎo)表達(dá)、超聲破碎、離心處理、取上清得到粗酶液;在上述粗酶液中加入牛血清蛋白作為聚集劑及保護(hù)劑，加入硫酸銨溶液進(jìn)行沉淀并聚集，形成鹵醇脫鹵酶酶聚集體，再加入戊二醛進(jìn)行交聯(lián)并保持酶聚集體的構(gòu)象，從而制備得到交聯(lián)鹵醇脫鹵酶聚集體。
[0022]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果:
[0023]1.本發(fā)明采用聯(lián)酶聚集體法(CLEAs)技術(shù)得到的交聯(lián)鹵醇脫鹵酶聚集體，具有較高的機(jī)械強(qiáng)度，較好的熱穩(wěn)定性；由后文中實(shí)施例可以看出:最優(yōu)制備條件下固定化酶(交聯(lián)鹵醇脫鹵酶聚集體)量可達(dá)總酶量的84.29% ,交聯(lián)鹵醇脫鹵酶聚集體酶活力為470.2U/g，與游離粗酶的酶活相比，相對(duì)酶活力可達(dá)91.36%，交聯(lián)鹵醇脫鹵酶聚集體對(duì)I，3-二氯_
2-丙醇(I，3-DCP)的降解能力達(dá)到:Ig蛋白每分鐘降解I，3-二氯-2-丙醇高達(dá)470.2ymol。
[0024]2.本發(fā)明運(yùn)用交聯(lián)酶聚集體法(CLEAs)技術(shù)可采用粗酶液進(jìn)行固定化，并可實(shí)現(xiàn)反復(fù)利用，具有較高的重復(fù)利用率，本發(fā)明操作簡(jiǎn)單，成本低廉，適用于大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)。
[0025]3.由于鹵醇脫鹵酶(HheC)能實(shí)現(xiàn)將環(huán)境中有毒難降解的有機(jī)鹵化物高效降解，得到毒性較低的環(huán)氧化物，或者后續(xù)再結(jié)合環(huán)氧化物水解酶(EchA)的作用，將該類(lèi)有機(jī)鹵化物徹底降解為無(wú)毒的甘油，因此，制備出酶活性高，穩(wěn)定性高的固定化鹵醇脫鹵酶是對(duì)有毒的有機(jī)鹵化物的處理實(shí)現(xiàn)新的跨越，對(duì)我們賴(lài)以生存的環(huán)境具有重大意義。
[0026]4.鹵醇脫鹵酶(HheC)可以用來(lái)合成光學(xué)純的中間體，這些化合物在各類(lèi)手性合成的合成領(lǐng)域中具有無(wú)法比擬的優(yōu)越性。因此光學(xué)純的環(huán)氧化物及其前體鄰鹵醇在有機(jī)合成中具有重要的應(yīng)用價(jià)值，固定化鹵醇脫鹵酶可廣泛應(yīng)用于手性藥物合成過(guò)程中的催化。
【附圖說(shuō)明】
[0027]圖1是本發(fā)明中重組鹵醇脫鹵酶基因重組表達(dá)示意圖；
[0028]圖2是實(shí)驗(yàn)室前期工作鹵醇脫鹵粗酶最優(yōu)條件表達(dá)圖；其中，泳道1，2，3分別為:蛋白質(zhì)marker，鹵醇脫鹵酶沉淀，鹵醇脫鹵酶上清；
[0029]圖3是本發(fā)明一種【具體實(shí)施方式】下不同硫酸銨溶液濃度對(duì)交聯(lián)鹵醇脫鹵酶聚集體酶活性影響圖；
[0030]圖4是本發(fā)明一種【具體實(shí)施方式】下不同溫度對(duì)交聯(lián)鹵醇脫鹵酶聚集體酶活性影響圖；
[0031]圖5是本發(fā)明一種【具體實(shí)施方式】下不同體積比的沉淀劑對(duì)交聯(lián)鹵醇脫鹵酶聚集體酶活性影響圖；
[0032]圖6是本發(fā)明一種【具體實(shí)施方式】下不同牛血清蛋白(BSA)濃度對(duì)交聯(lián)鹵醇脫鹵酶聚集體酶活性影響圖；
[0033]圖7是本發(fā)明一種【具體實(shí)施方式】下不同濃度的戊二醛對(duì)交聯(lián)鹵醇脫鹵酶聚集體酶活性影響圖；
[0034]圖8是本發(fā)明一種【具體實(shí)施方式】下不同的交聯(lián)時(shí)間對(duì)交聯(lián)鹵醇脫鹵酶聚集體酶活性影響圖；
[0035]圖9是本發(fā)明一種【具體實(shí)施方式】中測(cè)定最優(yōu)制備條件下交聯(lián)鹵醇脫鹵酶聚集體的機(jī)械強(qiáng)度的結(jié)果圖；
[0036]圖10是本發(fā)明一種【具體實(shí)施方式】中測(cè)定最優(yōu)制備條件下交聯(lián)鹵醇脫鹵酶聚集體的回收率的結(jié)果圖；
[0037]圖11是本發(fā)明一種【具體實(shí)施方式】中測(cè)定最優(yōu)制備條件下交聯(lián)鹵醇脫鹵酶聚集體的熱穩(wěn)定性的結(jié)果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0038]以下結(jié)合說(shuō)明書(shū)附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步說(shuō)明:
[0039]實(shí)施例1:
[0040]—種交聯(lián)鹵醇脫鹵酶聚集體的制備方法，包括以下步驟:
[0041]步驟A:制備鹵醇脫鹵粗酶液；具體采用采用構(gòu)建重組大腸桿菌的方式制備粗酶液，其步驟如下:
[0042]Al:將重組鹵醇脫鹵酶基因轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞E.coli MC1061中，得到重組菌E.col iMC1061，如圖1所示為重組鹵醇脫鹵酶基因重組表達(dá)示意圖；
[0043](I)感受態(tài)的制備:
[0044]在無(wú)菌條件下，將宿主菌E.coli MC1061在固體LB培養(yǎng)基上劃線生長(zhǎng)，37°C倒置過(guò)夜培養(yǎng)。從菌體平板上挑取一單克隆體，接種到新鮮LB液體培養(yǎng)基中，在溫度為37°C，速率為180rpm的搖床上培養(yǎng)約5小時(shí)，待006()() = 0.3?0.6，取11111菌液在轉(zhuǎn)速為12000印111的條件下離心I分鐘，去掉離心所得上清;然后加入預(yù)冰冷的Iml濃度為0.lmol/L的CaCl2,渦旋混勻后冰浴30分鐘，再在轉(zhuǎn)速為12000rpm的條件下離心I分鐘，去掉離心所得上清，然后加入10yL預(yù)冰冷的濃度為0.lmol/L的CaCl2，吹打懸浮細(xì)胞，制得的細(xì)胞懸浮液用于轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)；
[0045](2)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化
[0046]向感受態(tài)細(xì)胞中加入IyL質(zhì)粒，輕微混勻后冰浴30分鐘，在42°C水浴熱擊60秒后迅速取出冰浴2?3分鐘，加入900yL新鮮LB培養(yǎng)基，在溫度為37°C，速率為180rpm的搖床上復(fù)蘇I小時(shí);復(fù)蘇完成后于轉(zhuǎn)速為12000rpm的條件下離心I分鐘，棄掉離心所得的900yL上清，然后將余液吹打均勻；
[0047]制備含氨芐青霉素(Amp)濃度為lOOyg/ml的選擇性固體培養(yǎng)基平板多塊，吸取所述余液15yL加入選擇性培養(yǎng)基平板上，用涂布器涂布均勻;將平板放置在37°C培養(yǎng)箱中倒置過(guò)夜培養(yǎng)，得到重組鹵醇脫鹵酶基因已轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞大腸桿菌E.coli MC1061的重組菌E.coli MC1061。
[0048]A2:重組鹵醇脫鹵酶的誘導(dǎo)表達(dá)
[0049]菌體的表達(dá)主要分為小量擴(kuò)增和大量表達(dá)兩個(gè)步驟:
[0050](I)小量擴(kuò)增:無(wú)菌條件下，從平板上挑取單克隆菌體接種到20ml含有濃度為100μg/ml的氨芐青霉素(Amp)的滅菌LB液體培養(yǎng)基中，在溫度為37°C，速率為180rpm的搖床上過(guò)夜培養(yǎng)，待菌體濃度OD6qq為0.8?1.0時(shí)，取出培養(yǎng)基用于大量表達(dá)；
[0051 ] (2)大量表達(dá):無(wú)菌條件下，取小量擴(kuò)增菌體3ml接種到含有濃度為100yg/ml的氨芐青霉素的300ml的滅菌LB液體培養(yǎng)基中，根據(jù)實(shí)驗(yàn)室前期工作，采用優(yōu)化后條件:置于溫度為25°C，速率為180rpm的搖床培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)菌生長(zhǎng)至OD6qq為0.8時(shí)，加入阿拉伯糖誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)，混勻后體系中阿拉伯糖誘導(dǎo)劑濃度為50ug/ml;待菌體生長(zhǎng)到OD6qq為2.5時(shí)，取出適量進(jìn)行蛋白電泳的檢測(cè)，如圖2所示，每個(gè)樣品采用30ml菌液離心得到菌體量，其表達(dá)量達(dá)到50%以上;余液在轉(zhuǎn)速為4000rpm的條件下離心15分鐘后保存于-40°C待用以制備鹵醇脫鹵酶粗酶液。
[0052]將上述離心處理后保存的菌體重懸于濃度為50mmol/L的磷酸鹽緩沖液中，超聲破碎直至液體透光，分裝后于溫度為4°C，13000rpm條件下，離心60分鐘，在本實(shí)施例中，取部分上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠電泳以檢測(cè)目的蛋白。從圖2中可看出目的蛋白在28kDa左右，本實(shí)施例成功獲得了可溶性目的蛋白即粗酶液。離心所得上清即為鹵醇脫鹵酶粗酶液，冰浴放置，待用。
[0053]步驟B:聚集體的形成;采用考馬氏亮藍(lán)法測(cè)蛋白濃度測(cè)定步驟A制得粗酶液濃度為20mg/ml，冰浴條件下，取所述粗酶液Iml，加入16mg牛血清白蛋白粉末形成混合液，冰浴條件下(0°C)攪拌15分鐘，緩慢滴加7.5ml質(zhì)量分?jǐn)?shù)為70%的飽和硫酸銨溶液對(duì)所述混合液進(jìn)行沉淀分離，攪拌I小時(shí)，形成混合體系；
[0054]步驟C:聚集體的交聯(lián);在步驟B所得混合體系中加入戊二醛使得混合體系中戊二醛濃度為0.75%，交聯(lián)反應(yīng)6小時(shí)，形成懸液;將所述懸液在溫度為4°C，轉(zhuǎn)速為4000rpm的條件下離心15分鐘，將離心所得沉淀重懸于20ml濃度為50mmol/L的磷酸鹽(PBS)緩沖液中懸浮洗脫30分鐘，反復(fù)沖洗至清洗液檢測(cè)不出任何酶活力，將最終液體在溫度為4°C，轉(zhuǎn)速為4000rpm的條件下離心15分鐘，收集所得沉淀，所述沉淀為制得的交聯(lián)鹵醇脫鹵酶聚集體。
[0055]實(shí)施例2:
[0056]不同濃度沉淀劑(硫酸銨溶液)對(duì)交聯(lián)鹵醇脫鹵酶聚集體的酶活影響:
[0057]本實(shí)施例采用以下反應(yīng)體系，以硫酸銨溶液濃度為單一變量，完成五組固定化鹵醇脫鹵酶的平行實(shí)驗(yàn):
[0058]在冰浴條件下，取五組濃度為20mg/ml的鹵醇脫鹵粗酶液Iml，均加入20mg牛血清白蛋白(BSA)粉末攪拌15分鐘，在五組混合液中分別緩慢滴加5ml濃度為50 %，60 %，70 %，80% ,90%的硫酸銨溶液，然后攪拌I小時(shí)，再緩慢滴加戊二醛使得溶液中戊二醛濃度為I %，交聯(lián)2小時(shí)，制得交聯(lián)鹵醇脫鹵酶聚集體。
[0059 ]本實(shí)施例取實(shí)施例1步驟A制得待用的濃度為20mg/ml的鹵醇脫鹵粗酶液采用氯離子測(cè)酶活的方法測(cè)定其酶活力為514.7U/g，然后采用同樣方法對(duì)上述五組平行實(shí)驗(yàn)制得的交聯(lián)鹵醇脫鹵酶聚集體的酶活進(jìn)行定量測(cè)定并與上述游離鹵醇脫鹵酶比較。(不同的是，固定化酶濃度是由粗酶液濃度與交聯(lián)后離心上清液按比例計(jì)算所得酶濃度差值得到的，固定化酶測(cè)酶活需要離心取上清檢測(cè))實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示，結(jié)果表明:當(dāng)硫酸銨溶液濃度為70 %時(shí)，交聯(lián)鹵醇脫鹵酶聚集體的酶活為344.18U/g，交聯(lián)鹵醇脫鹵酶聚集體相對(duì)游離粗酶的酶活可達(dá)66.87 %。
[0060]實(shí)施例3:
[0061]不同固定化溫度對(duì)交聯(lián)鹵醇脫鹵酶聚集體的酶活影響
[0062]本實(shí)施例采用以下反應(yīng)體系，以固定化溫度為單一變量，完成三組固定化鹵醇脫鹵酶的平行實(shí)驗(yàn):
[0063]于O°C、15 °C和30 °C這三個(gè)溫度下，分別取濃度為20mg/ml的鹵醇脫鹵粗酶液Iml，均加入20mg牛血清白蛋白(BSA)粉末攪拌15分鐘，然后再分別緩慢滴加5ml濃度為70%的硫酸銨溶液，攪拌I小時(shí)后，再緩慢滴加戊二醛使得溶液中戊二醛濃度為1%，交聯(lián)反應(yīng)2小時(shí)，制得交聯(lián)鹵醇脫鹵酶聚集體。
[0064]本實(shí)施例采用氯離子測(cè)酶活的方法測(cè)定上述制得的三組交聯(lián)鹵醇脫鹵酶聚集體的酶活力，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示，結(jié)果表明:當(dāng)溫度為(TC時(shí)，交聯(lián)的鹵醇脫鹵酶活性最高。
[0065]實(shí)施例4:
[0066]不同沉淀劑(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為70%的硫酸銨溶液)用量對(duì)交聯(lián)鹵醇脫鹵酶聚集體的酶活影響:
[0067]本實(shí)施例采用以下反應(yīng)體系，以沉淀劑(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為70%的硫酸銨溶液)與牛血清白蛋白溶解于粗酶液形成的混合溶液的體積比(簡(jiǎn)稱(chēng)體積比)為單一變量，完成五組固定化鹵醇脫鹵酶的平行實(shí)驗(yàn):
[0068]在冰浴條件下，取五組濃度為20mg/ml的鹵醇脫鹵粗酶液Iml，均加入20mg牛血清白蛋白(BSA)粉末攪拌15分鐘，形成混合液。在五組混合液中分別緩慢滴加體積比為2.5:1，5:1，7.5:1，10:1，15:1的硫酸銨溶液，所述硫酸銨溶液的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為70 %，然后攪拌I小時(shí)，再緩慢滴加戊二醛使得溶液中戊二醛濃度為I %，交聯(lián)2小時(shí)，制得交聯(lián)鹵醇脫鹵酶聚集體。[0069 ]本實(shí)施例取實(shí)施例1步驟A制得待用的濃度為20mg/ml的鹵醇脫鹵粗酶液采用氯離子測(cè)酶活的方法測(cè)定其酶活力為514.7U/g，然后采用同樣方法對(duì)上述五組平行實(shí)驗(yàn)制得的交聯(lián)鹵醇脫鹵酶聚集體的酶活進(jìn)行定量測(cè)定并與上述游離鹵醇脫鹵酶比較。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示，結(jié)果表明:當(dāng)沉淀劑(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為70%的硫酸銨溶液)與牛血清白蛋白溶解于粗酶液形成的混合溶液的體積比為7.5:1時(shí)，交聯(lián)鹵醇脫鹵酶聚集體的酶活為352.31U/g，交聯(lián)鹵醇脫鹵酶聚集體相對(duì)游離粗酶的酶活可達(dá)68.45%。
[0070]實(shí)施例5:
[0071]牛血清白蛋白(BSA)添加量對(duì)交聯(lián)鹵醇脫鹵酶聚集體的酶活影響
[0072]本實(shí)施例采用以下反應(yīng)體系，以牛血清白蛋白(BSA)與鹵醇脫鹵粗酶的質(zhì)量比為單一變量，完成七組固定化鹵醇脫鹵酶的平行實(shí)驗(yàn):
[0073]在冰浴條件下，取七組濃度為20mg/ml的鹵醇脫鹵粗酶液lml，分別加入質(zhì)量為Omg，2mg，4mg，8mg，12mg，16mg，20mg牛血清白蛋白(BSA)粉末攪拌15分鐘，形成七組混合液。在七組混合液中緩慢滴加7.5ml質(zhì)量分?jǐn)?shù)為70%的硫酸銨溶液，然后攪拌I小時(shí)，再緩慢滴加戊二醛使得溶液中戊二醛濃度為I %，交聯(lián)2小時(shí)，制得交聯(lián)鹵醇脫鹵酶聚集體。
[0074]本實(shí)施例取實(shí)施例1步驟A制得待用的濃度為20mg/ml的鹵醇脫鹵粗酶液采用氯離子測(cè)酶活的方法測(cè)定其酶活力為514.7U/g，然后采用同樣方法對(duì)上述五組平行實(shí)驗(yàn)制得的交聯(lián)鹵醇脫鹵酶聚集體的酶活進(jìn)行定量測(cè)定并與上述游離鹵醇脫鹵酶比較。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6所示，結(jié)果表明:當(dāng)牛血清白蛋白(BSA)與鹵醇脫鹵粗酶的質(zhì)量比為0.8:1時(shí)，交聯(lián)鹵醇脫鹵酶聚集體的酶活為384.89U/g，交聯(lián)鹵醇脫鹵酶聚集體相對(duì)游離粗酶的酶活可達(dá)74.78%。
[0075]實(shí)施例6:
[0076]戊二醛濃度對(duì)交聯(lián)鹵醇脫鹵酶聚集體的酶活影響
[0077]本實(shí)施例采用以下反應(yīng)體系，以戊二醛最終濃度為單一變量，完成六組固定化鹵醇脫鹵酶的平行實(shí)驗(yàn):
[0078]在冰浴條件下，取六組濃度為20mg/ml的鹵醇脫鹵粗酶液lml，加入16mg牛血清白蛋白(BSA)粉末攪拌15分鐘，形成六組混合液。在六組混合液中緩慢滴加7.5ml質(zhì)量分?jǐn)?shù)為70 %的硫酸銨溶液，然后攪拌I小時(shí)，在六組中均緩慢滴加戊二醛，使得六組溶液中戊二醛濃度為分別為0.1 %,0.25%,0.5%,0.75% ,1.00% ,1.5%,交聯(lián)反應(yīng)2小時(shí)，制得交聯(lián)鹵醇脫鹵酶聚集體。
[0079 ]本實(shí)施例取實(shí)施例1步驟A制得待用的濃度為20mg/ml的鹵醇脫鹵粗酶液采用氯離子測(cè)酶活的方法測(cè)定其酶活力為514.7U/g，然后采用同樣方法對(duì)上述六組平行實(shí)驗(yàn)制得的交聯(lián)鹵醇脫鹵酶聚集體的酶活進(jìn)行定量測(cè)定并與上述游離鹵醇脫鹵酶比較。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖7所示，結(jié)果表明:當(dāng)溶液中戊二醛濃度為0.75%，交聯(lián)鹵醇脫鹵酶聚集體的酶活為405.64U/g，交聯(lián)鹵醇脫鹵酶聚集體相對(duì)游離粗酶的酶活可達(dá)78.81 %。
[0080] 實(shí)施例7:
[0081 ]交聯(lián)時(shí)間對(duì)交聯(lián)鹵醇脫鹵酶聚集體的酶活影響:
[0082]本實(shí)施例采用以下反應(yīng)體系，以交聯(lián)反應(yīng)時(shí)間為單一變量，完成六組固定化鹵醇脫鹵酶的平行實(shí)驗(yàn):
[0083]在冰浴條件下，取六組濃度為20mg/ml的鹵醇脫鹵粗酶液lml，加入質(zhì)量為16mg牛血清白蛋白(BSA)粉末攪拌15分鐘，形成六組混合液。在六組混合液中緩慢滴加7.5ml質(zhì)量分?jǐn)?shù)為70 %的硫酸銨溶液，然后攪拌I小時(shí)，再緩慢滴加戊二醛使得溶液中戊二醛濃度為
0.75%，六組交聯(lián)反應(yīng)分別為2小時(shí)，4小時(shí)，6小時(shí)，8小時(shí)，10小時(shí)，12小時(shí)，最終制得交聯(lián)鹵醇脫鹵酶聚集體。
[0084]本實(shí)施例取實(shí)施例1步驟A制得待用的濃度為mg/ml的鹵醇脫鹵粗酶液采用氯離子測(cè)酶活的方法測(cè)定其酶活力為514.7U/g，然后采用同樣方法對(duì)上述五組平行實(shí)驗(yàn)制得的交聯(lián)鹵醇脫鹵酶聚集體的酶活進(jìn)行定量測(cè)定并與上述游離鹵醇脫鹵酶比較。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖8所示，結(jié)果表明:當(dāng)交聯(lián)反應(yīng)時(shí)間為6小時(shí)，交聯(lián)鹵醇脫鹵酶聚集體的酶活為470.23U/g，交聯(lián)鹵醇脫鹵酶聚集體相對(duì)游離粗酶酶活可達(dá)91.36%。
[0085]根據(jù)實(shí)施例2?7的單因素實(shí)驗(yàn)得出交聯(lián)鹵醇脫鹵酶聚集體制備的最優(yōu)條件，經(jīng)測(cè)定本實(shí)施例固定化的酶量為總酶量的84.29% ,且最優(yōu)條件下交聯(lián)鹵醇脫鹵酶聚集體對(duì)I，
3-二氯-2-丙醇(I，3-DCP)的降解能力達(dá)到:Ig蛋白每分鐘可降解470.23ymol I，3-DCP。
[0086]實(shí)施例8:
[0087]本實(shí)施例測(cè)定最優(yōu)制備條件下交聯(lián)鹵醇脫鹵酶聚集體的機(jī)械強(qiáng)度:
[0088]在冰浴條件下，取濃度為20mg/ml的鹵醇脫鹵粗酶液lml，加入質(zhì)量為16mg牛血清白蛋白(BSA)粉末，攪拌15分鐘，形成混合液;在所述混合液中緩慢滴加7.5ml質(zhì)量分?jǐn)?shù)為70 %的硫酸銨溶液，攪拌I小時(shí)，然后緩慢滴加戊二醛使得溶液中戊二醛濃度為0.75 %，交聯(lián)反應(yīng)分別為6小時(shí)，最終制得交聯(lián)鹵醇脫鹵酶聚集體。
[0089]將上述制得的交聯(lián)鹵醇脫鹵酶聚集體保存于1ml濃度為50mmol/L的PBS緩沖液中，用以后續(xù)酶活檢測(cè)。稱(chēng)取適量交聯(lián)鹵醇脫鹵酶聚集體在同樣實(shí)驗(yàn)條件下反復(fù)沖洗十次，每次沖洗后進(jìn)行離心處理后，混勻于緩沖液中再測(cè)定酶活性，所得實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖9所示。
[0090]圖9結(jié)果表明:反復(fù)沖洗10次后，固定化酶保留初始酶活的90%以上。因此，本實(shí)施例中可以得出交聯(lián)鹵醇脫鹵酶聚集體具有較好的機(jī)械穩(wěn)定性。
[0091]實(shí)施例9:
[0092]本實(shí)施例測(cè)定最優(yōu)制備條件下交聯(lián)鹵醇脫鹵酶聚集體的回收率:
[0093]在冰浴條件下，取濃度為20mg/ml的鹵醇脫鹵粗酶液lml，加入質(zhì)量為16mg牛血清白蛋白(BSA)粉末，攪拌15分鐘，形成混合液;在所述混合液中緩慢滴加7.5ml質(zhì)量分?jǐn)?shù)為70 %的硫酸銨溶液，攪拌I小時(shí)，然后緩慢滴加戊二醛使得溶液中戊二醛濃度為0.75 %，交聯(lián)反應(yīng)分別為6小時(shí)，最終制得交聯(lián)鹵醇脫鹵酶聚集體。
[0094]將上述制得的交聯(lián)鹵醇脫鹵酶聚集體置于PBS緩沖液中，加入30ml的1,3-二氯-2-丙醇(1，3-DCP)，使得溶液中1，3_ 二氯-2-丙醇濃度為5mmol/L;然后在溫度為25°C的條件下磁力攪拌，每次反應(yīng)30分鐘，反應(yīng)后進(jìn)行離心處理并除去上清，然后用30ml濃度5mmol/L的PBS緩沖液反復(fù)沖洗，離心處理兩次后將沉淀保存于PBS緩沖液中，并采用氯離子測(cè)酶活的方式測(cè)定酶活，結(jié)果如圖10所示。
[0095]圖10結(jié)果表明:交聯(lián)鹵醇脫鹵酶聚集體在反應(yīng)5次后相較初始酶的相對(duì)酶活為58.25%。說(shuō)明交聯(lián)鹵醇脫鹵酶聚集體可以多次反復(fù)利用并具有較高的重復(fù)利用率。
[0096]實(shí)施例10:
[0097]本實(shí)施例測(cè)定最優(yōu)制備條件下交聯(lián)鹵醇脫鹵酶聚集體的熱穩(wěn)定性:
[0098]在冰浴條件下，取濃度為20mg/ml的鹵醇脫鹵粗酶液lml，加入質(zhì)量為16mg牛血清白蛋白(BSA)粉末，攪拌15分鐘，形成混合液;在所述混合液中緩慢滴加7.5ml質(zhì)量分?jǐn)?shù)為70 %的硫酸銨溶液，攪拌I小時(shí)，然后緩慢滴加戊二醛使得溶液中戊二醛濃度為0.75 %，交聯(lián)反應(yīng)分別為6小時(shí)，最終制得交聯(lián)鹵醇脫鹵酶聚集體。
[0099]將上述制得的交聯(lián)鹵醇脫鹵酶聚集體(固定化酶)分別置于30°C、4(TC、5(rC水浴條件下保存，采用氯離子測(cè)酶活的方式，每隔固定的時(shí)間間隔取出反應(yīng)體系用于檢測(cè)酶活，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖11所示。
[0100]由于有文獻(xiàn)報(bào)道，游離酶具有較差的溫度耐受性，30°C以上很容易失活，而圖11結(jié)果表明:300C條件下，8小時(shí)后固定化酶的酶活達(dá)初始酶活95%以上;40°C條件下，8小時(shí)后固定化酶的酶活達(dá)初始酶活87%以上；50°C條件下，8小時(shí)后固定化酶的酶活達(dá)初始酶活60%以上。因此，本實(shí)施例可以說(shuō)明交聯(lián)鹵醇脫鹵酶聚集體具有較好的熱穩(wěn)定性。
[0101]盡管上面對(duì)本發(fā)明說(shuō)明性的【具體實(shí)施方式】進(jìn)行了描述，以便于本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員理解本發(fā)明，但應(yīng)該清楚，本發(fā)明不限于【具體實(shí)施方式】的范圍，對(duì)本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)講，只要各種變化在所附的權(quán)利要求限定和確定的本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，這些變化是顯而易見(jiàn)的，一切利用本發(fā)明構(gòu)思的發(fā)明創(chuàng)造均在保護(hù)之列。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種交聯(lián)鹵醇脫鹵酶聚集體的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: A:制備鹵醇脫鹵粗酶液； B:聚集體的形成；冰浴條件下，在步驟A制得的粗酶液中加入牛血清白蛋白形成混合液，然后加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50 %?90 %的飽和硫酸銨溶液對(duì)所述混合液進(jìn)行沉淀分離，形成鹵醇脫鹵酶聚集體;其中，所述牛血清白蛋白與鹵醇脫鹵粗酶的質(zhì)量比為I?20:10，所述飽和硫酸銨溶液與所述混合液體積比為2.5?15:1; C:聚集體的交聯(lián);在步驟B所得體系中加入戊二醛交聯(lián)鹵醇脫鹵酶，交聯(lián)反應(yīng)完成后進(jìn)行離心處理，離心所得沉淀經(jīng)磷酸鹽緩沖液反復(fù)沖洗至清洗液檢測(cè)不出任何酶活力，制得交聯(lián)鹵醇脫鹵酶聚集體。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種交聯(lián)鹵醇脫鹵酶聚集體的制備方法，其特征在于，所述步驟A中制備粗酶液的具體步驟為: Al:將重組鹵醇脫鹵酶基因轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞E.coli MC1061中，得到重組菌E.coliMC1061； A2:將步驟Al制得的重組菌E.coli MC1061進(jìn)行原核體外誘導(dǎo)表達(dá)，得到誘導(dǎo)菌，對(duì)誘導(dǎo)菌進(jìn)行離心處理，獲得菌體，然后加入磷酸鹽緩沖液，并進(jìn)行超聲破碎，再進(jìn)行離心處理，收集上清，制得粗酶液。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種交聯(lián)鹵醇脫鹵酶聚集體的制備方法，其特征在于，所述步驟Al中重組鹵醇脫鹵酶基因的步驟具體為:將野生型鹵醇脫鹵酶的基因克隆到表達(dá)載體pBAD-TLX中，得到重組鹵醇脫鹵酶基因。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種交聯(lián)鹵醇脫鹵酶聚集體的制備方法，其特征在于，所述步驟C中戊二醛的濃度0.1 %?3.0%，交聯(lián)反應(yīng)時(shí)間為2?12小時(shí)。5.根據(jù)權(quán)利要求1至4任一項(xiàng)所述的一種交聯(lián)鹵醇脫鹵酶聚集體的制備方法，其特征在于，所述步驟A中鹵醇脫鹵粗酶液的濃度為18?25mg/ml。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種交聯(lián)鹵醇脫鹵酶聚集體的制備方法，其特征在于，所述步驟A2中具體為:將重組菌E.coli MC1061單克隆接種到含有濃度為100yg/mL的氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，放于溫度為37°C、轉(zhuǎn)速為180rpm的搖床中過(guò)夜培養(yǎng)，待細(xì)菌生長(zhǎng)至OD600值為0.8?1.0時(shí)，在無(wú)菌條件下取占總體積I %的菌體進(jìn)行大量培養(yǎng)，待細(xì)菌生長(zhǎng)至OD600為.0.6?0.8時(shí)，加入阿拉伯糖誘導(dǎo)劑并使其在溶液中的濃度為50yg/ml，待菌體生長(zhǎng)至OD600值為2.2?2.9時(shí)，進(jìn)行離心處理，收集菌體，采用磷酸鹽緩沖液重懸菌體后進(jìn)行超聲破碎，進(jìn)行離心處理，收集上清液，最終制得鹵醇脫鹵酶濃度為18?25mg/ml的粗酶液。
【文檔編號(hào)】C12N11/02GK106047848SQ201610556615
【公開(kāi)日】2016年10月26日
【申請(qǐng)日】2016年7月15日
【發(fā)明人】湯麗霞, 廖茜, 馮娟, 仝亞沛, 鄧文鳳, 辛東民
【申請(qǐng)人】電子科技大學(xué)