提高利用昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)表達外源蛋白效率的方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種利用昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)表達外源蛋白的方法，特別涉及一種 提高利用昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)表達外源蛋白的方法，屬于外源蛋白表達制備技術領域。
【背景技術】
[0002] 近20年來昆蟲細胞-桿狀病毒表達系統(tǒng)（BEVS)被成功應用于表達了很多外源蛋 白。目前有三個相對比較好的細胞系具有良好的性質，適用于AcMNPB和BmNPV重組蛋白表 達的研宄和生產(chǎn)，其包括：來源于秋粘蟲卵巢組織的IPLB-SF21AE(Sf21)細胞系及其衍生 株Sf9,來自甘藍尺鑊的BTITN5Bl-4(HighFive)細胞系，以及來源于家蠶卵巢的BmN及其 亞系。其中Sf9是其中應用比較廣泛的細胞株，現(xiàn)在有很多產(chǎn)品都應用昆蟲桿狀病毒表達 外源蛋白，尤其是VLP作為疫苗。
[0003] 昆蟲細胞屬于半貼壁細胞，可以使用含有10 %的胎牛血清（FBS)培養(yǎng)，也可以進 行無血清貼壁培養(yǎng)，為了更加適應大規(guī)模生產(chǎn)，現(xiàn)在一般均進行無血清懸浮培養(yǎng)，現(xiàn)有的利 用BEVS系統(tǒng)表達蛋白制備疫苗均采用懸浮培養(yǎng)的方式進行。因此在整個工藝過程中，細胞 系的倍增時間、細胞密度、細胞對病毒敏感性和細胞表達外源基因的能力成為主要的考慮 因素。
[0004] 目前國內外已經(jīng)利用昆蟲-桿狀病毒表達系統(tǒng)已經(jīng)成功開發(fā)上市了多種疫苗產(chǎn) 品，包括人用上市疫苗、獸用上市疫苗等。將目標基因經(jīng)過優(yōu)化，然后通過分子生物學手段， 構建獲得充足桿狀病毒，再通過桿狀病毒感染昆蟲細胞，經(jīng)過獲得目標蛋白，再經(jīng)過各種純 化手段獲得符合要求的目標產(chǎn)物，是目前利用昆蟲-桿狀病毒系統(tǒng)開發(fā)疫苗產(chǎn)品的基本思 路。一方面昆蟲細胞生產(chǎn)的蛋白質較原核和低等真核表達系統(tǒng)更容易糖基化，是蛋白質更 加接近天然活性狀態(tài)，另一方面利用桿狀病毒表達病毒蛋白較293細胞和CHO細胞表達系 統(tǒng)更具有優(yōu)勢。因為以上優(yōu)勢，有多種利用該表達系統(tǒng)生產(chǎn)的疫苗處于臨床期或者研發(fā)期。
[0005] 目前，使用昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)進行蛋白表達，雖然已經(jīng)實現(xiàn)了 1000L的生產(chǎn) 規(guī)模，但是在昆蟲細胞桿狀病毒表達系統(tǒng)使用過程中存在一個重要的影響因素一一 "細胞 密度效應"，即在接種桿狀病毒時，細胞密度應低于3X106cells/ml，更為有效的是應低于 2X106cell/ml，高于該細胞密度接種病毒外源蛋白表達量不會提高甚至會下降。盡管有報 道稱，使用灌注培養(yǎng)工藝，可以提高接種病毒時的細胞密度，外源蛋白表達量也會提高，但 昆蟲細胞耗氧量極高，使用灌注培養(yǎng)現(xiàn)有的生物反應器難以維持。而且目前該系統(tǒng)蛋白表 達量僅在15mg/L左右，對產(chǎn)品后期的純化帶來了比較大的挑戰(zhàn)。同時，昆蟲細胞在一般商 業(yè)化無血清培養(yǎng)基中的批培養(yǎng)最大細胞密度可以達到1X107cells/ml，在某些特殊的無血 清培養(yǎng)基中批培養(yǎng)可以達到2.3X107cells/ml，但是僅在低密度時接種病毒，會造成培養(yǎng) 基的嚴重浪費。

【發(fā)明內容】

[0006] 本發(fā)明的主要目的在于提供一種提高利用昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)表達外源蛋白 效率的方法，以克服現(xiàn)有技術中的不足。
[0007] 為實現(xiàn)前述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術方案包括：
[0008] 一種提高利用昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)表達外源蛋白效率的方法，包括：
[0009] (1)在培養(yǎng)基中培養(yǎng)基質細胞；
[0010] (2)在基質細胞的培養(yǎng)過程中對基質細胞進行熱擊；
[0011] ⑶接種桿狀病毒；
[0012] (4)收獲細胞懸液及提取表達的外源蛋白。
[0013] 在一較為優(yōu)選的實施方案之中，步驟（1)包括：以Sf9細胞作為基質細胞進行培 養(yǎng)。
[0014] 進一步的，步驟（1)中基質細胞的培養(yǎng)條件包括：溫度為25~28°C，攪拌轉速為 20~60rpm，溶氧為30~60 %，pH值為6. 0~6. 4。
[0015] 在一較為優(yōu)選的實施方案之中，該方法包括：在培養(yǎng)基中接種基質細胞至細胞密 度為0. 5X106~1. 5X10 6個/ml后進行培養(yǎng)，且在接種桿狀病毒前，培養(yǎng)基中的基質細胞 總量達到6X106~1X10 7個/ml。
[0016] 在一較為優(yōu)選的實施方案之中，步驟（2)包括：在接種基質細胞后60~72h，將培 養(yǎng)溫度上升1~5°C，并維持1~8小時，之后將溫度恢復至正常培養(yǎng)溫度。
[0017] 進一步的，所述培養(yǎng)基優(yōu)選為昆蟲細胞無血清培養(yǎng)基。
[0018] 在一較為優(yōu)選的實施方案之中，步驟（3)包括：按照MOI= 5~15接種桿狀病毒。
[0019] 在一較為優(yōu)選的實施方案之中，所述桿狀病毒優(yōu)選為含有PCV-2病毒殼蛋白基因 的重組桿狀病毒。
[0020] 在一較為優(yōu)選的實施方案之中，該方法包括：采用補料分批培養(yǎng)方式培養(yǎng)基質細 胞。
[0021] 在一較為優(yōu)選的實施方案之中，該方法還包括：在接種桿狀病毒后，間歇補加營養(yǎng) 物質，所述營養(yǎng)物質包括葡萄糖、谷氨酰胺、蛋白胨、酵母提取物中的任一種或兩種以上的 組合。
[0022] 相對于現(xiàn)有的昆蟲細胞桿狀病毒表達系統(tǒng)來說，本發(fā)明方法中利用無血清培養(yǎng) 基培養(yǎng)昆蟲細胞，例如Sf9昆蟲細胞，并且不因為"細胞密度效應"而在細胞生長到1. 5~ 3X106個/ml時接種桿狀病毒啟動外源基因表達。造成"細胞密度效應"的本質是當細胞 達到某個細胞密度后，這個時期S期細胞占得的比例及總量最多，當細胞密度繼續(xù)升高，S 期細胞比例和數(shù)量都下降很快，所以即使提高接種病毒時候的細胞密度并相應增加病毒接 種量也不能提高甚至是降低外源基因的表達量。當細胞增長至需要的密度，對細胞進行一 定時間的熱擊，之后恢復正常培養(yǎng)溫度，細胞中S期細胞比例顯著增加。S期細胞增加為病 毒侵染提供了良好的條件?？梢詫崿F(xiàn)病毒在高細胞密度下的侵染。故在本發(fā)明中采用高細 胞密度接種病毒，例如在0. 6~1X107個/ml進行接毒，接種細胞密度較原來提高了 3~6 倍。同時通過熱擊效應提高了細胞中S期細胞比例，使得單細胞產(chǎn)量提高，在提高接種細胞 密度和單細胞產(chǎn)量增加雙重作用下，可以顯著提高接種病毒后外源蛋白的表達量。
[0023] 又及，傳統(tǒng)工藝中，接種病毒后一般采用分批培養(yǎng)的方式，不進行任何補充營養(yǎng)物 質的操作。但是在本發(fā)明中，接種病毒后進行分批補料培養(yǎng)，對其進行營養(yǎng)物質補充，保證 表達外源蛋白時細胞所需營養(yǎng)物質充足。
[0024] 總之，與現(xiàn)有技術相比，藉由本發(fā)明的方法中，可以顯著提高接種病毒時細胞密 度，進而大幅提高了單位體積內外源蛋白的表達量，特別是，較之現(xiàn)有的接種病毒工藝，外 源蛋白表達量可以提高7. 6倍以上，可以極大擴展該表達系統(tǒng)于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)疫苗等 生物制品中的應用。
【附圖說明】
[0025]圖1是為本發(fā)明一實施例中利用熱擊提高生物反應器領用昆蟲桿狀病毒表達系 統(tǒng)表達外源蛋白的工藝流程圖；
[0026] 圖2是在使用熱擊（實施例1)和未使用熱擊（對照例1)的條件下，生物反應器 中細胞的生長曲線圖；
[0027] 圖3是本發(fā)明一實施方案之中一種試劑盒標準品的檢測標準曲線。
【具體實施方式】
[0028] 針對現(xiàn)有技術中在利用昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)進行蛋白表達時所存在的蛋白表 達量低，培養(yǎng)基浪費嚴重等不足，本案發(fā)明人在長期研宄和大量實踐中，非常意外的發(fā)現(xiàn)， 采用熱擊法能夠令人驚喜的大幅提高昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)的表達效率?；诖税l(fā)現(xiàn)，本 案發(fā)明人得以提出本發(fā)明的技術方案，如下進行具體解釋說明。
[0029] 在本發(fā)明的一實施方案之中，提供了一種提高利用昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)表達外 源蛋白效率的方法，其包括以下步驟：
[0030] 1)應用攪拌式生物反應器培養(yǎng)基質細胞；
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