Mg-132在cho工程細(xì)胞表達(dá)外源蛋白中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，特別涉及MG-132在CH0工程細(xì)胞表達(dá)外源蛋白中的應(yīng) 用。
【背景技術(shù)】
[0002] 蛋白藥物（單克隆抗體Abs和Fc融合蛋白）在市場(chǎng)上達(dá)到60多億美元的銷售額， 而CH0細(xì)胞是良好的外源蛋白表達(dá)宿主，在上市藥物中多由其表達(dá)。細(xì)胞培養(yǎng)的過(guò)程中，死 亡的細(xì)胞裂解后會(huì)分泌蛋白酶降解分泌到上清的藥物蛋白，從而降低重組蛋白的表達(dá)量； 同時(shí)也有學(xué)者通過(guò)篩選，發(fā)現(xiàn)高活率的細(xì)胞會(huì)分泌蛋白酶Cathepsin-D來(lái)降解蛋白，從而 影響重組蛋白的質(zhì)量。
[0003] MG-132是一種蛋白酶體抑制劑，可抑制哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)泛素化蛋白質(zhì)的降解。目 前，尚未有將MG-132應(yīng)用于CH0細(xì)胞表達(dá)外源蛋白過(guò)程中的相關(guān)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，提供MG-132在CH0工程細(xì)胞表達(dá) 外源蛋白中的應(yīng)用。
[0005] 本發(fā)明的目的通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：MG-132在CH0工程細(xì)胞表達(dá)外源蛋白中的 應(yīng)用，不僅能提高外源蛋白的產(chǎn)量，也能提高外源蛋白的質(zhì)量。
[0006] 所述的MG-132在CH0工程細(xì)胞表達(dá)外源蛋白中的應(yīng)用，包括如下步驟：在CH0工 程細(xì)胞進(jìn)入穩(wěn)定生長(zhǎng)期時(shí)加入MG-132。
[0007] 所述的MG-132的使用濃度范圍40~50ymol/L。
[0008] 所述的CH0工程細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)所使用的培養(yǎng)基優(yōu)選為含3. 5~4. 5mmol/L谷氨酰 胺，0. 08~0. 12mmol/L次黃嘌呤和0. 015~0. 020mmol/L胸腺嘧啶的CH0細(xì)胞培養(yǎng)基。
[0009] 所述的CH0工程細(xì)胞指的是含有外源蛋白表達(dá)基因的CH0細(xì)胞；優(yōu)選為轉(zhuǎn)編碼人 腫瘤壞死因子受體Fc(TNFR-Fc)融合蛋白的基因的CH0細(xì)胞。
[0010] 所述的轉(zhuǎn)TNFR-Fc基因的CH0細(xì)胞的制備過(guò)程可參考專利號(hào)為201210380254. 1、 名稱為"編碼重組人TNFR-Fc融合蛋白的基因及其應(yīng)用"的國(guó)家發(fā)明專利進(jìn)行制備。
[0011] 所述的CH0細(xì)胞為常規(guī)的表達(dá)外源基因的中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞。
[0012] 所述的人腫瘤壞死因子受體Fc(TNFR-Fc)融合蛋白的氨基酸序列如下：
[0013] MAPVAVWAALAVGLELWAAAHALPAQVAFTPYAPEPGSTCRLREYYDQTAQMCCSKCSPGQHAKVFCTK TSDTVCDSCEDSTYTQLWNWVPECLSCGSRCSSDQVETQACTREQNRICTCRPGWYCALSKQEGCRLCAPLRKCRPG FGVARPGTETSDVVCKPCAPGTFSNTTSSTDICRPHQICNVVAIPGNASMDAVCTSTSPTRSMAPGAVHLPQPVSTR SQHTQPTPEPSTAPSTSFLLPMGPSPPAEGSTCDEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPE VTCVVVDVSHEDPQVKFNWYVDGVQVHNAKTKPREQQYNSTYRVVSVLTVLHQNWLDGKEYKCKVSNKALPAPIEKT ISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV DKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKo
[0014] 編碼所述的人腫瘤壞死因子受體Fc(TNFR-Fc)融合蛋白的核苷酸序列如下：
[0015] ATGGCCCCCGTGGCCGTGTGGGCTGCCCTGGCCGTGGGACTGGAACTGTGGGCTGCTGCCCACGCCCTG CCCGCCCAGGTGGCCTTCACCCCCTACGCCCCCGAGCCAGGCAGCACCTGCAGGCTGAGAGAGTACTACGACCAGAC CGCCCAGATGTGCTGCAGCAAGTGCTCTCCAGGCCAGCATGCCAAGGTGTTCTGCACCAAGACCAGCGACACCGTGT GCGACAGCTGCGAGGACAGCACCTACACCCAGCTGTGGAACTGGGTGCCCGAGTGCCTGAGCTGTGGCAGCAGGTGC TCTAGCGACCAGGTCGAGACCCAGGCCTGCACCAGAGAGCAGAACAGGATCTGCACCTGCAGACCCGGCTGGTACTG CGCCCTGAGCAAGCAGGAAGGCTGCAGGCTCTGCGCCCCACTGAGGAAGTGCAGGCCCGGCTTCGGCGTGGCCAGAC CCGGCACCGAGACCTCCGACGTGGTGTGCAAGCCCTGCGCCCCAGGCACCTTCAGCAACACCACCTCCAGCACCGAC ATCTGCAGGCCCCACCAGATCTGCAACGTGGTGGCTATCCCCGGCAATGCCAGCATGGACGCCGTGTGCACCAGCAC CTCCCCCACCAGAAGCATGGCCCCAGGCGCCGTGCACCTGCCCCAGCCCGTGAGCACCAGGTCCCAGCACACCCAGC CCACCCCAGAGCCTAGCACCGCCCCCTCTACCAGCTTCCTGCTGCCCATGGGCCCCAGCCCTCCAGCCGAGGGCAGC ACCGGCGACGAGCCCAAGAGCTGCGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGTCCTGCTCCAGAACTCCTGGGCGGACC CAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCAGGACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTGG TGGACGTGAGCCACGAGGACCCACAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGCAGGTGCACAACGCCAAGACC AAGCCCCGGGAGCAGCAGTACAACTCCACCTACAGAGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGAACTGGCTGGA CGGCAAAGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAGGCCCTGCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGG GCCAGCCCAGGGAACCCCAGGTGTACACCCTGCCACCCTCTCGAGAGGAAATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACC TGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAA GACCACCCCCCCAGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGC AGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTG TCCCCCGGCAAGTGATGA。
[0016] 本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果：
[0017] 本發(fā)明提供了蛋白酶體抑制劑MG-132的一種新功能，是在CH0細(xì)胞表達(dá)外源蛋白 時(shí)進(jìn)行應(yīng)用，以提高外源蛋白的表達(dá)量。本發(fā)明驗(yàn)證了在含有表達(dá)TNFR-Fc融合蛋白外源 基因的CH0細(xì)胞生長(zhǎng)后期（細(xì)胞密度1.OX107~1. 5X10 7cells/mL)添加蛋白酶體抑制劑 MG-132,蛋白的表達(dá)量提高20%~50%，并且具有活性的二聚體比例提高20%~30% (w/ w)，通過(guò)中和TNFa介導(dǎo)的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)，證明TNFR-Fc融合蛋白對(duì)人TNFa中和活性，即 親和力（比活性）與未添加MG-132組差異無(wú)顯著意義。
【附圖說(shuō)明】
[0018] 圖1是添加不同濃度MG-132后TNFR-Fc融合蛋白表達(dá)量的檢測(cè)結(jié)果圖。
[0019] 圖2是純化后的目的蛋白TNFR-Fc的高效液相色譜HPLC圖譜圖。
[0020] 圖3是TNFR-Fc融合蛋白阻斷TNFa誘導(dǎo)的L929細(xì)胞毒作用的結(jié)果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0021] 下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限 于此。
[0022] 實(shí)施例1
[0023] (1)CH0工程細(xì)胞的培養(yǎng)：將穩(wěn)定表達(dá)TNFR-Fc融合蛋白的CH0細(xì)胞（按專利號(hào)為 201210380254. 1、名稱為"編碼重組人TNFR-Fc融合蛋白的基因及其應(yīng)用"實(shí)施例構(gòu)建得到 的重組TNFR-Fc-2 基因的CHO細(xì)胞株）接種到HyClone?HyCell?CHOMedia，包含 4mmol/ L谷氨酰胺，0. 10mmol/L次黃嘌呤和0. 020mmol/L胸腺嘧啶，接種密度為0. 5X106個(gè)細(xì)胞 /mL，接種體積為10mL于一次性透氣生物反應(yīng)器50mLTubespin管中，培養(yǎng)溫度為37°C，轉(zhuǎn) 速為180rpm，C02濃度為6%，培養(yǎng)至穩(wěn)定期，細(xì)胞密度達(dá)到1. 2X10 7cells/mL。
[0024] MG-132 粉末（Selleck)于-80°C保存，溶于DMS0 配制 40mmol/L保存濃度，-80°C 保存，1個(gè)月內(nèi)使用。按設(shè)定濃度梯度添加到細(xì)胞培養(yǎng)液中，繼續(xù)培養(yǎng)3天直到細(xì)胞活率低 于70 % ;同時(shí)設(shè)定空白對(duì)照，為DMS0,DMS0在培養(yǎng)基中的終濃度為質(zhì)量百分比1 %。通過(guò) ELISA法檢測(cè)相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果如圖1所示，不添加MG-132時(shí)，表達(dá)量設(shè)定為1 ;MG-132的 濃度為40ymol/L~50ymol/L時(shí)，表達(dá)量高于1，且高于DMS0組，可見MG-132能導(dǎo)致外源 蛋白分泌量的增加。
[0025] (2打即1?4(3融合蛋白的純化：將步驟（1)得到的培養(yǎng)液于6000印111離心10111111，取 上清經(jīng)〇.45um濾膜過(guò)濾，經(jīng)過(guò)rProteinABestarose4FastFlow(博格隆，5mL)進(jìn)行親 和層析，親和層析平衡緩沖液為20mmol/L、pH7. 2的PB緩沖液；親和洗雜緩沖液為20mmol/ L、pH7. 2的PB緩沖液+150mmol/LNaCl;洗脫緩沖液為100mmol/L、pH3. 2甘氨酸緩沖液； 流速為1. 5mL/min。收集洗脫峰，進(jìn)行10%SDS-PAGE，以Enbrel?作為陽(yáng)性對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品。
[0026] 同時(shí)使用TSKgelG3000SWXL(7.8mmX300mm)凝膠色譜柱，流速為 0.5mL/min， 流動(dòng)相為pH7.0、500mmol/LPB+1% (v/v)異丙醇測(cè)定二聚體含量。利用操作軟件 Chromeleon的ExrernalOverlay功能把不同濃度的MG-132處理后純化的TNFR-Fc的出峰 時(shí)間，調(diào)整時(shí)間軸和UV280軸整合到一起，結(jié)果如圖2和表1所示，添加了MG-132,目的蛋白 TNFR-Fc的二聚體含量增高，二聚體為目的產(chǎn)物。
[0027] 表1TNFR-Fc的二聚體含量統(tǒng)計(jì)
【主權(quán)項(xiàng)】
1. MG-132在CHO工程細(xì)胞表達(dá)外源蛋白中的應(yīng)用，其特征在于：所述的CHO工程細(xì)胞 是含有外源蛋白表達(dá)基因的CHO細(xì)胞。
2. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的MG-132在CHO工程細(xì)胞表達(dá)外源蛋白中的應(yīng)用，其特征在于 包括如下步驟：在CHO工程細(xì)胞進(jìn)入穩(wěn)定生長(zhǎng)期時(shí)加入MG-132。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的MG-132在CHO工程細(xì)胞表達(dá)外源蛋白中的應(yīng)用：所述的CHO 工程細(xì)胞為轉(zhuǎn)編碼TNFR-Fc融合蛋白的基因的CHO細(xì)胞。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的MG-132在CHO工程細(xì)胞表達(dá)外源蛋白中的應(yīng)用：所述的 TNFR-Fc融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO. 1所示。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的MG-132在CHO工程細(xì)胞表達(dá)外源蛋白中的應(yīng)用：編碼所述 的TNFR-Fc融合蛋白的基因的核苷酸序列如SEQIDNO. 2所示。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的MG-132在CHO工程細(xì)胞表達(dá)外源蛋白中的應(yīng)用，其特征在 于：所述的MG-132的使用濃度范圍40ymol/L~50ymol/L〇
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的MG-132在CHO工程細(xì)胞表達(dá)外源蛋白中的應(yīng)用，其特征在 于：所述的CHO工程細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)所使用的培養(yǎng)基為含3. 5~4. 5mmol/L谷氨酰胺，0. 08~ 0. 12mmol/L次黃嘌呤和0. 015~0. 020mmol/L胸腺嘧啶的CHO細(xì)胞培養(yǎng)基。
【專利摘要】本發(fā)明公開了MG-132在CHO工程細(xì)胞表達(dá)外源蛋白中的應(yīng)用。在含有外源蛋白表達(dá)基因的CHO細(xì)胞，即CHO工程細(xì)胞表達(dá)外源蛋白時(shí)加入MG-132，能提高外源蛋白的表達(dá)量。本發(fā)明提供了MG-132的一種新用途，也提供了一種提高CHO工程細(xì)胞外源蛋白表達(dá)量的方法。
【IPC分類】C12P21-00, C12P21-02
【公開號(hào)】CN104818309
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510208876
【發(fā)明人】熊盛, 溫家明, 謝秋玲, 錢垂文, 鄒純彬
【申請(qǐng)人】暨南大學(xué)
【公開日】2015年8月5日
【申請(qǐng)日】2015年4月28日