抗EGFRvIII嵌合抗原受體、編碼基因、重組表達載體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種抗EGFRvIII嵌合抗原受體、編碼基因、重組表達載體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。該抗EGFRvIII嵌合抗原受體包括依次串聯(lián)的CD8 leader嵌合受體信號肽、EGFRvIII單鏈抗體輕鏈VL、Optimal Linker C、EGFRvIII單鏈抗體輕重鏈VH、CD8 Hinge嵌合受體鉸鏈、CD8 Transmembrane嵌合受體跨膜區(qū)、CD137嵌合受體共刺激因子，以及TCR嵌合受體T細胞激活域。此外，還公開了該抗EGFRvIII嵌合抗原受體的編碼基因、重組表達載體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。本發(fā)明能顯著提高細胞因子的分泌、CAR?T細胞的體外殺傷作用，且臨床治療效果突出。
【專利說明】
抗EGFRv I I I嵌合抗原受體、編碼基因、重組表達載體及其構(gòu)建 方法和應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于腫瘤免疫治療技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種抗EGFRvIII嵌合抗原受體、編 碼基因、重組表達載體(尤其是一種基于復(fù)制缺陷性重組慢病毒的CAR-T轉(zhuǎn)基因載體)及其 構(gòu)建方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 腫瘤免疫治療的理論基礎(chǔ)是免疫系統(tǒng)具有識別腫瘤相關(guān)抗原、調(diào)控機體攻擊腫瘤 細胞(高度特異性的細胞溶解)的能力。這個生物過程十分復(fù)雜，目前仍處于研究之中。上世 紀90年代，多個科研小組已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了腫瘤抗原(tymor antigens)，T淋巴細胞可以通過主要 組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex，MHC)依賴性方式識別這些腫瘤 抗原。
[0003] 腫瘤免疫治療通常分為兩類，非特異性免疫和特異性免疫。非特異性免疫治療主 要包括白細胞介素 -2( interleykin_2，IL-2)，干擾素 a( interf erona，IFN-α)，腫瘤壞死因 子(tymor necrosis factor，TNF-a)，卡介苗等細胞因子和毒素，過繼性細胞免疫治療等。 特異性免疫治療主要是腫瘤疫苗。
[0004] 1.1腫瘤非特異性免疫治療
[0005] 非特異性免疫應(yīng)答是與生倶來的，它的形成并不需要抗原刺激，能廣泛地針對多 種抗原，是免疫應(yīng)答的基礎(chǔ)，但特異性不強，對某種特定抗原物質(zhì)往往不能產(chǎn)生足夠強度的 反應(yīng)非特異性的免疫治療。在進入臨床試驗的多種細胞因子中，白細胞介素-2和干擾素應(yīng) 用最為廣泛[Rosenberg S A,Lotze Μ Τ,ΜμμΙ L Μ,et al .A progressreport on the treatment of 157patients with advanced cancerusing lymphokine-activated killer cells and interleukin-2orhigh_dose interleukin-2alone[J].N Engl J Med， 1987,316(15):889-897.]〇
[0006] 1.2腫瘤單克隆抗體的免疫治療
[0007] 近20多年來單克隆抗體已在腫瘤治療領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用?？鼓[瘤單抗藥物一般包 括兩類:一是抗腫瘤單抗，二是抗腫瘤單抗偶聯(lián)物，或稱免疫偶聯(lián)物。免疫偶聯(lián)物分子由單 抗與"彈頭"藥物兩部分組成，"彈頭"主要包括放射性核素、藥物和毒素，與單抗連接后分別 構(gòu)成放射免疫偶聯(lián)物、化學(xué)免疫偶聯(lián)物和免疫毒素。在1997年11月和1998年10月美國FDA分 別通過了用于臨床腫瘤治療的兩個單抗一 Rityximab(rityxan)和Trastyzymab (herceptin)[Dillman R 0. Magic bullets at lastIFinally-approval of amonoclonal antibody for the treatment of cancer[J].CancerBiother Radiopharm, 1997，12:223 - 225.]。目前認為單抗的作用機制有阻斷作用、信號傳導(dǎo)作用以及靶向作用 等三種作用機制，沒有直接的殺傷作用。另外還存在藥理學(xué)方面的問題，主要是到達腫瘤的 藥量不足。由于偶聯(lián)物是異體蛋白，會被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)攝取，有相當(dāng)數(shù)量將積聚于肝、脾和 骨髓。偶聯(lián)物是大分子物質(zhì)，通過毛細血管內(nèi)皮層及穿透腫瘤細胞外間隙均受到限制。
[0008] 1.3腫瘤的過繼免疫治療
[0009] 腫瘤的過繼免疫治療是指將體外激活的自體或異體免疫效應(yīng)細胞輸注給患者，以 殺傷患者體內(nèi)的腫瘤細胞。腫瘤過繼性免疫治療中的一個關(guān)鍵問題是尋找合適的腫瘤殺傷 細胞。自上世紀80年代以來，包括LAK、細胞因誘導(dǎo)的殺傷細胞(cytokine-indycedki 1 lers， CIK)、TIL等細胞已先后應(yīng)用于臨床，但由于存在著擴增倍速較低、細胞來源困難、細胞毒力 不高等諸多問題，在臨床應(yīng)用上受到限制。如何提高T細胞的腫瘤抗原特異性具有重要的臨 床意義。T細胞對腫瘤抗原的識別主要是通過T細胞受體(T cell receptor，TCR)識別腫瘤 細胞表面的人類白細胞抗原(hyman leykocyte antigen，HLA)-肽復(fù)合物，因此，T細胞對腫 瘤抗原識別的特異性取決于T細胞表面的TCR。利用分子生物學(xué)的手段克隆腫瘤特異性T細 胞的TCR，并通過構(gòu)建含TCR的病毒載體，把TCR轉(zhuǎn)入正常的T細胞中，使這些T細胞因攜帶腫 瘤特異性而成為特異性腫瘤殺傷細胞[Johnson L A，Morgan R A，Dydley M E，et al .Gene therapywith human and mouse T-cell receptors mediates cancerregression and targets normal tissues expressing cognate antigen[J]·Blood，2009，114(3): 535 - 546.]〇
[0010] 1.4腫瘤疫苗治療
[0011] 腫瘤疫苗治療是通過給患者體內(nèi)導(dǎo)入腫瘤抗原來激發(fā)患者的特異性抗腫瘤免疫 反應(yīng)。由于疫苗治療具有特異性、在體內(nèi)免疫效應(yīng)維持時間長等優(yōu)點，目前已成為研究熱 點。近年來多肽疫苗、核酸疫苗、全蛋白疫苗、抗獨特性抗體疫苗、重組病毒疫苗、細菌疫苗、 基因修飾的腫瘤細胞疫苗、樹突狀細胞(dendriti CCells，DC)疫苗等得到廣泛研究和應(yīng)用 [Robbins P F,Morgan R A,Feldman S A，et al.Tymor regressionin patients with metastatic synovial cell sarcoma andmelanomaysing genetically engineered lymphocytes reactivewith NY-ES0_1[J].J Clin Oncol，2011，29(7):917 -924·]。腫瘤 疫苗治療的大規(guī)模應(yīng)用還有三個方面的問題亟待解決。首先，腫瘤相關(guān)抗原，每個腫瘤、每 個亞型、每個腫瘤分期，這些相對抗原表達是不一樣的，所以選準抗原，選準病人人群是致 關(guān)重要的。第二，如何達到腫瘤抗原在樹突狀細胞中髙效吸收與表達?抗原被樹突狀細胞吸 收是以表面受體為介導(dǎo)的。樹突狀細胞有十幾個受體，如何根據(jù)特定的抗原選擇相應(yīng)的受 體?第三，針對樹突狀細胞分化成熟的調(diào)控。樹突狀細胞的分化成熟是一個非常復(fù)雜的過 程，它既可走向激活T細胞也可以走向抑制T細胞。[靶向DC細胞的治療型腫瘤疫苗：亮點與 挑戰(zhàn)并存。
[0012] http://www.biodiscover.com/news/research/115794.html]
[0013] 1.5腫瘤 CAR-T 治療
[0014] CAR-T，全稱是Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immynotherapy，嵌合抗原受 體T細胞免疫療法，結(jié)構(gòu)如圖 1 所不[Eleanor J.Cheadle，et al.CAR T cells:driving the road fromthe laboratory to the clinic.Immynological Reviews 2014.Vol.257:91-106]〇
[0015] 第一代CAR介導(dǎo)的T細胞激活是通過⑶3z鏈或FceRIg上的酪氨酸激活基序完成的。 CD3z鏈能夠提供T細胞激活、裂解靶細胞、調(diào)節(jié)IL-2分泌以及體內(nèi)發(fā)揮抗腫瘤活性所需的信 號。但第一代CAR改造 T細胞的抗腫瘤活性在體內(nèi)受到了限制，T細胞增殖減少最終導(dǎo)致T細 胞的凋亡。
[0016] 第二代CAR在胞內(nèi)增加了一個新的共刺激信號，實驗證明，這使得原有的使源自 TCR/CD3復(fù)合體的"信號Γ擴大，許多研究都表明，搭載了 "信號2"的第二代CAR與第一代CAR 相比，抗原特異性不變，T細胞增殖、細胞因子分泌增加，抗細胞凋亡蛋白分泌增加，細胞死 亡延遲。常用的共刺激分子為⑶28,但之后有研究將⑶28用⑶137(4-1BB)進行替換，除此之 外，一種使用NK細胞受體CD244的思路也被提出來。雖然不同的第二代CAR究竟孰優(yōu)孰劣，不 同的研究者用不同的腫瘤在體內(nèi)和體外的研究中得到的結(jié)果不盡相同。[深度完整版:CAR-Τ'的現(xiàn)狀和未來 ·生物谷 · 2015-051-15]
[0017] 為了進一步改良CAR的設(shè)計，許多研究組開始著眼于發(fā)展第三代CAR，不僅包括"信 號1"、"信號2"，還包括了額外的共刺激信號。不同研究者們用不同的靶點和共刺激信號開 展的研究所得到的第二代CAR和第三代CAR的比較結(jié)果存在一定的差異性。一些研究報道表 達第三代CAR的重組T細胞在抗腫瘤活性、存活周期及細胞因子釋放方面均顯著提高； Wilkie等的研究結(jié)果顯示靶向MMC1的第二代CAR與第三代CAR重組T細胞在抗腫瘤細胞毒 性方面并無明顯差異，雖然表達第三代CAR的T細胞能夠分泌更大量的IFN-γ (Wilkie S， Picco G,Foster J,et al.Retargeting of hyman T cells to tymorassociated MMC1: the evolution of a chimeric antigen receptor.J Tmmunol 2008;180:4901-4909·)。 值得注意的是，上述區(qū)別僅僅是體外實驗中獲得的結(jié)論，目前尚未在體內(nèi)比較第二代和第 三代CAR的報道。
[0018]這幾代CAR之間的差異可能不止來自于信號傳導(dǎo)域，胞外的抗原結(jié)合域(scFv)、重 組T細胞的轉(zhuǎn)染方法(慢病毒VS逆轉(zhuǎn)錄病毒）、重組T細胞的回輸方式(靜脈回輸VS腹膜VS瘤 體)等均可能影響CAR-T細胞的最終抗腫瘤效果。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0019] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了一種抗EGFRvIII嵌合抗原受體、 編碼基因、重組表達載體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。
[0020] 本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)：
[0021]本發(fā)明的第一目的在于提供一種抗EGFRvIII嵌合抗原受體(二代CAR)，包括依次 串聯(lián)的如SEQIDN0.15所示的CD81eader嵌合受體信號肽、如SEQIDN0.16所示的 EGFRvIII單鏈抗體輕鏈VL、如SEQ ID N0.19所示的Optimal Linker C、如SEQ ID N0.20所 示的EGFRvIII單鏈抗體重鏈VH、如SEQIDN0.21所示的CD8Hinge嵌合受體鉸鏈、如SEQID N0.22所示的CD8Transmembrane嵌合受體跨膜區(qū)、如SEQIDN0.23所示的CD137嵌合受體共 刺激因子，以及如SEQ ID NO. 24所示的TCR嵌合受體T細胞激活域。
[0022]進一步的，所述嵌合抗原受體的氨基酸序列如SEQ ID Ν0.50所示。
[0023] 一種抗EGFRvIII嵌合抗原受體(三代CAR)，包括依次串聯(lián)的如SEQ ID NO. 15所示 的CD81eader嵌合受體信號肽、如SEQ ID NO. 16所示的EGFRvIII單鏈抗體輕鏈VL、如SEQ ID NO. 19所示的Optimal Linker C、如SEQ ID NO. 20所示的EGFRvIII單鏈抗體重鏈VH、如SEQ IDN0.21所示的CD8Hinge嵌合受體鉸鏈、如SEQIDN0.22所示的CD8Transmembrane嵌合受 體跨膜區(qū)、如SEQ ID NO.25所示的⑶28嵌合受體共刺激因子、如SEQ ID NO.23所示的⑶137 嵌合受體共刺激因子、以及如SEQ ID NO.24所示的TCR嵌合受體T細胞激活域。
[0024]進一步的，所述嵌合抗原受體的氨基酸序列如SEQ ID N0.51所示。
[0025]本發(fā)明的第二目的在于提供一種編碼上述抗EGFRvIII嵌合抗原受體的基因。
[0026] 進一步的，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.52(二代CAR)或SEQ ID N0.53(三 代CAR)所示。
[0027] 本發(fā)明的第三目的在于提供含有上述基因的重組表達載體。
[0028] 進一步的，所述重組表達載體為慢病毒表達載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒表達載體、腺病毒表 達載體、腺相關(guān)病毒表達載體或質(zhì)粒。
[0029] 進一步的，所述的慢病毒表達載體包含上述抗EGFRvIII嵌合抗原受體的基因。 [0030]進一步的，所述的慢病毒表達載體包括：用于質(zhì)粒復(fù)制的原核復(fù)制子pUC Ori序 列，如SEQ ID NO. 2所示；用于目的菌株大量擴增的含氨芐青霉素抗性基因 AmpR序列，如SEQ ID NO. 1所示；用于增強真核細胞內(nèi)的復(fù)制的病毒復(fù)制子SV400ri序列，如SEQ ID NO. 3所 示；用于慢病毒包裝的慢病毒包裝順式元件；用于真核細胞表達綠色熒光的ZsGreenl綠色 熒光蛋白，如SEQ ID N0.11所示；用于共同轉(zhuǎn)錄表達蛋白質(zhì)的IRES核糖體結(jié)合序列，如SEQ ID N0.12所示；用于嵌合抗原受體基因的真核轉(zhuǎn)錄的人EFla啟動子，如SEQ ID N0.14所示； 用于組成集識別、傳遞、啟動于一體的二代CAR或三代CAR的嵌合抗原受體的編碼基因，如 SEQ ID N0.52或SEQ ID N0.53所示；用于增強轉(zhuǎn)基因的表達效率的eWPRE增強型土撥鼠乙 肝病毒轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件，如SEQ ID N0.13所示。
[0031] 進一步的，所述慢病毒包裝順式元件采用第二代慢病毒載體包括:如SEQ ID NO.5 所不的慢病毒5terminal LTR、如SEQ ID N0.6所不的慢病毒3terminal Self-Inactivating LTR、如SEQ ID Ν0·7所示的Gag順式元件、如SEQ ID Ν0·8所示的RRE順式元 件、如SEQ ID NO.9所示的env順式元件、如SEQ ID NO. 10所示的cPPT順式元件。
[0032] 進一步的，所述慢病毒包裝順式元件采用第三代慢病毒載體包括:如SEQ ID NO. 5 所不的慢病毒5terminal LTR、如SEQ ID N0.6所不的慢病毒3terminal Self-Inactivating LTR、如SEQ ID Ν0·7所示的Gag順式元件、如SEQ ID Ν0·8所示的RRE順式元 件、如SEQ ID NO.9所示的env順式元件、如SEQ ID NO. 10所示的cPPT順式元件所述慢病毒 包裝順式元件，以及如SEQ ID NO.4所示的RSV啟動子。
[0033] 進一步的，所述eWPRE增強型土撥鼠乙肝病毒轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件有6個核苷酸的增強 突變，具體為：g.396G>A、g.397C>T、g.398T>C、g.399G>A、g.400A>T、g.411A>T。
[0034] 本發(fā)明的第四目的在于提供一種上述慢病毒表達載體的構(gòu)建方法，包括以下步 驟：
[0035] (1)將含氨芐青霉素抗性基因 AmpR序列（如SEQ ID N0.1所示）、原核復(fù)制子pUC 〇ri序列（如SEQ ID NO.2所示）、病毒復(fù)制子SV400ri序列（如SEQ ID NO.3所示）、用于慢病 毒包裝的慢病毒包裝順式元件、ZsGreenl綠色熒光蛋白（如SEQ ID勵.11所示）、11^3核糖 體結(jié)合序列（如SEQ ID N0.12所示）、eWPRE增強型土撥鼠乙肝病毒轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件（如SEQ ID NO. 13所示)存儲于慢病毒骨架質(zhì)粒上；
[0036] (2)將人EFla啟動子（如SEQ ID N0.14所示）、用于組成集識別、傳遞、啟動于一體 的二代CAR或三代CAR的嵌合抗原受體組合成二代CAR或三代CAR設(shè)計方案，經(jīng)過酶切、連接、 重組反應(yīng)克隆至慢病毒骨架質(zhì)粒中，得到二代CAR或三代CAR設(shè)計的重組慢病毒質(zhì)粒；
[0037] (3)將得到的重組慢病毒質(zhì)粒與慢病毒包裝質(zhì)粒pPac-GP、pPac_R以及膜蛋白質(zhì)粒 pEnv-G共同轉(zhuǎn)染HEK293T/17細胞，在HEK293T/17細胞中進行基因轉(zhuǎn)錄表達后，包裝成功重 組慢病毒載體會釋放到細胞培養(yǎng)上清中，收集包含的重組慢病毒載體的上清液；
[0038] (4)將得到的重組慢病毒上清采用抽濾、吸附、洗脫的離子交換方式進行純化，分 別得到重組慢病毒載體。
[0039] 進一步的，步驟（1)中，所述慢病毒包裝順式元件采用第二代慢病毒載體包括:如 SEQIDN0·5所示的慢病毒5terminalLTR、如SEQIDN0·6所示的慢病毒3terminalSelf-InactivatingLTR、如SEQIDN0·7所示的Gag順式元件、如SEQIDN0·8所示的RRE順式元 件、如SEQIDN0.9所示的env順式元件、如SEQIDN0.10所示的cPPT順式元件 ;所述慢病毒 包裝順式元件采用第三代慢病毒載體包括:如SEQIDN0.5所示的慢病毒5terminalLTR、 如SEQIDN0·6所不的慢病毒3terminalSelf-InactivatingLTR、如SEQIDN0·7所不的 Gag順式元件、如SEQIDN0.8所示的RRE順式元件、如SEQIDN0.9所示的env順式元件、如 SEQ ID N0.10所示的cPPT順式元件所述慢病毒包裝順式元件，以及如SEQ ID N0.4所示的 RSV啟動子。
[0040] 進一步的，步驟(2)中，所述用于組成集識別、傳遞、啟動于一體的二代CAR的嵌合 抗原受體包括:如SEQIDN0.15所示的CD81eader嵌合受體信號肽、如SEQIDN0.16所示的 EGFRvIII單鏈抗體輕鏈VL、如SEQIDN0.19所示的0ptimalLinkerC、如SEQIDN0.20所 示的EGFRvIII單鏈抗體重鏈VH、如SEQIDN0.21所示的CD8Hinge嵌合受體鉸鏈、如SEQID N0.22所示的CD8Transmembrane嵌合受體跨膜區(qū)、如SEQIDN0.23所示的CD137嵌合受體共 刺激因子、如SEQ ID N0.24所示的TCR嵌合受體T細胞激活域;所述用于組成集識別、傳遞、 啟動于一體的三代CAR的嵌合抗原受體包括:如SEQ ID N0.15所示的⑶81eader嵌合受體信 號肽、如SEQIDN0.16所示的EGFRvIII單鏈抗體輕鏈VL、如SEQIDN0.19所示的0ptimal LinkerC、如SEQIDN0·20所示的EGFRvIII單鏈抗體重鏈VH、如SEQIDN0·21所示的 CD8Hinge嵌合受體鉸鏈、如SEQ ID N0.22所示的CD8Transmembrane嵌合受體跨膜區(qū)、如SEQ ID N0.25所示的⑶28嵌合受體共刺激因子、如SEQ ID N0.23所示的⑶137嵌合受體共刺激 因子、以及如SEQ ID N0.24所示的TCR嵌合受體T細胞激活域。
[0041]進一步的，步驟（1)中，所述eWPRE增強型土撥鼠乙肝病毒轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件有6個核 苷酸的增強突變，具體為:g.396G>A、g.397C>T、g.398T>C、g.399G>A、g.400A>T、g.411A>T。
[0042] 進一步的，步驟(2)中，由人EFla啟動子啟動整個CAR基因表達;CD81eader嵌合受 體信號肽位于CAR編碼序列的N端，用于引導(dǎo)CAR蛋白定位于細胞膜;EGFRvII I單鏈抗體輕鏈 VL、Optimal Linker C、EGFRvIII單鏈抗體重鏈VH組合成scfv區(qū)域，用于識別EGFRvIII抗 原;CD8Hinge嵌合受體鉸鏈用于將scfv錨定于細胞膜外側(cè);CD8Transmembrane嵌合受體跨 膜區(qū)用于將整個嵌合受體固定于細胞膜上;CD137嵌合受體共刺激因子用于刺激T細胞增殖 和細胞因子分泌;TCR嵌合受體T細胞激活域用于激活下游信號通路的表達；當(dāng)scfv區(qū)域與 EGFRvIII抗原結(jié)合時，信號通過嵌合受體傳遞至細胞內(nèi)，從而產(chǎn)生包括T細胞增殖、細胞因 子分泌增加、抗細胞凋亡蛋白分泌增加、細胞死亡延遲、裂解靶細胞的一系列生物學(xué)效應(yīng)。 [00 43]進一步的，步驟(4)中，所述慢病毒載體有帶焚光標(biāo)簽zsGreenl的版本和不帶焚光 標(biāo)簽zsGreenl版本，帶熒光標(biāo)簽的版本用于體外實驗，不帶熒光標(biāo)簽的版本用于臨床實驗。 [0044] 進一步的，步驟(4)中，所述抽濾步驟控制上清體積在200ml~2000ml，真空度控制 在-0.5MPA~-0.9MPA，防止由于堵孔帶來的載體損失;所述吸附步驟控制溶液的PH值在6~ 8，防止PH的變化導(dǎo)致載體失活;所述洗脫步驟控制洗脫液的離子強度在0.5M~1.0M，防止 離子強度的變化導(dǎo)致洗脫不完全或者載體失活。
[0045] 本發(fā)明所采用的表達載體包括原核復(fù)制子(pUC ori)用于質(zhì)粒復(fù)制；原核篩選標(biāo) 記(AmpR)用于目的菌株大量擴增;病毒復(fù)制子(SV400ri)用于增強真核細胞內(nèi)的復(fù)制;慢病 毒包裝順式元件（RSV、5terminal LTR、3terminal Self-Inactivating LTR、Gag、RRE、env、 CPPT)用于慢病毒包裝;真核熒光標(biāo)簽蛋白（ZsGreenl)用于真核細胞表達綠色熒光;共表達 元件（IRES)用于共同轉(zhuǎn)錄表達蛋白質(zhì)；真核啟動子(EFla)用于嵌合抗原受體基因的真核轉(zhuǎn) 錄；嵌合抗原受體（CD81eader、EGFRvIII VL、Common Linker A(SEQ ID NO. 17)/Common Linker B(SEQ ID NO.18)/0ptimal Linker C(SEQ ID NO.19)、EGFRvIII VH、CD8Hinge、 CD8Transmembrane、CD137、TCR)用于組成集識別、傳遞、啟動于一體的二代和三代CAR;轉(zhuǎn)錄 后調(diào)控元件(eWPRE)用于增強轉(zhuǎn)基因的表達效率。
[0046] 本發(fā)明的第五目的在于提供一種CAR-T細胞，所述的CAR-T細胞是由上述抗 EGFRv III嵌合抗原受體修飾的T淋巴細胞。
[0047]本發(fā)明的再一目的在于提供上述CAR-T細胞在制備惡性膠質(zhì)瘤治療藥物中的應(yīng) 用。
[0048]本發(fā)明涉及含肽的醫(yī)藥配置品，具體涉及：
[0049] 一、含氨芐青霉素抗性基因 AmpR序列、原核復(fù)制子pMC Ori序列，、病毒復(fù)制子 SV400ri序列、RSV啟動子、人EFlα啟動子、慢病毒5terminalLTR、慢病毒3terminalSelf-Inactivating LTR、Gag順式元件、RRE順式元件、env順式元件、cPPT順式元件、IRES核糖體 結(jié)合序列、ZsGreenl綠色熒光蛋白、WPRE 土撥鼠乙肝病毒轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件的重組慢病毒載 體骨架，這種重組慢病毒載體骨架可以搭載不同的治療性基因并廣泛的用于過繼性細胞治 療領(lǐng)域。
[0050] 二、重組慢病毒載體骨架、CD81eader嵌合受體信號肽、EGFRvIII單鏈抗體輕鏈VL、 單鏈抗體鉸鏈LinkerA、單鏈抗體鉸鏈Linker B、單鏈抗體鉸鏈Linker C、EGFRvIII單鏈抗 體重鏈VH、CD8Hinge嵌合受體鉸鏈、CD8Transmembrane嵌合受體跨膜區(qū)、CD28嵌合受體共刺 激因子、CD137嵌合受體共刺激因子、TCR嵌合受體T細胞激活域構(gòu)建形成重組慢病毒載體， 該方法得到的重組慢病毒載體可以實現(xiàn)在人T淋巴細胞上表達EGFRvIII嵌合抗原受體，弓丨 導(dǎo)并激活T淋巴細胞對EGFRvIII陽性細胞的殺傷作用，在臨床上用于治療惡性膠質(zhì)瘤。
[0051 ]本發(fā)明所采用的針對EGFRvIII的CAR-T技術(shù)，是一種綜合了腫瘤單克隆抗體的免 疫治療和腫瘤的過繼免疫治療優(yōu)點的靶向治療新技術(shù)。EGFRvIII是表皮生長因子的突變體 三，是人類腫瘤中最常見的EGFR突變體。由于閱讀框?qū)蛉笔Я送怙@子2到外顯子7,導(dǎo)致產(chǎn) 生了一種外顯子1和外顯子8毗鄰的轉(zhuǎn)錄本突變體。這種新的外顯子排列方式導(dǎo)致EGFR的胞 外區(qū)段形成了一種新的腫瘤特異性的抗原表位。大約30%的惡性膠質(zhì)瘤患者被檢測出表達 EGFRvI II，這恰好可以作為CAR-T治療實體腫瘤的分子革E1標(biāo)。（Laura A.Johnson，et al.Rational development and characterization of humanized anti-EGFR variant III chimeric antigen receptor T cells for glioblastoma.Sci Trans 1 MecL2015February 18;7(275):275ra22.)，因此，最近幾年在惡性膠質(zhì)瘤（glioblastoma) 的治療上有著顯著的療效，被認為是最有前景的惡性膠質(zhì)瘤的治療方式之一。
[0052]嵌合抗原受體(CAR)是CAR-T的核心部件（圖1所示），賦予T淋巴細胞HLA非依賴的 方式識別腫瘤抗原的能力，這使得經(jīng)過CAR改造的T細胞相較于天然T細胞表面受體TCR能夠 識別更廣泛的目標(biāo)。CAR的基礎(chǔ)設(shè)計中包括一個腫瘤相關(guān)抗原（tumor-associated antigen，TAA)結(jié)合區(qū)（通常來源于單克隆抗體抗原結(jié)合區(qū)域的scFV段），一個胞外鉸鏈區(qū)， 一個跨膜區(qū)和一個胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)區(qū)。scFV段的設(shè)計對于CAR的特異性、有效性以及基因改造 T細胞自身的安全性來是關(guān)鍵的決定因素。
[0053]經(jīng)臨床試驗驗證，本發(fā)明載體應(yīng)用于臨床治療B淋巴細胞白血病、B淋巴瘤、以及多 發(fā)性骨髓瘤，在患者體內(nèi)實現(xiàn)了腫瘤細胞的完全清除，因此本發(fā)明所述的載體在CART治療 領(lǐng)域擁有廣闊的應(yīng)用前景。
[0054]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：
[0055] 本發(fā)明采用的scFV段的linker設(shè)計，是使用世翱公司的Linkers pool，經(jīng)過蛋白 質(zhì)結(jié)構(gòu)生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(https :// www.predictprotein.org/)的分析，通過對蛋白質(zhì)二 級結(jié)構(gòu)、溶劑可接觸性、蛋白質(zhì)柔韌性、二硫鍵橋、結(jié)合位點等蛋白質(zhì)特性的比較，優(yōu)選得 出。通過體外細胞因子分泌檢測試驗以及殺傷效率試驗證明，與國外的設(shè)計相比，能夠顯著 提高CAR-T細胞的體外殺傷作用。并且，在臨床治療的效果上也比國外臨床實驗的效果好。 該scFV段的linker設(shè)計，同樣可以應(yīng)用于第三代CAR設(shè)計方案。第三代CAR設(shè)計與第二代設(shè) 計相比，增加了CD28嵌合受體共刺激因子(SEQ ID N0.25)，會有更強的信號放大作用。
[0056] 本發(fā)明所采用的慢病毒載體柱純化系統(tǒng)，系本
【申請人】開發(fā)出的慢病毒規(guī)?；a(chǎn) 工藝。常用的超速離心法或者高速離心法，是利用離心沉降原理分離慢病毒顆粒，不可避免 的會殘留很多沉降系數(shù)相近的雜質(zhì)，對后續(xù)實驗帶來不利影響。并且，裝管過程復(fù)雜、操作 繁瑣、多次轉(zhuǎn)換容器帶來更多的污染機會。而本
【申請人】開發(fā)的慢病毒載體柱純化工藝為半 自動化操作，全部過程在百級實驗區(qū)域完成，避免人工操作的繁瑣和污染幾率，所回收的慢 病毒載體在內(nèi)毒素、支原體等指標(biāo)上完全達到臨床標(biāo)準。后續(xù)可跟進開發(fā)全自動純化儀。
[0057] 本發(fā)明所采用CAR設(shè)計方案也可以應(yīng)用于第二代慢病毒載體結(jié)構(gòu)上。第二代和第 三代慢病毒載體在結(jié)構(gòu)上的區(qū)別（如圖2B所示），主要是第三代慢病毒載體把第二代載體5 ' LTR的U3區(qū)域替換為RSV啟動子，這樣就消除了U3轉(zhuǎn)錄時對Tat蛋白的依賴，既可以在慢病毒 的結(jié)構(gòu)基因里去除Tat序列，也提高了慢病毒基因組轉(zhuǎn)錄水平和轉(zhuǎn)錄持續(xù)性。第二代和第三 代慢病毒載體主要是基因組轉(zhuǎn)錄方式的區(qū)別，因此本發(fā)明所采用CAR設(shè)計方案可以應(yīng)用于 這兩代慢病毒載體。
[0058]本發(fā)明采用的第三代慢病毒骨架質(zhì)粒pLenti_3G basic，與賓州大學(xué)Carl H.June 等人（Porter DL , Levine BL , Ka 1 o s M , BaggA , June CH . Chimeri c antigen receptormodifiedT cells in chronic lymphoid leukemia.N Engl J Med 2011；365: 725-33.)所采用的第三代慢病毒載體相比，去除了噬菌體Π 復(fù)制起點，采用真核病毒SV40 復(fù)制子，增加了目的基因在真核細胞內(nèi)的拷貝數(shù)，增強了真核表達效果。
[0059] 本發(fā)明采用的的第三代慢病毒骨架質(zhì)粒pLenti-3G basic，采用enhancedWPRE元 件，與賓州大學(xué) Carl H.June 等人（Porter DL, Levine BL，Kalos Μ, BaggA, June CH.Chimeric antigen receptormodif iedT cells in chronic lymphoid leukemia.N Engl J Med 2011;365:725-33.)所采用的WPRE元件相比，有6個核苷酸的增強突變(g.396G >A、g.397C>T、g.398T>C、g.399G>A、g.400A>T、g.411A>T)，能夠增強初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的多聚腺 苷化，增加細胞內(nèi)mRNA的含量，增強轉(zhuǎn)基因的表達效率。
[0060]本發(fā)明采用的Lentival包裝系統(tǒng)是無輔助病毒的四質(zhì)粒包裝系統(tǒng)，通過四種質(zhì)粒 共同轉(zhuǎn)染至HEK293T/17細胞中，產(chǎn)生重組慢病毒載體。重組后的慢病毒載體是復(fù)制缺陷型 載體，能將外源片段整合入宿主基因，一次性使用，無法復(fù)制和增殖，安全性有很大提高。
[0061]本發(fā)明采用的慢病毒載體有帶熒光標(biāo)簽zsGreenl的版本和不帶熒光標(biāo)簽 zsGreenl版本，帶焚光標(biāo)簽的版本用于體外實驗，不帶焚光標(biāo)簽的版本用于臨床實驗。 [0062]本發(fā)明優(yōu)選采用第三代慢病毒載體（圖2A所示），3'SIN LTR去除了U3區(qū)域，消除了 慢病毒載體自我復(fù)制的可能性，大大提高了安全性;增加了 CPPT和WPRE元件，提高了轉(zhuǎn)導(dǎo)效 率和轉(zhuǎn)基因的表達效率;采用RSV啟動子保證了慢病毒載體包裝時核心RNA的持續(xù)高效轉(zhuǎn) 錄;采用人自身的EFla啟動子，使CAR基因能夠在人體內(nèi)長時間持續(xù)表達。
[0063] 可見，本發(fā)明所述的重組慢病毒載體將給惡性膠質(zhì)瘤的CAR-T治療提供可靠的轉(zhuǎn) 基因保障。
【附圖說明】
[0064] 圖1是本發(fā)明所述的CAR的示意圖，其中，圖1(A)是CAR的基本結(jié)構(gòu)圖，圖1(B)是CAR 的代次改進示意圖；
[0065] 圖2是本發(fā)明所述的慢病毒載體結(jié)構(gòu)示意圖；其中，圖2(A)是本發(fā)明采用的第三代 慢病毒載體結(jié)構(gòu)示意圖，圖2(B)是第二代和第三代慢病毒載體結(jié)構(gòu)比較；
[0066] 圖3是本發(fā)明實施例1中構(gòu)建本發(fā)明所述的重組慢病毒載體的構(gòu)建流程圖，其中， 圖3(A)是慢病毒骨架質(zhì)粒pLenti-3G basic的結(jié)構(gòu)示意圖；圖3(B)是pCAR-EGFRvIII-CLA質(zhì) 粒的結(jié)構(gòu)示意圖；圖3(C)圖是pCAR-EGFRvIII-CLB質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)示意圖；圖3(D)圖是pCAR-EGFRvIII-OLC質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)示意圖；圖3(E)圖是慢病毒包裝質(zhì)粒pPac-GP的結(jié)構(gòu)示意圖；圖3 (F)圖是慢病毒包裝質(zhì)粒pPac-R的結(jié)構(gòu)示意圖；圖3(G)圖是膜蛋白pEnv-G的結(jié)構(gòu)示意圖； [0067]圖4是本發(fā)明實施例1中重組慢病毒質(zhì)粒pCAR-EGFRvIII-CLA的酶切預(yù)測及酶切瓊 脂糖凝膠電泳圖；其中，圖4A是重組慢病毒質(zhì)粒pCAR-EGFRvIII-CLA的酶切預(yù)測示意圖，其 中，lanel 是 lkb DNA ladder Marker:條帶從上到下依次為：10kb、8Kb、6kb、5Kb、4kb、 3·5Kb、3Kb、2·5kb、2Kb、1·5kb、1Kb、750bp、500bp、250bp;lane2是pCAR-EGFRvIII-CLA的Pvu 1酶切預(yù)測：條帶從上到下依次為：86166?、8966?、24%?;圖48是重組慢病毒質(zhì)粒？0八1?-EGFRvIII-CLA的酶切瓊脂糖凝膠電泳圖；其中，lanel是lkb DNA ladder Marker的電泳結(jié) 果；lane2是pCAR-EGFRvIII-CLA的Pvu頂每切電泳結(jié)果；
[0068]圖5是本發(fā)明實施例1中重組慢病毒質(zhì)粒pCAR-EGFRvII I-CLB的酶切預(yù)測及酶切 瓊脂糖凝膠電泳圖；其中，圖5A是重組慢病毒質(zhì)粒pCAR-EGFRvIII-CLB的酶切預(yù)測示意圖， 其中，lanel 是 lkb DNA ladder Marker:條帶從上到下依次為：10kb、8Kb、6kb、5Kb、4kb、 3·5Kb、3Kb、2·5kb、2Kb、1·5kb、1Kb、750bp、500bp、250bp;lane2是pCAR-EGFRvIII-CLB的Nco 頂每切預(yù)測：條帶從上到下依次為：58676?、332%?、5656?;圖58是重組慢病毒質(zhì)粒？0八1?-EGFRvIII-CLB的酶切瓊脂糖凝膠電泳圖；其中，lanel是lkb DNA ladder Marker的電泳結(jié) 果；lane2是pCAR-EGFRvIII-CLB的Nco頂每切電泳結(jié)果；
[0069]圖6是本發(fā)明實施例1中重組慢病毒質(zhì)粒pCAR-EGFRvIII-OLC的酶切預(yù)測及酶切瓊 脂糖凝膠電泳圖；其中，圖6A是重組慢病毒質(zhì)粒pCAR-EGFRvIII-OLC的酶切預(yù)測示意圖，其 中，lanel 是 lkb DNA ladder Marker:條帶從上到下依次為：10kb、8Kb、6kb、5Kb、4kb、 3·5Kb、3Kb、2·5kb、2Kb、1·5kb、1Kb、750bp、500bp、250bp;lane2是pCAR-EGFRvIII-0LC的Κρη I酶切預(yù)測:條帶從上到下依次為:8335bp、1426bp;圖6B是重組慢病毒質(zhì)粒pCAR-EGFRvIII-OLC的酶切瓊脂糖凝膠電泳圖，其中，lanel是lkb DNA ladder Marker的電泳結(jié)果；lane2是 pCAR-EGFRvIII-OLC的Κρη頂每切電泳結(jié)果；
[0070] 圖7是本發(fā)明實施例2中離子交換色譜法純化重組慢病毒載體的流程圖；
[0071] 圖8是本發(fā)明實施例2中重組慢病毒載體的不同純化方式的滴度檢測結(jié)果示意圖；
[0072] 圖9是本發(fā)明實施例2中重組慢病毒載體的不同純化方式的支原體檢測結(jié)果示意 圖；其中，lanel為DL2000marker，從上到下條帶條帶從上到下依次為：2kb、lkb、750bp、 500bp、250bp、100bp; lane2為陽性對照；lane3為陰性對照；lane4為PBS; lane5為水；lane6 為裂解液；
[0073] lane7為超速離心純化的慢病毒；lane8為高速離心純化的慢病毒；lane9為離子交 換色譜純化的慢病毒;lanelO為空細胞；
[0074] 圖10是本發(fā)明實施例3中mRNA相對表達量的柱狀圖，RT-QPCR結(jié)果表明CAR在TOMC 細胞內(nèi)高效轉(zhuǎn)錄；
[0075]圖11是本發(fā)明實施例3中CAR蛋白表達量的WB檢測圖，結(jié)果表明CAR蛋白在TOMC細 胞內(nèi)高效表達;其中，圖11A中，lanel為PBMC空細胞，lane2為對照病毒MOCK，lane3為lvCAR-EGFRvIII-CLA，lane4為1vCAR-EGFRvIII-CLB，lane5為1vCAR-EGFRvIII-0LC;圖11B是beta-actin內(nèi)參條帶；
[0076]圖12是本發(fā)明實施例3中LDH檢測不同效靶比條件下的殺傷效率，E為效應(yīng)細胞，T 為靶細胞；
[0077]圖13是本發(fā)明實施例3中qPCR檢測不同效靶比條件下細胞因子表達水平示意圖，Ε 為效應(yīng)細胞，T為靶細胞;其中，圖13A表示a-2的mRNA轉(zhuǎn)錄水平；圖13B表示IFN- γ的mRNA轉(zhuǎn) 錄水平；
[0078]圖14是本發(fā)明實施例3中CAR-EGFRvII I-T細胞靜脈注射顱內(nèi)荷瘤小鼠后，腫瘤體 積和T細胞數(shù)量的變化情況;PBS表示靜脈注射PBS的空白組，UTD表示靜脈注射未轉(zhuǎn)導(dǎo)CAR-EGFRvIII的人T細胞的實驗組，2173表示轉(zhuǎn)導(dǎo)了CAR-EGFRvIII的人T細胞的實驗組；圖14A表 示注射后第11天，不同實驗組顱內(nèi)腫瘤體積的核磁共振結(jié)果；圖14B表示注射后第18天，流 式細胞術(shù)檢測不同組織中CD4+、CD8+細胞的存在情況；
[0079]圖15是本發(fā)明實施例4中連續(xù)3個批次的第二代和第三代重組慢病毒載體的滴度 結(jié)果比較；
[0080] 圖16為本發(fā)明實施例5中LDH檢測不同效靶比條件下的殺傷效率，其中，E為效應(yīng)細 胞，T為靶細胞。
【具體實施方式】
[0081] 以下實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體 條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0082] 實施例1構(gòu)建重組慢病毒載體
[0083] 一、材料
[0084] 1、慢病毒骨架質(zhì)粒pLenti_3G basic，慢病毒包裝質(zhì)粒pPac-GP、pPac_R以及膜蛋 白質(zhì)粒pEnv-G，HEK293T/17細胞、同源重組酶由世翱(上海)生物醫(yī)藥科技有限公司提供；
[0085] 2、引物:根據(jù)引物設(shè)計原則設(shè)計擴增DNA片段和靶位點所需的引物，該引物由上海 生物公司合成，具體為：
[0114] 3、SEQ ID N0.14、SEQ ID N0.15、SEQ ID N0.16、SEQ ID N0.17、SEQ ID N0.18、 SEQ ID N0.19、SEQ ID N0.20、SEQ ID N0.21、SEQ ID N0.22、SEQ ID N0.23、SEQ ID N0.24、SEQ ID N0.25、SEQ ID N0.26、SEQ ID N0.27、SEQ ID N0.28、SEQ ID N0.29、SEQ ID N0.30、SEQ ID N0.31、、SEQ ID N0.32、SEQ ID N0.33、SEQ ID N0.34、SEQ ID N0.35、SEQ ID N0.36、SEQ ID N0.37、SEQ ID N0.38、SEQ ID N0.39、SEQ ID N0.40、SEQ ID N0.41、SEQ ID N0.42、SEQ ID N0.43、SEQ ID N0.44、SEQ ID N0.45、SEQ ID N0.46、SEQ ID N0.47、SEQ ID NO.48、SEQ ID NO.49所示的DNA序列由上海捷瑞生物工程有限公司合成，并以寡核苷酸 干粉或者質(zhì)粒形式保存;SEQ ID NO.52、SEQ ID NO.53由常州基宇生物科技有限公司合成。 [0115] 4、工具酶？丫111川。〇1、1(?111^?31^1、53(3 1、(：13 1、5311、了40嫩連接酶均購自 NEB公司；
[0116] 5、高保真酶PrimeSTAR、RN貝勾自Takara公司；
[0117] 6、0·22μηι-〇·8ym PES濾器購自millipore公司；
[0118] 7、質(zhì)粒抽提試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒均購自MN公司；
[0119] 8、感受態(tài)細胞T0P10購自tiangen公司；
[0120] 9、NaCl、KC1、Na2HP〇4 · 12H20、KH2PO4、Tryp s i η、EDTA、CaCl 2、NaOH、PEG6000 均購自上 海生工；
[0121] 10、0?衍_1^]\^85、01^]\1、、1640、拖？68、購自11^1廿(^611公司 ；
[0122] 11'Biotinylated protein L購自GeneScript公司；
[0123] 12、辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗、DAB工作液均購自北京中杉金橋；
[0124] 13、ECL+plusTM Western blotting system購自Amersham公司；
[0125] 14、DNeasy試劑盒購自上海捷瑞公司；
[0126] 15、淋巴細胞分離液購自深圳達科為公司；
[0127] 16Nphycoerythrin(PE)-conjugated streptavidin貝勾自BD Bioscience公司；
[0128] 17、SA_HRP購自上海翊圣公司；
[0129] 18、支原體檢測試劑盒、內(nèi)毒素 檢測試劑盒、EGFRVIII+K562細胞購自世翱（上海） 公司；
[0130] 19、LDH檢測試劑盒購自promega公司；
[0131] 二、重組慢病毒載體1vCAR-EGFRvIII-CLA、1vCAR-EGFRvIII-CLB、1vCAR-EGFRvII I-0LC的構(gòu)建方法。
[0132] 參見圖3,本發(fā)明所述重組慢病毒載體的構(gòu)建方法如下：
[0133] 1、將人EFla啟動子、CD81eader嵌合受體信號肽、EGFRvIII單鏈抗體輕鏈VL、 Common Linker A、Common Linker B、0ptimal Linker C、EGFRvI11單鏈抗體重鏈VH、 CD8Hinge嵌合受體鉸鏈、CD8Transmembrane嵌合受體跨膜區(qū)、CD137嵌合受體共刺激因子、 TCR嵌合受體T細胞激活域片段克隆至慢病毒骨架質(zhì)粒pLenti-3G basic，分別得到重組慢 病毒質(zhì)粒pCAR-EGFRv III-CLA，pCAR-EGFRv III-CLB，pCAR-EGFRv III -0LC。
[0134] (1)將慢病毒骨架質(zhì)粒pLenti_3G basic使用Cla I和Sal I限制性內(nèi)切酶進行雙 酶切，產(chǎn)物經(jīng)過1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，確認8303bp的片段VI(圖4所示），并割膠回收置于 Eppendorf管內(nèi)，用MN公司的瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收相應(yīng)的片段(見表1)，并測定產(chǎn)物 的純度和濃度；
[0136] 表1瓊脂糖凝膠回收步驟
[0137] (2)用引物EFla-F和EFla-R以合成的SEQ ID勵.14為模板，使用表2中的體系，卩0? 循環(huán)條件為：981€3111丨11，（98°(：1〇86(3,55°(：1586(3,72 1€2111丨11)*35〇7(316,72°(：1〇111丨11。產(chǎn)物經(jīng)過 1.5 %的瓊脂糖凝膠電泳，確認1208bp的片段a，并割膠回收置于Eppendorf管內(nèi)，用MN公司 的瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收相應(yīng)的片段(見表1)，并測定產(chǎn)物的純度和濃度；
[0139] 表2 50μ1 PCR反應(yīng)體系
[0140] (3)用引物CD81eader-F和CD81eader-R以合成的SEQIDN0·15為模板，使用表2中 的體系，PCR 循環(huán)條件為：98°C3min，（98°C10sec，55°C15sec，72°C30sec)*35cycle，72°C 5min。產(chǎn)物經(jīng)過1.5 %的瓊脂糖凝膠電泳，確認10 lbp的片段b，并割膠回收置于Eppendorf管 內(nèi)，用MN公司的瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收相應(yīng)的片段(見表1)，并測定產(chǎn)物的純度和濃 度；
[0141] (4)用引物VL-F和VL-R以合成的SEQ ID勵.16為模板，使用表2中的體系，？0?循環(huán) 條件為：98°C3min，（98。(：1〇86(3,55。(：1586(3,72 1€3〇86(3)*35。7(316,721€5111丨11。產(chǎn)物經(jīng)過 1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，確認336bp的片段c，并割膠回收置于Eppendorf管內(nèi)，用MN公司的 瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收相應(yīng)的片段(見表1)，并測定產(chǎn)物的純度和濃度；
[0142] (5)用引物CLA-VH-F和VH-R以合成的SEQ ID勵.20為模板，使用表2中的體系，卩〇? 循環(huán)條件為：981€3111丨11，（98°(：1〇86(3,55°(：1586(3,72 1€3〇86(3)*35〇7(316,721€5111丨11。產(chǎn)物經(jīng)過 1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，確認424bp的片段d，并割膠回收置于Eppendorf管內(nèi)，用MN公司的 瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收相應(yīng)的片段(見表1)，并測定產(chǎn)物的純度和濃度；
[0143] (6)用引物CLB-VH-F和VH-R以合成的SEQ ID勵.20為模板，使用表2中的體系，卩〇? 循環(huán)條件為：981€3111丨11，（98°(：1〇86(3,55°(：1586(3,72 1€3〇86(3)*35〇7(316,721€5111丨11。產(chǎn)物經(jīng)過 1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，確認430bp的片段e，并割膠回收置于Eppendorf管內(nèi)，用MN公司的 瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收相應(yīng)的片段(見表1)，并測定產(chǎn)物的純度和濃度；
[0144] (7)用引物0LC-VH-F和VH-R以合成的SEQ ID勵.20為模板，使用表2中的體系，卩〇? 循環(huán)條件為：981€3111丨11，（98°(：1〇86(3,55°(：1586(3,72 1€3〇86(3)*35〇7(316,721€5111丨11。產(chǎn)物經(jīng)過 1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，確認421bp的片段f，并割膠回收置于Eppendorf管內(nèi)，用MN公司的 瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收相應(yīng)的片段(見表1)，并測定產(chǎn)物的純度和濃度；
[0145] (8)用引物CD8Hinge-F和CD8Hinge-R以合成的SEQ ID N0.21為模板，使用表2中的 體系，PCR 循環(huán)條件為：98Γ3π?η，（98Γ?〇8θ(：，55Γ?58θ(3,72Γ3〇8 θ(3)*35ε7(3?θ，72Γ5π?η。 產(chǎn)物經(jīng)過1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，確認147bp的片段g，并割膠回收置于Eppendorf管內(nèi)，用 MN公司的瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收相應(yīng)的片段(見表1)，并測定產(chǎn)物的純度和濃度；
[0146] (9)用引物CD8Transmembrane-F和CD8Transmembrane-R以合成的SEQIDN0·22為 模板，使用表 2 中的體系，PCR 循環(huán)條件為：98°C3min，（98°C10sec，55°C15sec，72°C30sec)* 35cy c 1 e，7 2 °C 5min。產(chǎn)物經(jīng)過1.5 %的瓊脂糖凝膠電泳，確認1 OObp的片段h，并割膠回收置 于Eppendorf管內(nèi)，用MN公司的瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收相應(yīng)的片段(見表1)，并測定產(chǎn) 物的純度和濃度；
[0147] (10)用引物CD137-F和CD137-R以合成的SEQIDN0.23為模板，使用表2中的體系， PCR 循環(huán)條件為：981€3111丨11，（98。(：1〇86(3,55。(：1586(3,72 1€3〇86(3)*35。7(316,721€5111丨11。產(chǎn)物 經(jīng)過1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，確認142bp的片段i，并割膠回收置于Eppendorf管內(nèi)，用MN公 司的瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收相應(yīng)的片段(見表1)，并測定產(chǎn)物的純度和濃度；
[0148] (11)用引物TCR-F和TCR-R以合成的SEQ ID ^).24為模板，使用表2中的體系，卩0? 循環(huán)條件為：981€3111丨11，（98°(：1〇86(3,55°(：1586(3,72 1€3〇86(3)*35〇7(316,721€5111丨11。產(chǎn)物經(jīng)過 1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，確認355bp的片段j，并割膠回收置于Eppendorf管內(nèi)，用MN公司的 瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收相應(yīng)的片段(見表1)，并測定產(chǎn)物的純度和濃度；
[0149] (12)將DNA片段b、c、d各ΙμL作為模板，使用表3中的體系，除引物外加入Eppendorf 管內(nèi)，PCR 循環(huán)條件為：981€311^11，（98°(：1〇86(3,60°(：1〇86(3,721€3〇86(3)*6。7(316，加入引物 CDSleader-F/VL-RjgsriOsecJOriOsecJSTMOsec^^^ycleJSrSmin。產(chǎn)物經(jīng)過 1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，確認814bp的片段k，并割膠回收置于Eppendorf管內(nèi)，用MN公司的 瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收相應(yīng)的片段(見表1)，并測定產(chǎn)物的純度和濃度；
[0151] 表3 50μ1重疊 PCR反應(yīng)體系
[0152] (13)將DNA片段b、c、e各ΙμL作為模板，使用表3中的體系，除引物外加入Eppendorf 管內(nèi)，PCR 循環(huán)條件為：981€311^11，（98°(：1〇86(3,60°(：1〇86(3,721€3〇86(3)*6。7(316，加入引物 CDSleader-F/VL-RjgsriOsecJOriOsecJSTMOsec^^^ycleJSrSmin。產(chǎn)物經(jīng)過 1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，確認820bp的片段1，并割膠回收置于Eppendorf管內(nèi)，用MN公司的 瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收相應(yīng)的片段(見表1)，并測定產(chǎn)物的純度和濃度；
[0153] (14)將DNA片段b、c、f各ΙμL作為模板，使用表3中的體系，除引物外加入Eppendorf 管內(nèi)，PCR 循環(huán)條件為：981€311^11，（98°(：1〇86(3,60°(：1〇86(3,721€3〇86(3)*6。7(316，加入引物 CDSleader-F/VL-RjgsriOsecJOriOsecJSTMOsec^^^ycleJSrSmin。產(chǎn)物經(jīng)過 1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，確認81 lbp的片段m，并割膠回收置于Eppendorf管內(nèi)，用MN公司的 瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收相應(yīng)的片段(見表1)，并測定產(chǎn)物的純度和濃度；
[0154] (15 )將D N A片段g、h、i、j各1 μ 1作為模板，使用表3中的體系，除引物外加入 Eppendorf管內(nèi)，PCR循環(huán)條件為：98°C3min，（98°C lOsec，6CTC lOsec，72°C30sec)*6cycle， 加入引物 CDSHinge-F/TCR-R^gsriOsecJOriOsecJST^OsechSAcycleJSrSmin。產(chǎn) 物經(jīng)過1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，確認704bp的片段η，并割膠回收置于Eppendorf管內(nèi)，用MN 公司的瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收相應(yīng)的片段(見表1)，并測定產(chǎn)物的純度和濃度；
[0155] (16)將DNA片段Vl、a、k、n以5μ1總體積且摩爾比1:1:1:1的比例加入Eppendorf管 內(nèi)，加入同源重組酶反應(yīng)液15μ1，混勻后在42°C孵育30分鐘，轉(zhuǎn)移至冰上放置2-3分鐘，將反 應(yīng)液加入50μ1 T0P10中，輕輕旋轉(zhuǎn)以混勻內(nèi)容物，在冰中放置30分鐘，將管放到預(yù)加溫到42 °C的恒溫水浴鍋中熱激90秒，快速將管轉(zhuǎn)移到冰浴中，使細胞冷卻2-3分鐘，每管加900μ1 LB培養(yǎng)液，然后將管轉(zhuǎn)移到37 °C搖床上，溫育1小時使細菌復(fù)蘇，取100μ1的轉(zhuǎn)化菌液涂布于 Amp LB瓊脂平板上，倒置平皿，于恒溫培養(yǎng)箱中37°C培養(yǎng)，16小時。
[0156] 挑取克隆進行菌落PCR鑒定，鑒定正確的克隆即為重組慢病毒質(zhì)粒pCAR-EGFRvIII-CLA，對正確的克隆進行酶切鑒定(見圖4);
[0157] (17)將DNA片段Vl、a、l、n以5μl總體積且摩爾比l:l:l:l的比例加入Eppendorf管 內(nèi)，加入同源重組酶反應(yīng)液15μ1，混勻后在42°C孵育30分鐘，轉(zhuǎn)移至冰上放置2-3分鐘，將反 應(yīng)液加入50μ1 T0P10中，輕輕旋轉(zhuǎn)以混勻內(nèi)容物，在冰中放置30分鐘，將管放到預(yù)加溫到42 °C的恒溫水浴鍋中熱激90秒，快速將管轉(zhuǎn)移到冰浴中，使細胞冷卻2-3分鐘，每管加900μ1 LB培養(yǎng)液，然后將管轉(zhuǎn)移到37 °C搖床上，溫育1小時使細菌復(fù)蘇，取100μ1的轉(zhuǎn)化菌液涂布于 Amp LB瓊脂平板上，倒置平皿，于恒溫培養(yǎng)箱中37°C培養(yǎng)，16小時。
[0158] 挑取克隆進行菌落PCR鑒定，鑒定正確的克隆即為重組慢病毒質(zhì)粒pCAR-EGFRvIII-CLB，對正確的克隆進行酶切鑒定(見圖5);
[0159] (18)將DNA片段Vl、a、m、n以5μ1總體積且摩爾比1:1:1:1的比例加入Eppendorf管 內(nèi)，加入同源重組酶反應(yīng)液15μ1，混勻后在42°C孵育30分鐘，轉(zhuǎn)移至冰上放置2-3分鐘，將反 應(yīng)液加入50μ1 T0P10中，輕輕旋轉(zhuǎn)以混勻內(nèi)容物，在冰中放置30分鐘，將管放到預(yù)加溫到42 °C的恒溫水浴鍋中熱激90秒，快速將管轉(zhuǎn)移到冰浴中，使細胞冷卻2-3分鐘，每管加900μ1 LB培養(yǎng)液，然后將管轉(zhuǎn)移到37 °C搖床上，溫育1小時使細菌復(fù)蘇，取100μ1的轉(zhuǎn)化菌液涂布于 Amp LB瓊脂平板上，倒置平皿，于恒溫培養(yǎng)箱中37°C培養(yǎng)，16小時。挑取克隆進行菌落PCR鑒 定，鑒定正確的克隆即為重組慢病毒質(zhì)粒pCAR-EGFRvIII-OLC，對正確的克隆進行酶切鑒定 (見圖6)。
[0160] 2、重組慢病毒載體 1 vCAR-EGFRv III-CLA、1 vCAR-EGFRv III-CLB、1 vCAR-EGFRv III -0LC的包裝。
[0161] (1)完全培養(yǎng)基:取出預(yù)熱好的新鮮培養(yǎng)基，加入10%FBS+5ml Pen-Srep，上下顛 倒混勻即可；（2)1XPBS溶液:稱量NaCl 8g，KCl 0.2，Na2HP〇4.12H2〇 3.58g，KH2P04 0.24g
[0162] 置于1000ml燒杯中，加入900ml Milli-Q grade超純水溶解，溶解完成后，使用 1000ml量筒定容至1000ml，121°C高溫濕熱滅菌20min;
[0163] (3)0.25%Trypsin溶液：稱量Trypsin 2.5g，EDTA 0.19729g置于 1000ml燒杯中， 加入900mllXPBS溶解，溶解完成后，使用1000ml量筒定容至1000πι1，0.22μΜ過濾除菌，長期 使用可保存至_20°C冰箱；
[0164] (4)0.5M CaC12溶液：稱量36.75g CaCl2用400ml Milli-Q grade超純水溶解；用 Mi 11 i-Q grade超純水將總體積定容至500ml，混勻;0.22μπι過濾除菌，分裝保存到50ml離心 管中，每管45ml左右，4°C保存。
[0165] (5)2XHBS溶液：稱量4.09g NaCl，0.269g Na2HP04,5.96g Hepes，用400ml Milli-Q grade超純水溶解;校準pH儀后，用2M NaOH溶液將HBS溶液的pH調(diào)到7 · 05。調(diào)整每瓶HBS的 PH消耗2M NaOH為3ml左右；
[0166] (6)從液氮罐中取出凍存的HEK293T/17細胞，迅速轉(zhuǎn)移到37°C水浴中，1~2min后 轉(zhuǎn)移到超凈臺中，無菌操作將凍存管中的液體全部轉(zhuǎn)移至l〇cm 2培養(yǎng)皿中，補足含10%FBS 的DMEM至8mL/l〇Cm2dish，24h后顯微鏡觀察細胞，細胞匯合的程度大于80 %進行傳代；
[0167] (7)選擇細胞狀態(tài)良好、無污染的HEK293T/17細胞，每2-6個培養(yǎng)皿為一組，將細胞 胰酶消化后，用電動移液器吸取4-12ml完全培養(yǎng)基，向每個消化后的培養(yǎng)皿中加2ml，避免 培養(yǎng)皿變干;使用lml移液器將所有細胞吹打成單細胞懸液，轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)基瓶中；
[0168] (8)將上述2-6個培養(yǎng)皿中的剩余細胞轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)基瓶中，并用培養(yǎng)基再沖洗一便 培養(yǎng)皿；
[0169] (9)蓋緊培養(yǎng)基瓶蓋，上下顛倒10次左右充分混勻細胞懸液，將細胞傳到8-24個 10cm 2培養(yǎng)皿中，每皿的細胞密度應(yīng)當(dāng)約4X 106個/10ml完全培養(yǎng)基左右。如果細胞密度和預(yù) 期的相差較大，則需要對細胞進行計數(shù)，然后按照4X10 6個/皿的量接種；
[0170] (10)每6個培養(yǎng)皿整理為一摞，注意保持上下皿之間的配合。將培養(yǎng)皿左右，前后 晃動數(shù)次，使細胞充分鋪開，然后放入5 % C02培養(yǎng)箱。剩余細胞做同樣處理；
[0171] (11)檢查所傳代細胞，細胞匯合度應(yīng)當(dāng)為70-80 %，輪廓飽滿，貼壁良好，在細胞培 養(yǎng)皿中均勾分布；
[0172] (12)為細胞換液，將培養(yǎng)基替換為新鮮完全培養(yǎng)基，每皿9ml，并將培養(yǎng)箱的0)2濃 度設(shè)定值提高到8% ;
[0173] (13)按照N+0.5配DNA/CaCl2溶液。每皿HEK293T/17細胞轉(zhuǎn)染質(zhì)粒量按照下列比例 使用：重組慢病毒質(zhì)粒(20yg)，pPac-GP(15yg)，pPac-R(1 Oyg)，pEnv-G(7 · 5yg)。取一個新的 5ml離心管，加入0.5M CaC12:0.25ml，重組慢病毒質(zhì)粒20yg:pPac_GP 15yg:pPac_R 10yg: pEnv-G 7.5yg，補充超純水至0.5ml蓋上蓋子，充分混勻；
[0174] (14)另取一支5ml離心管，加入0.5ml DNA/CaC12溶液。打開渦旋振蕩器，一只手拿 住5ml離心管的上端，使管底接觸振蕩頭，使液體在管壁上散開流動，另一只手拿一把lmL移 液槍，吸取0.5mL 2 X HBS溶液，緩慢滴加進入離心管，控制流速，以半分鐘滴完為宜。2 X HBS 加入后，繼續(xù)振蕩5秒鐘，停止振蕩，可直接加入需要轉(zhuǎn)染的細胞中；
[0175] (15)取一皿細胞，將離心管中的lmL鈣轉(zhuǎn)液滴加進去，盡可能使鈣轉(zhuǎn)試劑分布到整 個培養(yǎng)皿中；
[0176] (16)鈣轉(zhuǎn)液加入后，在皿蓋上做好標(biāo)記，將培養(yǎng)皿放還到另一個5 % C02培養(yǎng)箱中。 確保培養(yǎng)皿水平放置，每摞培養(yǎng)皿不要超過6個。在5%C02培養(yǎng)箱中放置(6-8h);
[0177] (17)將第一個培養(yǎng)箱的C02濃度設(shè)定值調(diào)回到5% ;
[0178] (18)24小時后，檢查細胞狀態(tài)。細胞匯合度應(yīng)當(dāng)為80-85%左右，狀態(tài)良好。將培養(yǎng) 基吸走，更換l〇ml新鮮的DMEM完全培養(yǎng)基；
[0179] (19)48小時后，觀察轉(zhuǎn)染效率。絕大多數(shù)細胞仍然是貼壁的?？梢钥吹匠^95%細 胞都會帶有綠色熒光。將同一個病毒包裝上清液收集到一起，并向培養(yǎng)皿中繼續(xù)添加10mL 新鮮培養(yǎng)基；
[0180] (20)72小時后，再次將同一個病毒上清液收集到一起，兩次收集的病毒可以放在 一起，丟棄培養(yǎng)皿;此時收集的上清里包含了重組慢病毒載體^〇41?46?1^111-〇^、1<八1?-EGFRvIII-CLB、1vCAR-EGFRvIII-0LC。
[0181] 實施例2重組慢病毒載體的濃縮及檢測
[0182] 一、超速離心法純化重組慢病毒載體；
[0183] (1)將收集的上清液分裝到50ml離心管中，500g室溫離心10min，除去細胞和大的 碎片；
[0184] (2)用0 · 22μπι-0 · 8μπι濾器過濾上清液；
[0185] (3)取6個Hitachi 40ΡΑ超速離心管，表面噴灑70%乙醇消毒，放在超凈臺用紫外 燈照射殺菌30分鐘。也可以通過高溫濕熱滅菌；
[0186] (4)將第2步處理好的細胞上清樣品分裝32ml到離心管中；
[0187] (5)蓋上金屬蓋，將離心管連同金屬蓋一起配平，用1XPBS調(diào)整使重量偏差在0.02g 范圍內(nèi)；
[0188] (6)將配平的離心管對稱放置于超速離心轉(zhuǎn)子P50AT2中。設(shè)置離心轉(zhuǎn)速100,000g， 4°C離心2小時；
[0189] (7)離心結(jié)束后，小心將離心管從轉(zhuǎn)子中拿出，可以看到在離心管底有一小團沉 淀，用Marker筆在外管壁上做標(biāo)記，倒掉上清。將離心管倒扣在預(yù)先鋪好的紙巾上，使殘余 液體流掉?？梢杂靡埔簶寣煸诒谏系囊旱挝?；
[0190] (8)向每個離心管中加入200μ1的Opti-MEM，用200μ1移液器吹打使沉淀溶解，盡量 減少泡沫的產(chǎn)生；
[0191] (9)將超速離心管插入50ml離心管中，蓋上蓋子，放入4°C冰箱過夜；
[0192] (10)500g，室溫離心lmin，使病毒液集中到管底；
[0193] (11)將所有相同的病毒濃縮液集中到一起，用0.22μπι-0.8μπι的PES濾器過濾;將病 毒分成25到50μ1-管，凍存到-80°C冰箱，進行長期保存；
[0194] 二、高速離心法純化重組慢病毒載體；
[0195] (1)將收集的上清液204ml使用0.22μπι-0.8μπι的PES濾器過濾；
[0196] (2)加入51ml 50%的PEG 6000溶液；
[0197] (3)加入21.711114]\1恥(：1溶液；
[0198] (4)加入23.3ml的PBS溶液，這時溶液總體積為300ml.PEG 6000的終濃度8.5%、 NaCl終濃度0.3M;
[0199] (5)將溶液分裝進250ml廣口瓶中，每份150ml;
[0200] (6)4°C放置1 · 5小時，每20-30分鐘混勻一次；
[0201] (7)4°C、7000g 離心 lOmin;
[0202] (8)離心后能看見管底有白色沉淀；
[0203] (9)小心棄去上清液，每瓶加入1.2ml 50mM Tris-HCl(pH 7.4)，劇烈搖晃重懸沉 淀；
[0204] (10)渦旋震蕩20-30秒進一步重懸沉淀；
[0205] (11)將病毒分成25到50μ1-管，凍存到-80°C冰箱，進行長期保存；
[0206]三、離子交換色譜法純化重組慢病毒載體(如圖7所示）；
[0207] (1)將收集的上清液使用Thermo真空栗，經(jīng)0 · 22μπι-0 · 8μπι的PES濾器抽濾，除去雜 質(zhì)；
[0208] (2)按1:1 ~1:10的比例往上清中加入 1.5Μ NaCl 250mM Tris-HCl(pH 6-8);
[0209] (3)將2個離子交換柱串聯(lián)放置，用4ml 1M NaOH、4ml 1M NaCl、5ml 0.15M NaCl 25mM Tris-HCl(pH 6-8)溶液依次過柱；
[0210] (4)將步驟2中獲得的溶液通過蠕動栗以l-10ml/min的速度給離子交換柱上樣；
[0211] (5)全部上清液過柱后，使用10ml 0.15M NaCl 25mM Tris-HCl(pH 6-8)溶液清洗 一遍；
[0212] (6)根據(jù)上樣量使用l-5ml 1.5M NaCl 25mM Tris-HCl(pH 6-8)進行洗脫，收集洗 脫液；
[0213] (7)將洗脫液分成25到50μ1-管，凍存到-80°C冰箱，進行長期保存；
[0214]四、滴度測定及比較；
[0215] (1)取24孔板接種293T細胞。每孔細胞為5X104個，所加培養(yǎng)基體積為500ul，不同 種類的細胞生長速度有所差異，進行病毒感染時的細胞融合率為40 % -60 % ;
[0216] (2)準備3個無菌EP管，在每個管中加入90ul的新鮮完全培養(yǎng)基（高糖DMEM+10% FBS)接種細胞24小時后，取兩個孔的細胞用血球計數(shù)板計數(shù)，確定感染時細胞的實際數(shù)目， 記為N;
[0217] (3)取待測定的病毒原液10ul加入到第一個管中，輕輕混勻后，取10ul加入到第二 個管中，然后依次操作直到最后一管；在每管中加入410ul完全培養(yǎng)基（高糖DMEM+10% FBS)，終體積為500ul;
[0218] ⑷感染開始后20小時，除去培養(yǎng)上清，更換為500μ1完全培養(yǎng)基（高糖DMEM+10% FBS)，5%C02繼續(xù)培養(yǎng)48小時；
[0219] (5)72小時后，觀察熒光表達情況，正常情況下，熒光細胞數(shù)隨稀釋倍數(shù)增加而相 應(yīng)減少，并拍照；
[0220] (6)用0.2ml 0.25%胰酶-EDTA溶液消化細胞，在37°C放置1分鐘。用培養(yǎng)基吹洗整 個細胞面，離心收集細胞。按照DNeasy試劑盒的說明抽提基因組DNA。每個樣品管中加入200 μL洗脫液洗下DNA并定量；
[0221] (7)準備目的DNA檢測qPCRmix總管I(QPCR引物序列為SEQ ID Ν0.44SEQ ID NO.45)：
[0223] n = number of reactions.例如：總反應(yīng)數(shù)為40,將 lml 2 XTaqMan Universal PCR Master Mix，4μ1
[0224] forward primer，4ul reverse primer，4ul probe和788μ1 H20混和 D震蕩后放在 冰上；
[0225] (8)準備內(nèi)參DNA檢測qPCRmix管 Π (QPCR引物序列為SEQ ID N0.46SEQ ID NO.47)：
[0226] 2 XTaqMan Master Mix 25μ1 Xn
[0227] lOXRNaseP primer/probe mix 2.5μ1 Xn
[0228] H20 17.5μLΧη
[0229] n = number of reactions.例如：總反應(yīng)數(shù)為40,將 lml 2 XTaqMan Universal PCR Master Mix，100yll0XRNaseP primer/probe mix和700μ1 H2O混和。震蕩后放在冰 上；
[0230] (9)在預(yù)冷的96孔PCR板上完成PCR體系建立。從總管I中各取45μ1加入到A-D各行 的孔中，從總管Π 中各取45μ1加入到E-G各行的孔中。
[0231] (10)分別取5μ1質(zhì)粒標(biāo)準品和待測樣品基因組DNA加入到A-D行中，每個樣品重復(fù)1 次。另留1個孔加入5μ1的水做為無模板對照(no-template control)。
[0232] (11)分別取5μ1基因組標(biāo)準品和待測樣品基因組DNA加入到E-G行中，每個樣品重 復(fù)1次。另留1個孔加入5μ1的水做為無模板對照(no-template control)。
[0233] (12)所使用定量PCR儀為ABI PRISM 7500定量系統(tǒng)。循環(huán)條件設(shè)定為:50°C2分鐘， 95 °C 10分鐘，然后是95 °C 15秒，60 °C 1分鐘的40個循環(huán)。
[0234]數(shù)據(jù)分析:測得的DNA樣品中整合的慢病毒載體拷貝數(shù)用基因組數(shù)加以標(biāo)定，得到 每基因組整合的病毒拷貝數(shù)。
[0235] 滴度（integration units per ml，IU ml-4 的計算公式如下：
[0236] IU mr1=(CXNXDX1000)/V
[0237] 其中：C =平均每基因組整合的病毒拷貝數(shù)
[0238] N=感染時細胞的數(shù)目（約為IX 105)
[0239] D =病毒載體的稀釋倍數(shù) [0240] V =加入的稀釋病毒的體積數(shù)
[0241] (13)重組慢病毒載體1丫〇厶1?16卩1^111-〇^、1￥〇厶1?16卩1^111-〇^、1￥〇八1?- EGFRvIII-OLC的滴度結(jié)果（如圖8所示），離子交換色譜法的結(jié)果明顯優(yōu)于超速離心法和高 速離心法；
[0242]五、內(nèi)毒素測定及比較；
[0243] (1)、內(nèi)毒素工作標(biāo)準品為15EU/支；
[0244] (2)、鱟試劑靈敏度λ = 〇 · 25EU/ml，0 · 5ml/管
[0245] (3)、內(nèi)毒素標(biāo)準品稀釋:取內(nèi)毒素標(biāo)準品一支，分別用BET水按比例稀釋成4λ和2λ 的溶解，封口膜封口，震蕩溶解15min;稀釋時每稀釋一步均應(yīng)在漩渦混合器上混勻30s;
[0246] (4)、加樣:取鱟試劑若干支，每支加入BET水0.5ml溶解，分裝至若干支無內(nèi)毒素試 管中，每管0. lml。其中2支為陰性對照管，加入BET水0. lml;
[0247] 2支為陽性對照管，加入2λ濃度的內(nèi)毒素工作標(biāo)準品溶液〇. lml;
[0248] 2支為樣品陽性對照管，加入0.1ml含2λ內(nèi)毒素標(biāo)準品的樣品溶液(稀釋20倍的待 測樣品1πι1+4λ的內(nèi)毒素標(biāo)準品溶液lml = 2ml含2λ內(nèi)毒素標(biāo)準品的稀釋40倍樣品）。
[0249] 樣品管中加入0.1ml樣品，稀釋比例見表4,37±1 °C水?。ɑ蚺囵B(yǎng)箱）保溫60 土 lmin；
[0250] (5)、重組慢病毒載體lvCAR-EGFRvni-CLAdvCAR-EGFRvIII-CLBUvCAR- EGFRvIII-OLC 的內(nèi) 毒素檢測結(jié)果 (如表 4 所示 ）， 超速離心法的 內(nèi)毒素含量在 20 ~ 40EU/ml 之 間，高速離心法的內(nèi)毒素含量在20~40EU/ml之間，離子交換色譜法的內(nèi)毒素含量在1.25~ 2.5EU/ml之間明顯優(yōu)于超速離心法和高速離心法；
[0252]表4重組慢病毒載體的不同純化方式的內(nèi)毒素檢測結(jié)果 [0253]六、支原體測定及比較；
[0254] (1)在實驗前三日，細胞樣品用無抗生素培養(yǎng)基進行培養(yǎng)；
[0255] (2)收集lml細胞懸浮液(細胞數(shù)大于1*105)，置于1.5ml離心管中；
[0256] (3) 13000 X g離心lmin，收集沉淀，棄去培養(yǎng)基；
[0257] (4)加入500ul PBS用槍頭吹吸或渦旋振蕩，重懸沉淀。13000Xg離心5min;
[0258] (5)步驟4重復(fù)一次；
[0259] (6)加入50μ1 Cell Lysis Buffer，用槍頭吹吸，充分混勻后，在55°C水浴中孵育 20min；
[0260] (7)將樣品置于95°C中加熱5min;
[0261] (8) 13000 X g離心5min后，取5μ1上清作為模板，25ylPCR反應(yīng)體系為：ddH20 6.5μ l、Myco Mixlyl、2x Taq Plus Mix Master(Dye ?1118)12.541、模板541;卩0?循環(huán)條件為：95 Γ3〇8θ(：，（95Γ3〇8θ(3,56Γ3〇8θ(3,72Γ3〇8θ(3)*3(^7(3? θ，72Γ5π?η〇
[0262] (9)支原體檢測結(jié)果顯示（如圖9和表5所示），超速離心法、高速離心法、離子交換 色譜法
[0263] 純化的重組慢病毒載體均不含支原體。
[0265] 表5支原體檢測
[0266] 實施例 3 重組慢病毒載體 1vCAR-EGFRvIII-CLA、1vCAR-EGFRvIII-CLB、1vCAR-EGFRvII I-0LC的功能檢測
[0267] 一、CAR基因的細胞水平表達檢測：
[0268] (1)重組慢病毒載體1<厶1?16卩1^111-〇^、1￥〇厶1?16卩1^111-〇^、1￥〇八1?-EGFRvIII-0LC感染PBMC細胞后，收集細胞采用RT-PCR進行CAR mRNA轉(zhuǎn)錄水平的檢測，驗證 CAR基因的表達，如果CAR mRNA轉(zhuǎn)錄水平增高，則說明CAR基因的轉(zhuǎn)錄水平表達成功；
[0269] (2)重組慢病毒載體1丫〇厶1?16卩1^111-〇^、1￥〇厶1?16卩1^111-〇^、1￥〇八1?-EGFRvIII-OLC感染PBMC細胞后，收集細胞采用western blot進行CAR蛋白表達水平的檢測， 驗證CAR基因的表達，如果CAR蛋白表達水平增高，則說明CAR基因的翻譯水平表達成功；
[0270] (3)分別將M0I = 15的 IvCAR-EGFRvin-CLA'IvCAR-EGFRvIII-CLB'IvCAR-EGFRvIII-OLC 和對照病毒 MOCK 感染細胞， 48h 后提取 6 孔板中細胞的總 RNA 和總蛋白 分別進 行熒光定量PCR實驗和免疫印跡實驗。具體步驟:包被6孔板的四個孔，每個孔加入相應(yīng)的 PBS和RN，4°C過夜。12小時后按Μ0Ι = 15包被病毒，37°C培養(yǎng)箱放置5h;取出的6孔板，棄掉病 毒上清，用PBS洗兩遍，按1*106/孔，包被PBMC(用淋巴細胞分離液從人血中分離），加入 500ul培養(yǎng)基（含 10%血清、20U/ml IL_2、Polybrene 8ug/ml)。靜置20min，1000g 20°C離心 3〇11^11，37°(：培養(yǎng)4811。
[0271] (4)Tr iζο 1法提取6孔板中PBMC細胞的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄擴增cDNA，用QPCR引物(序列 為SEQ ID N0.46SEQ ID NO.49)進行熒光定量PCR實驗，反應(yīng)體系見表6,以內(nèi)參Actin為 對照組，驗證其mRNA的轉(zhuǎn)錄情況。
[0274] 表6 20μ1 qPCR反應(yīng)體系
[0275] (5)蛋白免疫印跡(Western B1 〇t)通過聚丙烯酰胺凝膠電泳將從PBMC中提取的總 蛋白質(zhì)按相對分子質(zhì)量分離。采用濕轉(zhuǎn)(4°C，400mA，120min)，將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用封 閉液（含5 %脫脂牛奶的TBST溶液）室溫封閉PVDF膜lh，封閉液1:1000稀釋Biotinylated protein L，然后與封閉好的PVDF膜室溫孵育4°C過夜。TBST洗膜3次，每次10min。封閉液1: 500稀釋相應(yīng)的SA-HRP，室溫下孵育PVDF膜2h，TBST洗膜3次，每次10min。采用Amersham公司 ECL+plusTM Western blotting system試劑盒進行顯色。X光顯影獲得顯示條帶的膠片。
[0276] (6)RT-QPCR檢測顯示，重組慢病毒載體感染PBMC后的CAR的表達水平比對照病毒 MOCK和空細胞有明顯升高(如圖10和表7所示），說明CAR基因的轉(zhuǎn)錄水平表達成功。
[0278] 表 7RT-QPCR 檢測
[0279] (7)蛋白免疫印跡(Western Blot)的結(jié)果表明，CAR蛋白在重組慢病毒系統(tǒng)中表達 (如圖11所示），說明CAR基因的翻譯水平表達成功。
[0280] 二、細胞因子分泌及殺傷效果評估。
[0281] (1)分別培養(yǎng) EGFRvII I+K562 細胞和效應(yīng)細胞1￥〇六1?46?1^111-〇^-?81(：、1￥〇八1?-EGFRvIII-CLB-PBMC、1vCAR-EGFRvIII-0LC-PBMC;
[0282] (2)收集靶細胞 "6?1^1 1 1+1(562)41105〇6 118和效應(yīng)細胞（041?1'細胞） 2.8xl06cells，800g，6min離心，棄上清；
[0283] (3)用1ml lxPBS溶液分別重懸靶細胞和效應(yīng)細胞，800g，6min離心，棄上清；
[0284] (4)重復(fù)步驟3-次；
[0285] (5)用700ul培養(yǎng)基（1640培養(yǎng)基+10%FBS)重懸效應(yīng)細胞，用2ml培養(yǎng)基（1640培養(yǎng) 基+10%FBS)重懸靶細胞；
[0286] (6)設(shè)置效靶比為1:1、5:1、10:1的實驗孔，并設(shè)置對照組，每組3個復(fù)孔；
[0287] (7)250xg，5min 平板離心；
[0288] (8) 37 Γ 5 % C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4小時；
[0289] (9)250xg，5min 平板離心；
[0290] (10)取每個孔的50ul上清到新96孔板中，并且每孔加入50ul底物溶液（避光操 作)；
[0291] (11)避光孵育25分鐘；
[0292] (12)每孔加入50ul終止液；
[0293] (13)酶標(biāo)儀檢測490nm吸光度；
[0294] (14)將3個復(fù)孔取平均值;將所有實驗孔、靶細胞孔和效應(yīng)細胞孔的吸光值減去培 養(yǎng)基背景吸光值的均值;將靶細胞最大值的吸光值減去體積校正對照吸光值的均值。
[0295] (15)將步驟14中獲得的經(jīng)過校正的值帶入下面公式，計算每個效靶比所產(chǎn)生的細 胞毒性百分比。結(jié)果如圖12所示，重組慢病毒載體1 vCAR-EGFRvIII-0LC轉(zhuǎn)導(dǎo)的PBMC細胞在 不同效靶比條件下殺傷效率明顯高于1 vCAR-EGFRv III-CLA和1 vCAR-EGFRv III-CLB轉(zhuǎn)導(dǎo)的 PBMC細胞；
[0296] 殺傷效率=(實驗孔-效應(yīng)細胞孔-靶細胞孔)/(靶細胞最大孔-靶細胞孔)X100%
[0297] (16)重復(fù)準備一份步驟6的樣品用于qPCR檢測細胞因子表達水平，結(jié)果如圖13所 示，重組慢病毒載體IvCAR-EGFRvIII-OLC轉(zhuǎn)導(dǎo)的PBMC細胞在不同效靶比條件下IL-2和IFN-γ 的mRNA轉(zhuǎn)錄水平明顯高于 1 vCAR-EGFRvIII-CLA和 1 vCAR-EGFRvIII-CLB轉(zhuǎn)導(dǎo)的PBMC細胞；
[0298] 三、根據(jù)文獻報道（Laura A · Johnson，et al · Rational development and characterization of humanized anti-EGFR variant III chimeric antigen receptor T cells for glioblastoma.Sci Transl Med.2015Februaryl8；7(275):275ra22.),CAR- EGFRvII I載體針對惡性膠質(zhì)瘤有著良好的效果。
[0299] 本研究在www. cl ini cal trials .gov的注冊號是#NCT02209376。本研究中使用表達 CAR-EGFRvIII基因的T淋巴細胞用于治療惡性膠質(zhì)瘤的病人。核磁共振影像顯示，注射后11 天，CAR-EGFRv III-Τ淋巴細胞在顱內(nèi)荷瘤小鼠體內(nèi)與未轉(zhuǎn)導(dǎo)CAR-EGFRv III的實驗組以及 PBS空白組相比，腫瘤體積明顯縮小（如圖14A所示）；流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，注射后18 天，在骨髓、脾、腦中，轉(zhuǎn)導(dǎo)了CAR-EGFRvIII基因的⑶4+⑶8+T淋巴細胞的數(shù)量比未轉(zhuǎn)導(dǎo)CAR- EGFRν〗Π 實驗組以及PBS空白組要高出數(shù)倍乃至數(shù)十倍（如圖14B所示）；過繼性CAR-EGFRvII I-T細胞療法在針對惡性膠質(zhì)瘤的治療方面擁有良好的前景。
[0300] 實施例4第三代慢病毒骨架載體3rdLV-CAR-EGFRVIII與第二代慢病毒骨架載體 2ndLV-CAR-EGFRv III 滴度比較
[0301] 分別構(gòu)建3rdLV-CAR-EGFRvIII和2ndLV-CAR-EGFRvIII;質(zhì)粒構(gòu)建、病毒包裝、病毒 超速離心濃縮、滴度測定過程參考實施例1;連續(xù)3個批次的滴度結(jié)果如圖15所示，第三代慢 病毒骨架載體3rdLV-CAR-EGFRvII I的滴度要優(yōu)于第二代慢病毒骨架載體2ndLV-CAR-EGFRvIII;因此，本專利選擇使用第三代慢病毒骨架載體作為CAR基因的搭載骨架。
[0302] 實施例5第二代CAR慢病毒載體3rdLV-2ndCAR-EGFRvIII與第三代CAR慢病毒載體 3rdLV-3rd CAR-EGFRvIII殺傷效率比較
[0303] 分別構(gòu)建 3rdLV-2ndCAR-EGFRvIII 和 3rdLV-3rdCAR-EGFRvIII;質(zhì)粒構(gòu)建、病毒包 裝、病毒超速離心濃縮、滴度測定過程參考實施例1;殺傷實驗參考實施例3;第二代CAR慢病 毒載體
[0304] 3rdLV-2ndCAR-EGFRvIII與第三代CAR慢病毒載體3rdLV-3rd CAR-EGFRvIII殺傷 效率結(jié)果比較如圖16所示，3rdLV-3rd CAR-EGFRvIII針對靶細胞的殺傷效率在不同效靶比 條件下并未表現(xiàn)的比3rdLV-2ndCAR-EGFRvIII更高效；因此，本專利選擇使用第二代CAR設(shè) 計的慢病毒載體作為臨床實驗載體。
[0305]以上已對本發(fā)明創(chuàng)造的較佳實施例進行了具體說明，但本發(fā)明創(chuàng)造并不限于所述 實施例，熟悉本領(lǐng)域的技術(shù)人員在不違背本發(fā)明創(chuàng)造精神的前提下還可作出種種的等同的 變型或替換，這些等同的變型或替換均包含在本申請權(quán)利要求所限定的范圍內(nèi)。
【主權(quán)項】
1. 一種抗EGFRvII I嵌合抗原受體，包括依次串聯(lián)的CD8 leader嵌合受體信號肽、 EGFRvIII單鏈抗體輕鏈VL、Optimal Linker C、EGFRvIII單鏈抗體重鏈VH、CD8 Hinge嵌合 受體鉸鏈、CD8 Transmembrane嵌合受體跨膜區(qū)、CD137嵌合受體共刺激因子，以及TCR嵌合 受體T細胞激活域。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗EGFRvII I嵌合抗原受體，其特征在于:所述嵌合抗原受體的 氨基酸序列如SEQ ID NO.50所示。3. -種抗EGFRvII I嵌合抗原受體，包括依次串聯(lián)的CD8 leader嵌合受體信號肽、 EGFRvIII單鏈抗體輕鏈VL、Optimal Linker C、EGFRvIII單鏈抗體重鏈VH、CD8 Hinge嵌合 受體鉸鏈、CD8 Transmembrane嵌合受體跨膜區(qū)、CD28嵌合受體共刺激因子、CD137嵌合受體 共刺激因子、以及TCR嵌合受體T細胞激活域。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的抗EGFRvII I嵌合抗原受體，其特征在于:所述嵌合抗原受體的 氨基酸序列如SEQ ID NO.51所示。5. 編碼權(quán)利要求1-4任一項所述的抗EGFRvIII嵌合抗原受體的基因。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的基因，其特征在于:所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.52或 SEQ ID NO .53所示。7. 含有權(quán)利要求5或6所述的基因的重組表達載體。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的重組表達載體，其特征在于：所述表達載體為慢病毒表達載 體、逆轉(zhuǎn)錄病毒表達載體、腺病毒表達載體、腺相關(guān)病毒表達載體或質(zhì)粒。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的重組表達載體，其特征在于:所述的慢病毒表達載體包含權(quán)利 要求5所述的基因。10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的重組表達載體，其特征在于:所述的慢病毒表達載體包括：用 于質(zhì)粒復(fù)制的原核復(fù)制子PUC Ori序列；用于目的菌株大量擴增的含氨芐青霉素抗性基因 AmpR序列；用于增強真核細胞內(nèi)的復(fù)制的病毒復(fù)制子SV40 Ori序列；用于慢病毒包裝的慢 病毒包裝順式元件；用于真核細胞表達綠色熒光的ZsGreenl綠色熒光蛋白；用于共同轉(zhuǎn)錄 表達蛋白質(zhì)的IRES核糖體結(jié)合序列；用于嵌合抗原受體基因的真核轉(zhuǎn)錄的人EFla啟動子； 用于組成集識別、傳遞、啟動于一體的二代CAR或三代CAR的嵌合抗原受體的編碼基因；用于 增強轉(zhuǎn)基因的表達效率的eWPRE增強型土撥鼠乙肝病毒轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件。11. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的重組表達載體，其特征在于，所述慢病毒包裝順式元件采用 第二代慢病毒載體包括:慢病毒5terminal LTR、慢病毒3terminal Self-Inactivating LTR、Gag順式元件、RRE順式元件、env順式元件，以及cPPT順式元件。12. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的重組表達載體，其特征在于，所述慢病毒包裝順式元件采用 第三代慢病毒載體包括：慢病毒5terminal LTR、慢病毒3terminal Self-Inactivating LTR、Gag順式元件、RRE順式元件、env順式元件、cPPT順式元件所述慢病毒包裝順式元件，以 及RSV啟動子。13. 根據(jù)權(quán)利要求9-12任一項所述的重組表達載體，其特征在于，所述eWPRE增強型土 撥鼠乙肝病毒轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件有6個核苷酸的增強突變，具體為：g.396G>A、g.397C>T、 g.398T>C、g.399G>A、g.400A>T、g.411A>T。14. 一種如權(quán)利要求9-13中任一項所述的重組表達載體的構(gòu)建方法，包括以下步驟： (1)將含氨芐青霉素抗性基因 AmpR序列、原核復(fù)制子pUC Ori序列、病毒復(fù)制子SV40 Ori序列、用于慢病毒包裝的慢病毒包裝順式元件、ZsGreenl綠色熒光蛋白、IRES核糖體結(jié) 合序列、eWPRE增強型土撥鼠乙肝病毒轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件存儲于慢病毒骨架質(zhì)粒上； (2) 將人EFla啟動子、用于組成集識別、傳遞、啟動于一體的二代CAR或三代CAR的嵌合 抗原受體組合成二代CAR或三代CAR設(shè)計方案，經(jīng)過酶切、連接、重組反應(yīng)克隆至慢病毒骨架 質(zhì)粒中，得到二代CAR或三代CAR設(shè)計的重組慢病毒質(zhì)粒； (3) 將得到的重組慢病毒質(zhì)粒與慢病毒包裝質(zhì)粒pPac-GP、pPac_R以及膜蛋白質(zhì)粒 pEnv-G共同轉(zhuǎn)染HEK293T/17細胞，在HEK293T/17細胞中進行基因轉(zhuǎn)錄表達后，包裝成功重 組慢病毒載體會釋放到細胞培養(yǎng)上清中，收集包含的重組慢病毒載體的上清液； (4) 將得到的重組慢病毒上清采用抽濾、吸附、洗脫的離子交換方式進行純化，分別得 到重組慢病毒載體。15. 根據(jù)權(quán)利要求14所述的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟(4)中，所述抽濾步驟控制上清 體積在200ml~2000ml，真空度控制在-0.5MPA~-0.9MPA，；所述吸附步驟控制溶液的PH值 在6~8;所述洗脫步驟控制洗脫液的離子強度在0.5M~1.0M。16. -種CAR-T細胞，所述的CAR-T細胞是由權(quán)利要求1-4任一項所述的抗EGFRvII I嵌合 抗原受體修飾的T淋巴細胞。17. 根據(jù)權(quán)利要求16所述的CAR-T細胞在制備惡性膠質(zhì)瘤治療藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N15/62GK105949316SQ201610224670
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2016年4月12日
【發(fā)明人】祁偉, 俞磊
【申請人】上海優(yōu)卡迪生物醫(yī)藥科技有限公司