專利名稱：一種冬蟲夏草原草粉的高純基因組dna提取方法
技術(shù)領(lǐng)域：
:本發(fā)明涉及一種基因組DNA提取方法，具體為一種冬蟲夏草原草粉的高純基因組DNA提取方法。
背景技術(shù)：
:冬蟲夏草是一種名貴中藥材，有軟黃金之稱，資源有待深加工開發(fā)。目前，已有大量冬蟲夏草粉碎加工的產(chǎn)品問世，但尚沒有專門針對冬蟲夏草原草粉進行DNA提取的方法，給多重PCR和熒光定量PCR等分子分析鑒定研究帶來困難。冬蟲夏草子座，蟲體質(zhì)地韌性存在差異，DNA提取過程中如果研磨過度易引起蟲體部位DNA斷裂損失，研磨不徹底又會導(dǎo)致子座DNA難以溶出，目前，針對冬蟲夏草原草以及發(fā)酵菌絲體基因組DNA的提取，報道的主要有氯化芐法和CTAB法等化學(xué)方法以及蛋白酶K法?；瘜W(xué)方法由于未添加蛋白酶K處理，往往純度不夠，含有較多雜蛋白；而蛋白酶K法提取過程溫和，DNA濃度難以保證。以上方法均難以滿足提取高純度的冬蟲夏草原草粉基因組DNA的要求。因此，建立一種冬蟲夏草原草粉的高純基因組DNA提取方法已成為目前亟需解決的問題
發(fā)明內(nèi)容
: 本發(fā)明的目的是提供一種能夠?qū)ｉT從冬蟲夏草原草粉中提取高質(zhì)量高純度基因組DNA的方法，為之后的分子生物學(xué)分析提供優(yōu)質(zhì)的模板。為達到上述目的，本發(fā)明根據(jù)冬蟲夏草原草粉的特點，摸索出了一套保護各組織基因組DNA完整性的重復(fù)過篩-研磨的處理方法。并組合了 DNA純化試劑盒進行提取，達到高純的要求。具體操作步驟如下:(I)取冬蟲夏草原草粉0.25g,置于無菌的研缽中；(2)加入液氮在IOs以內(nèi)迅速研磨至粉末；(3)將研磨后的粉末過120目篩；(4)將過篩后的粉末轉(zhuǎn)移到1.5ml的離心管中，加入裂解液700 yl，并置于水浴鍋中65 °C恒溫處理30min ；裂解液組成為:2% CTAB(十六烷基三甲基溴化銨)、IOOmM Tris-HCl (三(羥甲基)氨基甲烷鹽酸鹽)pH 8.0、1.4M NaCl (氯化鈉)、20mM EDTA (乙二胺四乙酸二鈉)、1.5%polyvinyl-pyrrolidone, PVP(聚乙烯卩比咯燒酮)、0.5 2-mercaptoethanol ( ^ 疏基乙醇)；(5)在裂解處理后的樣品中加入等體積的氯仿異戊醇(24: l)，13000rpm，離心IOmin ；(6)取上清液，加入RNA酶至終濃度為60 u g/ml，37°C保溫30min ；(7)加入蛋白酶K至終濃度為1201^/1111，371:保溫301^11;(8)重復(fù)步驟⑶；
(9)取上清液，加入0.8倍體積的異丙醇；(10)4°C放置 15min 后，13000rpm 離心 2min ；(11)去上清液，加入70%預(yù)冷乙醇500iil洗滌脫鹽，13000rpm，離心2min，重復(fù)2次；(12)采用OMEGA公司生產(chǎn)的DNA純化試劑盒進行DNA純化。本發(fā)明采用液氮快速研磨的方法，減少了 DNA碎片的產(chǎn)生，同時研磨后得到的粉末經(jīng)120目篩過濾，避免了研磨過度易引起蟲體部位DNA斷裂損失，研磨不徹底又會導(dǎo)致子座DNA難以溶出的問題，提取過程中加入RNA酶，以消除RNA對提取產(chǎn)物的干擾。本發(fā)明不需要進行繁瑣的化學(xué)提取前處理操作。獲得的基因組片段大約為21kb ；濃度可達 450 800ng/ u L, A260/A280 為 1.833 1.898，A260/A230 為 2.043 2.126?？蓾M足多重PCR，RT-PCR等分子分析鑒定研究的需要。


:附圖是利用I %濃度的瓊脂糖凝膠電泳檢測本發(fā)明方法提取得到的冬蟲夏草原草粉基因組DNA樣品。M-入DNA/HindIII Marker，1/2/3為3個重復(fù)。
具體實施方式
:下面的實施方式是為了進一步闡述本發(fā)明，從而使本領(lǐng)域技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明，而不會給本發(fā)明造成任何限制。冬蟲夏草原草粉取自 青海三江源藥業(yè)有限公司。實施例1取冬蟲夏草原草粉0.25g,置于無菌的研缽中；加入液氮在IOs以內(nèi)迅速研磨至粉末；將研磨后的粉末過120目篩；將過篩后的粉末轉(zhuǎn)移到1.5ml的離心管中，加入裂解液700 yl，并置于水浴鍋中65°C恒溫處理30min(裂解液組成為:2% CTAB(十六烷基三甲基溴化銨)、100mM Tris-HCl (三(羥甲基)氨基甲烷鹽酸鹽)pH 8.0、1.4MNaCl (氯化鈉)、2OmM EDTA(乙二胺四乙酸二鈉)、1.5% polyvinyl-pyrrolidone,PVP(聚乙烯卩比咯燒酮)、
0.5% 2-mercaptoethanol 巰基乙醇))；在裂解處理后的樣品中加入等體積的氯仿異戍醇(24: 1)，13000印111，離心101^11;取上清液，加入1 應(yīng)酶至終濃度為601^/1111，371:保溫30min ;加入蛋白酶K至終濃度為120 y g/ml，37°C保溫30min ;重復(fù)步驟￠);取上清液，加入0.8倍體積的異丙醇沉淀DNA，13000rpm,離心2min ;加入70%預(yù)冷乙醇500 U I洗滌脫鹽，13000rpm,離心2min，重復(fù)2次；采用OMEGA公司生產(chǎn)的DNA純化試劑盒進行DNA純化。50 u I無菌雙蒸水或TE洗脫得到高純度高質(zhì)量原草粉基因組DNA(大約為20Kb)，置于-20°C冰箱中保存。利用1%濃度的瓊脂糖凝膠電泳檢測本發(fā)明方法提取得到的冬蟲夏草原草粉基因組DNA(詳見說明書附圖)，采用DU-800分光光度計進行檢測，三個平行平均濃度為 652ng/u L, A260/A280 = 1.854，A260/A 230 = 2.014。
權(quán)利要求
1.一種冬蟲夏草原草粉的高純基因組DNA提取方法，依次包括如下步驟: (1)取冬蟲夏草原草粉，置于無菌的研缽中； (2)加入液氮迅速研磨至粉末； (3)將研磨后的粉末過篩； (4)將過篩后的粉末轉(zhuǎn)移到1.5ml的離心管中，加入裂解液進行裂解處理； (5)在裂解處理后的樣品中加入等體積的氯仿異戊醇(24: I)，離心抽提； (6)取上清液，加入RNA酶處理； (7)加入蛋白酶K處理； (8)重復(fù)步驟(6)； (9)取上清液，異丙醇沉淀DNA； (10)70%預(yù)冷乙醇洗滌脫鹽2次； (11)純化DNA。
2.如權(quán)利要求1的方法，其中步驟(I)取0.25g原草粉。
3.如權(quán)利要 求1的方法，其中步驟⑵液氮研磨的時間控制在IOs以內(nèi)。
4.如權(quán)利要求1的方法，其中步驟(3)將研磨后的粉末過120目篩。
5.如權(quán)利要求1的方法，其中步驟(4)加入裂解液組成為:2%CTAB(十六烷基三甲基溴化銨)、100mM Tris-HCl(三(羥甲基)氨基甲烷鹽酸鹽)pH8.0、1.4M NaCl (氯化鈉)、2OmM EDTA(乙二胺四乙酸二鈉)、1.5% polyvinyl-pyrrolidone,PVP(聚乙烯卩比咯燒酮)、0.5% 2-mercaptoethanol (P 疏基乙醇)。
6.如權(quán)利要求1的方法，其中步驟(4)加入裂解液700yl，并置于水浴鍋中65°C恒溫處理30min。
7.如權(quán)利要求1的方法，其中步驟(5)離心轉(zhuǎn)速為13000rpm,離心時間為lOmin。
8.如權(quán)利要求1的方法，其中步驟(6)加入的RNA酶終濃度為60ii g/ml，處理條件為37°C，30min。
9.如權(quán)利要求1的方法，其中步驟(7)加入的蛋白酶K終濃度為120ii g/ml。處理條件為 37°C，30min。
10.如權(quán)利要求1的方法，其中步驟(9)中加入的異丙醇體積為上清液體積的0.8倍，4°C 沉淀 15min 后，13000rpm 離心 2min。
11.如權(quán)利要求1的方法,其中步驟(10)中加入的70%預(yù)冷乙醇體積為500ii I。
12.如權(quán)利要求1的方法，其中步驟(11)中采用OMEGA公司生產(chǎn)的DNA純化試劑盒進行純化。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種冬蟲夏草原草粉的高純基因組DNA提取方法。將冬蟲夏草原草粉用液氮迅速研磨后，過120目篩，采用CTAB抽提，RNA酶和蛋白酶K處理后，結(jié)合純化試劑盒成功提取到高純的基因組DNA。所提DNA經(jīng)DU-800分光光度計檢測濃度可達450～800ng/μL，A260/A280為1.833～1.898，A260/A230為2.043～2.126，適用于后期的多重PCR，RT-PCR的研究。
文檔編號C12R1/645GK103232995SQ20121050667
公開日2013年8月7日 申請日期2012年12月3日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月3日
發(fā)明者程池, 扎西才吉, 李輝, 姚粟, 劉洋, 張欣, 白飛榮 申請人:中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院, 玉樹藏族自治州三江源藥業(yè)有限公司