一種單分子測序芯片的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本實用新型涉及DNA測序芯片技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種單分子測序芯片。
【背景技術(shù)】
[0002]進(jìn)入21世紀(jì)后，人類基因組計劃的完成對當(dāng)代的生物學(xué)研究和醫(yī)學(xué)研究產(chǎn)生了巨大的影響。就基因序列分析而言，后基因組時代的重點已由單個物種的全基因組序列測定轉(zhuǎn)移到了對某一物種在基因組DNA序列層次上對個體遺傳差異及物種間遺傳差異的比較。靶向基因重測序?qū)俏磥砼R床基因檢測的主流技術(shù)。單分子測序技術(shù)被譽為第三代測序技術(shù)，其顯著特征是可以高保真地對DNA片段直接進(jìn)行識別，單分子測序技術(shù)由于能識別到單個核酸分子，其具有比高通量測序技術(shù)(統(tǒng)稱為二代測序技術(shù))更高的檢測靈敏度。
[0003]基因芯片是測序技術(shù)得以實現(xiàn)的關(guān)鍵部件。然而，二代測序芯片是目前市場上的主流產(chǎn)品，它們大多是采用半導(dǎo)體納米加工工藝得到高密度的納米陣列，加工工藝精細(xì)且復(fù)雜，成本非常高，且需要大型的高精度儀器和超高級別的潔凈室來完成。另外，二代測序芯片為了實現(xiàn)高通量的測序目的，芯片通道的寬度通常較大，在負(fù)壓抽液方式進(jìn)樣進(jìn)行生化反應(yīng)時，通常會存在流體的流場分布不均問題和蓋玻片易變形的問題。流場分布不均問題會造成試劑切換不干凈，并使生化反應(yīng)受影響，蓋玻片變形會影響芯片的質(zhì)量，更會影響堿基光學(xué)信號的采集。
[0004]單分子測序技術(shù)由于在測序數(shù)據(jù)量上要求不高，無需像二代測序芯片要求超高密度的納米陣列，因此傳統(tǒng)的二代測序芯片已無法匹配單分子測序技術(shù)，所以，有必要提供一種適用于單分子測序的芯片。
【實用新型內(nèi)容】
[0005]鑒于此，本實用新型提供了一種單分子測序芯片，所述單分子測序芯片具有一定數(shù)目的流道，所述芯片的流場分布情況良好，芯片的變形率低，流體的沖刷切換徹底。
[0006]本實用新型提供了一種單分子測序芯片，所述單分子測序芯片包括基片和所述基片壓合設(shè)置的基底層，所述基片包括相對設(shè)置的第一表面和第二表面，所述基片第一表面間隔設(shè)置有多個流道形成的反應(yīng)池陣列，每個所述流道相對設(shè)置的兩個側(cè)壁沿所述流道的長度方向延伸并在所述流道的兩端交匯形成兩個帶有夾角的錐形末端，所述兩個錐形末端表面分別設(shè)置有與所述基片第二表面連通的流體輸入孔和流體輸出孔，所述基底層包括透明基底和設(shè)置在所述透明基底表面的間隔層，所述間隔層與所述基片第一表面接觸且所述間隔層對應(yīng)所述流道所在的位置設(shè)置有腐蝕凹槽。
[0007]優(yōu)選地，所述反應(yīng)池陣列包括15-25個流道。
[0008]優(yōu)選地，所述間隔層沿與所述流道的長度方向垂直的方向之間的寬度為1-1.5mm。
[0009]如本實用新型所述的，相鄰流道之間的間距為1-1.5mm。
[0010]優(yōu)選地，所述錐形末端的夾角為30-60°。
[0011]優(yōu)選地，每個所述流道相對設(shè)置的兩個側(cè)壁的交匯處的距離為每個流道的長度，每個所述流道的長度為50-75mm。
[0012]優(yōu)選地，每個所述流道相對設(shè)置的兩個側(cè)壁之間的距離為每個流道的寬度，每個所述流道的寬度為I_2mm。
[0013]優(yōu)選地，每個所述流道的深度為0.6-lmm。
[0014]將流道的深度優(yōu)選為0.6-1_，根據(jù)矩形流道流體力學(xué)阻力規(guī)律，厚度方向每增加一倍，流阻降低為原來的1/8，小的流阻，有利于流體的流動，便于單分子測序過程中，流體在流道內(nèi)進(jìn)行生化反應(yīng)。
[0015]更優(yōu)選地，每個流道的長度50_，寬度為1mm，深度為0.6_。
[0016]在流體上來說，寬度更窄的流道更有利于流體間的沖刷切換，將流道兩端的縱截面設(shè)計成為三角形，當(dāng)流體流過該流道內(nèi)，可使流道內(nèi)不存在回流現(xiàn)象。
[0017]優(yōu)選地，所述基片具有與所述流道的長度方向垂直的第一邊長，每個流道相對設(shè)置的兩個側(cè)壁的交匯處距所述基片的第一邊長的距離為0.5-lcmo
[0018]優(yōu)選地，所述流體輸入孔和流體輸出孔同軸。
[0019]優(yōu)選地，所述流體輸入孔的孔徑大小為300-500 μ m0
[0020]優(yōu)選地，所述流體輸出孔的孔徑大小為300-500 μ m。
[0021]如實用新型所述的，所述基片第一表面間隔設(shè)置有多個流道組成單分子測序芯片的反應(yīng)池陣列，每個流道的兩個錐形末端表面開設(shè)有流體輸入孔和輸出孔，以供流體的流入與流出。
[0022]如本實用新型所述的，所述流體輸入孔和流體輸出孔用于連接流體的輸入、輸出裝置，例如，可以在所述流體輸入孔和流體輸出孔分別插上移液槍頭、管接頭等，以分散每個流道內(nèi)流體的輸入點、輸出點，便于每個流道內(nèi)流體的輸入、輸出不受干擾。
[0023]優(yōu)選地，所述基片的材質(zhì)包括聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、EVA(乙烯-醋酸乙烯)和PUA(聚胺脂)中一種或多種，但不限于此，只要能實現(xiàn)澆筑工藝即可。
[0024]優(yōu)選地，所述透明基底包括表面帶有官能團(tuán)為環(huán)氧基、氨基、羧基、巰基和醛基中的一種的透明的玻璃或石英。
[0025]更優(yōu)選地，所述透明基底為表面帶有環(huán)氧基的透明玻璃。
[0026]優(yōu)選地，所述間隔層的材質(zhì)為聚甲基戊二酰亞胺(PMGI)。所述間隔層用于阻隔各流道內(nèi)的樣本之間的接觸，保證每個流道內(nèi)樣本的單獨控制。
[0027]優(yōu)選地，所述間隔層是向每個流道內(nèi)注入試劑以清洗掉與各流道接觸的透明基底上的聚甲基戊二酰亞胺層，以使透明基底上表面帶有的官能團(tuán)(環(huán)氧基、氨基、羧基、巰基和醛基等)暴露出來。所述間隔層用于阻隔各流道內(nèi)的樣本之間的接觸，保證每個流道內(nèi)樣本的單獨控制。
[0028]優(yōu)選地，所述腐蝕凹槽的深度為1-5 μ m。
[0029]所述透明基底表面的官能團(tuán)(如環(huán)氧基、氨基、羧基、巰基和醛基)，可與單分子測序儀的基因樣本的官能團(tuán)(如羧基、磷酸基、氨基等)發(fā)生作用，使得基因樣本(如DNA、RNA)固定在芯片的透明基底上，從而便于測序的進(jìn)行。如透明基底上的環(huán)氧基可與修飾有_順2的DNA發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，通過新的-CH2-NH-鍵將待測序的DNA單鏈固定在修飾有環(huán)氧基團(tuán)的基底表面。
[0030]所述單分子測序芯片在應(yīng)用時，在下層透明基底的外部設(shè)有熒光檢測器，熒光檢測器為光電耦合器件CCD或互補性氧化金屬半導(dǎo)體CMOS中的一種。經(jīng)過微流體通道中的生化反應(yīng)，可用多種光學(xué)波長來檢測固定在透明基底上的DNA分子中某一特定位置的堿基，從而確定固定在透明基底上的DNA序列。
[0031]本實用新型提供的單分子測序芯片具有一定數(shù)目的流道，每個流道的兩端設(shè)置有帶有夾角的錐形末端，可使流道內(nèi)流體的流場分布情況良好，流道內(nèi)不存在回流現(xiàn)象，流場分布情況遠(yuǎn)好于二代測序芯片，同時集成化的多流道的設(shè)計增加了基底的支撐點，基底的變形問題幾乎可以忽略。該單分子測序芯片可以實現(xiàn)每個流道內(nèi)樣本的單獨控制，保證了樣本間無交叉污染，同時可以簡化后期數(shù)據(jù)處理工作。另外，該單分子測序芯片無需像二代測序芯片中，在每個樣本進(jìn)樣之前都要加入特定的一段序列“barcode”，以便從測序之后的生物信息分析可以識別出每個樣本。
[0032]本實用新型的有益效果包括以下幾個方面:
[0033]1、所述單分子測序芯片具有一定數(shù)目的流道，將各流道設(shè)計為較窄的流道，并且在流體進(jìn)出口均設(shè)計成錐形，有利于形成流體緩沖帶，可使流道內(nèi)流體的沖刷切換徹底，不存在流體回流區(qū)，利于生化反應(yīng)進(jìn)行；同時流道的深度又較深，使流道內(nèi)流體的流動阻力越小，可提高所述單分子測序芯片的相應(yīng)時間。
[0034]2、所述單分子測序芯片中集成化的多流道的設(shè)計增加了基底的支撐面，非常有利于減小由于負(fù)壓吸液造成的基底形變，克服了由于基底變形造成的芯片系統(tǒng)中流體的進(jìn)樣異常問題以及采集的圖像效果不佳的問題。
[0035]3、所述單分子測序芯片，采用多條并行的流道設(shè)計，各流道之間相互獨立，可以實現(xiàn)每個流道內(nèi)樣本的單獨控制，保證了樣本間無交叉污染，同時該單分子測序芯片無需像二代測序芯片中，在每個樣本進(jìn)樣之前都要加入特定的一段序列“barcode”以識別出每個樣本，簡化DNA樣品準(zhǔn)備的流程和后續(xù)的生物信息分析流程。
【附圖說明】
[0036]圖1為本實用新型的實施例1中單分子測序芯片的一剖面結(jié)構(gòu)示意圖，I為基片，21為透明基底，22為透明基底21上的間隔層，2為21與22構(gòu)成的基底層，Ib為基片I的第二表面，11為流道，12為基片的第二表面Ib連通的流體輸入孔，間隔層22對應(yīng)流道所在位置設(shè)置的腐蝕凹槽的深度用h表示；
[0037]圖2是本實用新型的實施例1中單分子測序芯片的基片的俯視結(jié)構(gòu)示意圖，I為基片，11為流道，12、13分別為流體輸入孔和流體輸出孔，111、112分別為流道相對設(shè)置的兩個側(cè)壁，113為流道的錐形末端，d表示的距離為每個流道的寬度，I表示的距離為每個流道的長度。
【具體實施方式】
[0038]以下所述是本實用新型的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本實用新型原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也視為本實用新型的保護(hù)范圍。
[0039]實施例1
[0040]本實施例的單分子測序芯片的結(jié)構(gòu)示意圖如圖1所示，結(jié)合圖1和基片的俯視結(jié)構(gòu)示意圖2 —起來看，該單分子測序芯片包括基片I和所述