本發(fā)明涉及一種碳納米材料中的碳納米片(Carbon nanosheets)的制備方法及其具有雙光子熒光成像的應(yīng)用，屬于納米技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

碳氮納米片是一種新型的碳氮材料，因為它具有獨特的化學(xué)結(jié)構(gòu)和較高的氮元素含量，已經(jīng)廣泛研究于應(yīng)用檢測金屬離子和生物電子供體或受體。Zhao等近期在先進材料(Advanced Materials)上報道了一種通過水熱法合成的有機碳氮納米片，通過加入不同金屬鹽可得到不同的金屬碳氮納米片。Liu等人在分析化學(xué)(Analytical Chemistry)雜志上報道了通過硝酸氧化法與液體去角質(zhì)法處理合成的塊狀不規(guī)則碳氮納米片聚合體得到小尺寸的碳氮納米片，且這種碳氮納米片可以與酪氨酸有效結(jié)合，產(chǎn)生一種具有熒光活性的生物碳氮納米片。Ju等人也在分析化學(xué)雜志上報道了通過三聚氰胺加聚獲得大塊石墨碳氮納米片，再用超聲波剝離處理的方法，得到2nm左右的微小碳氮納米片，同時系統(tǒng)的研究了碳氮納米片與DNA的相互作用，并設(shè)計了出碳氮納米片與DNA結(jié)合的快速均相熒光檢測。Tian等人通過均相加熱的方法，在利用硝酸與液體去角質(zhì)法，得到了1nm左右厚度的碳氮納米片，他們只對銅離子對其的淬滅作用進行了深入研究。但此方法需要在高溫下煅燒得到大塊碳氮納米片，且碳氮納米片尺寸大小不一，后處理剝?nèi)∵^程繁瑣，需要超聲處理。然而，從大塊石墨碳氮納米片上剝離的這些碳氮納米片的尺寸和厚度不是與復(fù)雜的合成方法的可控偶聯(lián)。此外，它還顯示出低的穩(wěn)定性和在水溶液中的差的分散性，這極大地限制了碳氮納米片的進一步修飾和應(yīng)用。因此，具有可控尺寸和表面性質(zhì)以及有利的親水性的均勻且穩(wěn)定的碳氮納米片的方法仍然是一個實質(zhì)性的挑戰(zhàn)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明解決的技術(shù)問題是：提出一種可以利用價格低廉的原料和簡單的制備工藝過程，得到良好水溶性的熒光碳納米片的尺寸可調(diào)的熒光碳氮納米片制備方法和應(yīng)用，所制備的熒光碳氮納米片可用于對肝癌細(xì)胞(HEPG2)，宮頸癌細(xì)胞(Hela)，神經(jīng)細(xì)胞(SH-SY5Y)進行雙光子熒光成像。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提出的技術(shù)方案是：一種尺寸可調(diào)的熒光碳氮納米片的制備方法，包括以下步驟：

采用水熱反應(yīng)的方法制備碳氮納米片：稱取1-2g聚合物分散于10-20mL去離子水中，放置在10-100mL的反應(yīng)釜內(nèi)，在反應(yīng)溫度100-240℃，高溫爐中加熱4-6小時，獲得黃色溶液；然后把反應(yīng)液倒入7000-14000透析袋內(nèi)透析，透析時間為2-4天，得到淺黃色水溶液，冷凍干燥得到淺黃色的固體粉末；所述聚合物為聚乙烯亞胺PEI或谷胱甘肽GSH。

優(yōu)選的，其中反應(yīng)溫度240℃，高溫爐中加熱6h。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提出的另一技術(shù)方案是：一種尺寸可調(diào)的熒光碳氮納米片，根據(jù)所述的尺寸可調(diào)的熒光碳氮納米片的制備方法制備而得。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提出的另一技術(shù)方案是：所述的尺寸可調(diào)的熒光碳氮納米片的應(yīng)用方法，所述的尺寸可調(diào)的熒光碳氮納米片對細(xì)胞進行雙光子熒光成像的應(yīng)用，在貼壁細(xì)胞PBS緩沖溶液中加入所述碳氮納米片溶液，孵育一定時間，進行雙光子成像。

優(yōu)選的，所述PBS緩沖溶液是含100mM K+、5mM Mg2+,pH＝7.4的緩沖溶液；所用碳氮納米片溶液的濃度為10-200μg/mL，孵化時間為2-4小時。

優(yōu)選的，PBS緩沖溶液的用量是1mL，碳氮納米片溶液的用量是10μL-50μL。

本發(fā)明的有益效果：

本發(fā)明為一種尺寸可調(diào)的水溶性熒光碳氮納米片及其制備方法和應(yīng)用，它對原有的制備方法進行了顯著的改進，通過改變溫度(100-240℃)，獲得了尺寸可調(diào)(10-100nm)和水溶性很好的熒光微型化碳氮納米片；并且所制備的碳氮納米片可以作為一種雙光子熒光成像劑，在肝癌細(xì)胞(HEPG2),宮頸癌細(xì)胞(Hela)，神經(jīng)細(xì)胞(SH-SY5Y)中都具有很好的雙光子熒光成像效果。

附圖說明

下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的作進一步說明。

圖1為實施例1中制得的碳氮納米片的透射電鏡圖(插圖部分突出顯示碳化氮粒徑分布曲線；

圖2為實施例1中制得的碳氮納米片的吸收光譜圖；

圖3為實施例1中制得的碳氮納米片的熒光光譜圖；

圖4為實施例2中制得的碳氮納米片的透射電鏡圖(插圖部分突出顯示碳化氮粒徑分布曲線)；

圖5為實施例2中制得的碳氮納米片的吸收光譜圖；

圖6為實施例2中制得的碳氮納米片的熒光光譜圖；

圖7為實施例3中制得的碳氮納米片的透射電鏡圖(插圖部分突出顯示碳化氮粒徑分布曲線)；

圖8為實施例3中制得的碳氮納米片的吸收光譜圖；

圖9為實施例3中制得的碳氮納米片的熒光光譜圖；

圖10為實施例4中制得的碳氮納米片的透射電鏡圖(插圖部分突出顯示碳化氮粒徑分布曲線)；

圖11為實施例4中制得的碳氮納米片的吸收光譜圖；

圖12為實施例4中制得的碳氮納米片的熒光光譜圖；

圖13為實施例4中制得的碳氮納米片的原子力顯微圖(圖中顯示碳化氮高度分布效果圖)；

圖14為實施例8中制得的碳氮納米片的吸收光譜圖；

圖15為實施例8中制得的碳氮納米片的熒光光譜圖；

圖16為實施例9中碳氮納米片在GPEG2細(xì)胞的雙光子熒光成像圖(圖中a1,a2,a3分別為沒有碳氮納米片時細(xì)胞的暗場，明場和疊加場成像；b1,b2,b3分別為有碳氮納米片時細(xì)胞的暗場，明場和疊加場成像)；

圖17為實施例10中碳氮納米片在Hela細(xì)胞的雙光子熒光成像圖(圖中a,b分別為沒有碳氮納米片時細(xì)胞的明場和暗場成像；c，d分別為有碳氮納米片時細(xì)胞的明場和暗場成像)；

圖18為實施例11中碳氮納米片在SH-SY5Y細(xì)胞的雙光子熒光成像圖(圖中a1,a2,a3分別為沒有碳氮納米片時細(xì)胞的暗場，明場和疊加場成像；b1,b2,b3分別為有碳氮納米片時細(xì)胞的暗場，明場和疊加場成像)；

具體實施方式

以下結(jié)合附圖對本發(fā)明的實施例作詳細(xì)說明：本實施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進行實施，給出了詳細(xì)的實施方式和過程，但本發(fā)明的保護范圍不限于下述實施例。

實施例1：稱取1g PEI分散于10mL去離子水中，放置在20mL的反應(yīng)釜內(nèi)，在反應(yīng)溫度100℃高溫爐中加熱6小時，獲得黃色溶液；然后把反應(yīng)液倒入7000-14000透析袋內(nèi)透析，透析時間為2天，如此反復(fù)5次換水透析(目的是盡量去掉反應(yīng)中殘留的聚合物，以免干擾后續(xù)的應(yīng)用)后，得到淺黃色水溶液，冷凍干燥得到淺黃色的固體粉末。加入2mL二次水而配成濃度為2mg/mL的碳氮納米片溶液，以便后續(xù)使用。濃度為2mg/mL的碳氮納米片溶液，即每毫升碳氮納米片溶液中含有2mg碳氮納米片。再進行透射電鏡測試并記錄其吸收和熒光強度，測試得到碳氮納米片的尺寸為～100nm，吸收波長365nm，發(fā)射波長460nm，分別如圖1，2，3。

實施例2：稱取1g PEI分散于10mL去離子水中，放置在20mL的反應(yīng)釜內(nèi)，在反應(yīng)溫度180℃高溫爐中加熱6小時，獲得黃色溶液；然后把反應(yīng)液倒入7000-14000透析袋內(nèi)透析，透析時間為2天，如此反復(fù)5次換水透析(目的是盡量去掉反應(yīng)中殘留的聚合物，以免干擾后續(xù)的應(yīng)用)后，得到淺黃色水溶液，冷凍干燥得到淺黃色的固體粉末。加入2mL二次水而配成濃度為2mg/mL的碳氮納米片溶液，以便后續(xù)使用。濃度為2mg/mL的碳氮納米片溶液，即每毫升碳氮納米片溶液中含有2mg碳氮納米片。再進行透射電鏡測試并記錄其吸收和熒光強度，測試得到碳氮納米片的尺寸～65nm，吸收波長365nm，發(fā)射波長460nm，分別如圖4，5，6。

實施例3：稱取1g PEI分散于10mL去離子水中，放置在20mL的反應(yīng)釜內(nèi)，在反應(yīng)溫度220℃高溫爐中加熱6小時，獲得黃色溶液；然后把反應(yīng)液倒入7000-14000透析袋內(nèi)透析，透析時間為2天，如此反復(fù)5次換水透析(目的是盡量去掉反應(yīng)中殘留的聚合物，以免干擾后續(xù)的應(yīng)用)后，得到淺黃色水溶液，冷凍干燥得到淺黃色的固體粉末。加入2mL二次水而配成濃度為2mg/mL的碳氮納米片溶液，以便后續(xù)使用。濃度為2mg/mL的碳氮納米片溶液，即每毫升碳氮納米片溶液中含有2mg碳氮納米片。再進行透射電鏡測試并記錄其吸收和熒光強度，測試得到碳氮納米片的尺寸～45nm，吸收波長365nm，發(fā)射波長455nm，分別如圖7，8，9。

實施例4：稱取1g PEI分散于10mL去離子水中，放置在20mL的反應(yīng)釜內(nèi)，在反應(yīng)溫度240℃高溫爐中加熱6小時，獲得黃色溶液；然后把反應(yīng)液倒入7000-14000透析袋內(nèi)透析，透析時間為2天，如此反復(fù)5次換水透析(目的是盡量去掉反應(yīng)中殘留的聚合物，以免干擾后續(xù)的應(yīng)用)后，得到淺黃色水溶液，冷凍干燥得到淺黃色的固體粉末。加入2mL二次水而配成濃度為2mg/mL的碳氮納米片溶液，以便后續(xù)使用。濃度為2mg/mL的碳氮納米片溶液，即每毫升碳氮納米片溶液中含有2mg碳氮納米片。再進行透射電鏡測試、原子力顯微鏡測試、紫外可見光譜、熒光分光光度計，測試得到碳氮納米片的尺寸～20nm、吸收波長330nm、發(fā)射波長450nm和高度0.5-1.5nm，分別如圖10，11，12，13，此溫度下得到的碳化氮熒光強度最高，尺寸最小且分布最均一。

實施例5：稱取2g PEI分散于10mL去離子水中，放置在20mL的反應(yīng)釜內(nèi)，在反應(yīng)溫度240℃高溫爐中加熱6小時，獲得黃色溶液；然后把反應(yīng)液倒入7000-14000透析袋內(nèi)透析，透析時間為2天，如此反復(fù)5次換水透析(目的是盡量去掉反應(yīng)中殘留的聚合物，以免干擾后續(xù)的應(yīng)用)后，得到淺黃色水溶液，冷凍干燥得到淺黃色的固體粉末。加入2mL二次水而配成濃度為2mg/mL的碳氮納米片溶液，以便后續(xù)使用。濃度為2mg/mL的碳氮納米片溶液，即每毫升碳氮納米片溶液中含有2mg碳氮納米片。

實施例6：稱取1g PEI分散于20mL去離子水中，放置在20mL的反應(yīng)釜內(nèi)，在反應(yīng)溫度240℃高溫爐中加熱6小時，獲得黃色溶液；然后把反應(yīng)液倒入7000-14000透析袋內(nèi)透析，透析時間為2天，如此反復(fù)5次換水透析(目的是盡量去掉反應(yīng)中殘留的聚合物，以免干擾后續(xù)的應(yīng)用)后，得到淺黃色水溶液，冷凍干燥得到淺黃色的固體粉末。加入2mL二次水而配成濃度為2mg/mL的碳氮納米片溶液，以便后續(xù)使用。濃度為2mg/mL的碳氮納米片溶液，即每毫升碳氮納米片溶液中含有2mg碳氮納米片。

實施例7：稱取1g PEI分散于10mL去離子水中，放置在20mL的反應(yīng)釜內(nèi)，在反應(yīng)溫度240℃高溫爐中加熱4小時，獲得黃色溶液；然后把反應(yīng)液倒入7000-14000透析袋內(nèi)透析，透析時間為2天，如此反復(fù)5次換水透析(目的是盡量去掉反應(yīng)中殘留的聚合物，以免干擾后續(xù)的應(yīng)用)后，得到淺黃色水溶液，冷凍干燥得到淺黃色的固體粉末。加入2mL二次水而配成濃度為2mg/mL的碳氮納米片溶液，以便后續(xù)使用。濃度為2mg/mL的碳氮納米片溶液，即每毫升碳氮納米片溶液中含有2mg碳氮納米片。

實施例8：稱取1g谷胱甘肽GSH分散于15mL去離子水中，放置在100mL的反應(yīng)釜內(nèi)，在反應(yīng)溫度240℃高溫爐中加熱6小時，獲得黃色溶液；然后把反應(yīng)液倒入7000-14000透析袋內(nèi)透析，透析時間為2天，如此反復(fù)5次換水透析(目的是盡量去掉反應(yīng)中殘留的聚合物，以免干擾后續(xù)的應(yīng)用)后，得到淺黃色水溶液，冷凍干燥得到淺黃色的固體粉末。加入2mL二次水而配成濃度為2mg/mL的碳氮納米片溶液，以便后續(xù)使用。濃度為2mg/mL的碳氮納米片溶液，即每毫升碳氮納米片溶液中含有2mg碳氮納米片，再記錄其吸收和熒光強度，吸收波長365nm，發(fā)射波長455nm，分別如圖14，15。

實施例9：在培養(yǎng)好貼壁細(xì)胞(HEGP2)的培養(yǎng)皿中加入PBS緩沖溶液(10mM Mg²⁺，50mM K⁺，pH＝7.4)1mL，再加入實施例4獲得的碳氮納米片溶液100μL(2mg/mL)到培養(yǎng)皿中，孵育2小時后，使用新鮮的PBS緩沖溶液沖洗兩次，放置于雙光子共聚焦熒光顯微鏡下成像，得到碳氮納米片在HEGP2細(xì)胞中的雙光子成像圖片(激發(fā)波長為750nm，發(fā)射熒光收集范圍400-500nm)。如圖16。

實施例10：在培養(yǎng)好貼壁細(xì)胞(Hela)的培養(yǎng)皿中加入PBS緩沖溶液(10mM Mg²⁺，50mM K⁺，pH＝7.4)1mL，再加入實施例4獲得的碳氮納米片溶液100μL(2mg/mL)到培養(yǎng)皿中，孵育2小時后，使用新鮮的PBS緩沖溶液沖洗兩次，放置于雙光子共聚焦熒光顯微鏡下成像，得到碳氮納米片在Hela細(xì)胞中的雙光子成像圖片(激發(fā)波長為750nm，發(fā)射熒光收集范圍400-500nm)，如圖17。

實施例11：在培養(yǎng)好貼壁細(xì)胞(SH-SY5Y)的培養(yǎng)皿中加入PBS緩沖溶液(10mM Mg²⁺，50mM K⁺，pH＝7.4)1mL，再加入實施例4獲得的碳氮納米片溶液100μL(2mg/mL)到培養(yǎng)皿中，孵育2小時后，使用新鮮的PBS緩沖溶液沖洗兩次，放置于雙光子共聚焦熒光顯微鏡下成像，得到碳氮納米片在SH-SY5Y細(xì)胞中的雙光子成像圖片(激發(fā)波長為750nm，發(fā)射熒光收集范圍400-500nm)，如圖18。