一種水不溶性天然黑色素的提取方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于黑色素提取分離和加工技術(shù)領(lǐng)域，適用于植物源、微生物源和大部分動物源水不溶性黑色素的生產(chǎn)與加工，特別適合于水不溶性黑色素的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]黑色素(melanin)是一類結(jié)構(gòu)復(fù)雜多樣的酚類或吲哚類生物大分子色素家族的總稱。在自然界中，廣泛存在于生物圈、巖石圈、水圈、大氣圈以及宇宙星際。在生物圈中，黑色素在動物、高等植物和微生物體內(nèi)都有分布，但并不是黑顏色的色素，也有紅、橙、黃、綠、藍(lán)等顏色的黑色素存在。由于現(xiàn)今的生物化學(xué)和生物物理學(xué)等技術(shù)無法對這類生物大分子提供一個化學(xué)結(jié)構(gòu)式，因此黑色素尚無一個嚴(yán)格的定義。黑色素按顏料來定義的化學(xué)標(biāo)準(zhǔn)包括黑色，通常不溶于水和常見的有機(jī)溶劑，可被氧化劑漂白以及阻抗?jié)馑峤到?；按高分子定義的另一個標(biāo)準(zhǔn)是它們的自由基特性。
[0003]黑色素通常為無定型非均勻性的大分子物質(zhì)，其組成不僅與單體單元有關(guān)，而且還與聚合過程中的環(huán)境條件有關(guān)。按照意大利化學(xué)家Nicolaus的觀點，可將黑色素分成真黑色素、棕黑色素和異黑色素三類:(I)真黑色素(eumelanins):主要呈黑色或棕色的含氮色素，不含硫原子；(2)棕黑色素(phaeomelanins):顏色較真黑色素淺，含氮和硫原子，常呈棕色、紅色甚至黃色；(3)異黑色素(allomelanins)，常呈黑色或棕色，主要存在于植物和微生物中。然而，無論何種黑色素，其在水、有機(jī)和無機(jī)溶劑中溶解度差，甚至不溶，但都一般溶于稀堿溶液，有較強(qiáng)的氧化還原、光吸收、螯合金屬離子、離子交換、自由基(清除或產(chǎn)生)、光電導(dǎo)性、導(dǎo)電性和半導(dǎo)體性質(zhì)等特性，因此，除了作為色素外，其本身還具有多種生物功能，如:為生物體提供結(jié)構(gòu)性強(qiáng)度；抗輻射；對光受體產(chǎn)生屏蔽，且具有維持體溫平衡的作用；作為化學(xué)保護(hù)色素行使功能，保護(hù)生物體免受抗生素或其他藥物以及重金屬等有毒物質(zhì)的傷害；可對能量進(jìn)行吸收、保持、儲存和轉(zhuǎn)換；可作為偽裝或性展示的裝飾，并改善視覺效果，還是性成熟信號和引誘物。
[0004]基于其特殊性質(zhì)，黑色素有著重要的應(yīng)用價值。在醫(yī)藥領(lǐng)域，黑色素可用于抗病毒；抑制HIV病毒；治療著色性干皮病、帕金森氏癥、老年癡呆癥、亨延氏舞蹈病等神經(jīng)系統(tǒng)疾??；可提高抗輻射能力，減少皮膚癌的發(fā)生；可抗毒解毒，如毒蛇咬傷急救；有效降低肼及其衍生物對肝臟的損傷和化療藥物順鉬對腎臟的毒害；有效降低或防止止痛藥醋氨酚(acetaminophen)的毒性；有效預(yù)防“世紀(jì)之毒”戴奧辛(D1xins)對肝臟、胸腺及脾臟的傷害；可提高免疫力；可用作磁共振成像造影劑；可作為抗癌藥物和癌癥的光動力學(xué)治療。在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域，黑色素可用于某些紫外線敏感的生物體的保護(hù)劑，如可作為占據(jù)生物農(nóng)藥90%市場份額的蘇云金芽孢桿菌殺蟲制劑的保護(hù)劑；在畜牧獸醫(yī)方面用于抗痢疾治療和脅迫-保護(hù)治療；作為特種塑料和特種玻璃的著色劑；可除去來自于被污染水體和土壤中的酚類污染物和重金屬。在工業(yè)領(lǐng)域，黑色素具有很強(qiáng)的金屬螯合特性，在工業(yè)方面可用于提取貴重金屬。在化妝品領(lǐng)域，黑色素已被廣泛應(yīng)用于化妝品的生產(chǎn)，開發(fā)出的產(chǎn)品主要有睫毛膏、眼線筆、防曬霜、洗發(fā)劑、染發(fā)劑、白癲風(fēng)遮蔽劑等。在其他方面，黑色素具有明顯的光電導(dǎo)性和很高的電傳導(dǎo)能力，還是生物體內(nèi)唯一的一類無定形的半導(dǎo)體物質(zhì)，在生物電子領(lǐng)域有著很大的開發(fā)利用價值；與很多疾病有關(guān)，對病理學(xué)研究也有著重要的意義。
[0005]綜上所述，黑色素是一種具有廣闊應(yīng)用前景的潛在生物資源，將其充分開發(fā)，市場推廣前景十分廣闊。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供一種利用動物、植物和微生物等生物資源提取水不溶性黑色素的方法。
[0007]本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
[0008]I)選取干燥、無霉變且具有黑色種皮的葵花籽，剝?nèi)∠蛉湛褮?，粉碎?0?60目；
[0009]2)將其與0.1?2.0moI/L NaOH按重量體積比為1:10?1:20混合，40?80°C水浴中2?10h，冷卻至10?30°C，5000?20000rpm離心10?30min，上清液為黑色素粗提液；
[0010]3)用1.0?5.0mo/L HCl調(diào)節(jié)步驟2)中的黑色素粗提液pH值介于1.0?3.0之間，黑色素沉淀，室溫靜置2.0?6.0h，離心分離，所得沉淀為黑色素粗提物；
[0011]4)將步驟3)獲得的黑色素粗提物懸浮于重量體積比為1:10?1:15的5.0?7.0moI/L HCl中，沸水浴2.0?6.0h，冷卻，5000?20000rpm離心10?30min，去除上清液，收集沉淀的黑色素固體顆粒；
[0012]5)將步驟4)中獲得固體顆粒按順序用95%乙醇、乙酸乙酯、丙酮洗滌。每次黑色素顆粒與溶劑的重量體積比為1:10?1:30，混合，振蕩，離心分離，每種溶劑重復(fù)洗滌直至上清液無色為止；
[0013]6)經(jīng)過步驟5)洗滌后的黑色素顆粒用0.01?0.2mol/L10?50ml NaOH重新溶解，離心除去未溶解部分，然后用0.1?1.0mol/L HCl調(diào)節(jié)pH值介于1.0?3.0之間，靜置2h?過夜，5000?20000rpm離心10?30min，取沉淀；
[0014]7)取步驟6)中產(chǎn)生的沉淀用雙蒸水重新懸浮，之后用0.1?2mol/L NaOH調(diào)節(jié)沉淀物水溶液至PH值介于10?12.0，黑色素溶解，離心，取上清液用0.1?2.0moI/L調(diào)節(jié)PH值介于1.0?3.0之間，使黑色素沉淀，去除上清液；
[0015]8)反復(fù)步驟7)，直至上清液為無色，即獲得純化的黑色素。
[0016]本發(fā)明具有以下的技術(shù)效果:
[0017]1.本發(fā)明方法提取的黑色素收率高，最高達(dá)10.00%以上；
[0018]2.采用超聲波或者微波輔助提取，能破壞提取原料細(xì)胞膜，使溶液能快速滲透到細(xì)胞中，加速有效成分的浸出，降低堿性溶液用量，極大地加大了收率，具有時間短，提取率聞;
[0019]3.利用本法可實現(xiàn)高純度水不溶性黑色素的提取，可操作性強(qiáng)，成本低，可實現(xiàn)規(guī)模性提取，使向日葵籽殼中的黑色素能夠充分開發(fā)利用，提升其經(jīng)濟(jì)價值；
[0020]4.采用堿提酸沉法得到的最終產(chǎn)物具有選擇性高，無污染，工藝重復(fù)性高等優(yōu)點。
具體實施方案
[0021]實施例1
[0022]I)選取干燥、無霉變且具有黑色種皮的葵花籽殼，剝?nèi)】ㄗ褮ぃ鬯槌?0目；
[0023]2)將其與0.5mol/L NaOH按重量體積比為1:15 (g/ml)混合，70°C水浴2h，冷卻至室溫，20000rpm離心20min，上清液為黑色素粗提液；
[0024]3)用lmo/L HCl調(diào)節(jié)步驟2)中的黑色素粗提液pH值為2.0，黑色素沉淀，室溫靜置2h，離心分離，所得沉淀為黑色素粗提物；
[0025]4)將步驟3)獲得的黑色素粗提物懸浮于重量體積比為1:10 (g/ml)的6mol/L HCl中，沸水浴2h，冷卻至室溫，1000rpm離心30min，去除上清液，收集沉淀的黑色素固體顆粒;
[0026]5)將步驟4)中獲得固體顆粒按順序用95%乙醇、乙酸乙酯、丙酮洗滌。每次黑色素顆粒與溶劑的重量體積比為1:10 (g/ml)混合，振蕩，離心分離，每種溶劑重復(fù)洗滌3?5次，直至上清液無色為止；
[0027]6)經(jīng)過步驟5)洗滌后的黑色素顆粒用20ml0.lmol/L NaOH重新溶解，離心除去未溶解部分，然后用lmol/L HCl調(diào)節(jié)pH值為2.0，靜置4.0h, 20000rpm離心20min,取沉淀；
[0028]7)取步驟6)中產(chǎn)生的沉淀用20ml雙蒸水重新懸浮，之后用lmol/L NaOH調(diào)節(jié)沉淀物水溶液至PH值為11.0,黑色素溶解，離心，取上清液用lmol/L HCl調(diào)節(jié)pH值為2.0，使黑色素沉淀，去除上清液；
[0029]8)反復(fù)步驟7)3?5次，直至上清液為無色，即獲得純化的黑色素，得率為7.03%。
[0030]實施例2
[0031]I)選取干燥、無霉變且具有黑色種皮的葵花籽殼，剝?nèi)】ㄗ褮?，粉碎?0目；
[0032]2)將其與0.lmol/L NaOH按重量體積比為1:15 (g/ml)混合，60°C水浴3h，冷卻至室溫，1000rpm離心30min，上清液為黑色素粗提液；
[0033]3)用lmo/L HCl調(diào)節(jié)步驟2)中的黑色素粗提液pH值為2.0，黑色素沉淀，室溫靜置2h，離心分離，所得沉淀為黑色素粗提物；
[0034]4)將步驟3)獲得的黑色素粗提物懸浮于重量體積比為1:15 (g/ml)的6mol/L HCl中，沸水浴2h，冷卻至室溫，1000rpm離心30min，去除上清液，收集沉淀的黑色素固體顆粒;
[0035]5)將步驟4)中獲得固體顆粒按順序用95%乙醇、乙酸乙酯、丙酮洗滌。每次黑色素顆粒與溶劑的重量體積比為1:15 (g/ml)混合，振蕩，離心分離，每種溶劑重復(fù)洗滌3?5次，直至上清液無色為止；
[0036]6)經(jīng)過步驟5)洗滌后的黑色素顆粒用15ml0.lmol/L NaOH重新溶解，離心除去未溶解部分，然后用lmol/L HCl調(diào)節(jié)pH值為2.0，靜置2.0h, 20000rpm離心20min,取沉淀；
[0037]7)取步驟6)中產(chǎn)生的沉淀用15ml雙蒸水重新懸浮，之后用lmol/L NaOH調(diào)節(jié)沉淀物水溶液至PH值為11.0,黑色素溶解，離心，取上清液用lmol/L調(diào)節(jié)pH值為2.0,使黑色素沉淀，去除上清液。
[0038]8)反復(fù)步驟7)3?5次，直至上清液為無色，即獲得純化的黑色素，得率為
6.06%ο
[0039]實施例3
[0040]I)選取干燥、無霉變且具有黑色種皮的葵花籽殼，剝?nèi)】ㄗ褮?，粉碎?0目；[0041 ] 2)將其與0.3mol/L NaOH溶液按重量體積比為1:20 (g/ml)混合，60°C水浴2h，冷卻至室溫，1000rpm離心20min，上清液為黑色素粗提液；
[0042]3)用lmo/L HCl調(diào)節(jié)步驟2)中的黑色素粗提液pH值為2.5，黑色素沉淀，室溫靜置6h，離心分離，所得沉淀為黑色素粗提物；
[0043]4)將步驟3)獲得的黑色素粗提物懸浮于重量體積比為1:10 (g/ml)的6mol/L HCl中，沸水浴2h，冷卻至室溫，1000rpm離心lOmin，去除上清液，收集沉淀的黑色素固體顆粒;
[0044]5)將步驟4)中獲得固體顆粒按順序用95%乙醇、乙酸乙酯、丙酮洗滌。每次黑色素顆粒與溶劑的重量體積比為1:10 (g/ml)混合，振蕩，離心分離，每種溶劑重復(fù)洗滌3?5次，直至上清液無色為止；
[0045]6)經(jīng)過步驟5)洗滌后的黑色素顆粒用1ml0.lmol/L NaOH重新溶解，離心除去未溶解部分，然后用lmol/L HCl調(diào)節(jié)pH值為2.0，靜置2.0h, 20000rpm離心20min,取沉淀；
[0046]7)取步驟6)中產(chǎn)生的沉淀1ml用雙蒸水重新懸浮,之后用lmol/L NaOH調(diào)節(jié)沉淀物水溶液至PH值為11.0,黑色素溶解，離心，取上清液用lmol/L溶液調(diào)節(jié)pH值為2.0，使黑色素沉淀，去除上清液；
[0047]8)反復(fù)步驟7)3?5次，直至上清液為無色，即獲得純化的黑色素，得率為
5.99%。
[0048]實施例4
[0049]I)選取干燥、無霉變且具有黑色種皮的葵花籽殼，剝?nèi)】ㄗ褮?，粉碎?0目；
[0050]2)將其與0.3mol/L NaOH按重量體積比為1:15 (g/ml)混合