一種基于多糖接枝聚天冬氨酸芐酯構(gòu)建可降解藥物載體的方法
【專利摘要】一種基于多糖接枝聚天冬氨酸芐酯構(gòu)建可降解藥物載體的方法。本發(fā)明公開了非病毒藥物載體【技術(shù)領(lǐng)域】的基于多糖(包括環(huán)糊精、葡聚糖、殼聚糖、普羅蘭等)接枝天冬氨酸構(gòu)建一系列具有低毒、高效且可降解等優(yōu)異性能的功能化陽(yáng)離子藥物載體的方法。本方法簡(jiǎn)單易行，具有分子量可調(diào)控性；通過(guò)酰胺鍵的降解促進(jìn)了藥物的釋放，通過(guò)芐基胺解實(shí)現(xiàn)了藥物載體的功能化，并且為進(jìn)行host-gest提供了條件。通過(guò)本方法構(gòu)建的陽(yáng)離子藥物載體在COS7、HepG2、C6、Hella、HEK293、A549等細(xì)胞中具有高于金標(biāo)PEI的轉(zhuǎn)染效率，具有商業(yè)化潛力。
【專利說(shuō)明】一種基于多糖接枝聚天冬氨酸芐酯構(gòu)建可降解藥物載體的 方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于非病毒藥物載體【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及了一種基于天然多糖接枝聚天冬 氨酸芐酯構(gòu)建可降解功能化陽(yáng)離子藥物載體的方法，其中包括環(huán)糊精、葡聚糖、殼聚糖、普 羅蘭等。

【背景技術(shù)】
[0002] 隨著人類生活水平的提高和環(huán)境污染的日益加劇，癌癥和心腦血管疾病發(fā)病率越 來(lái)越高，嚴(yán)重威脅人類的健康?；蛑委熢诠タ巳祟惣膊?、先天性遺傳疾病以及心腦血管疾 病方面起著越來(lái)越重要的作用，將成為醫(yī)療領(lǐng)域攻克重大疾病的主力軍?；蛑委煱?的基因的尋找、基因載體的研制以及目的基因在細(xì)胞中的特異性表達(dá)三個(gè)重要方面?；?導(dǎo)入系統(tǒng)是基因治療的核心技術(shù)，缺乏安全而高效的基因載體是目前制約基因治療實(shí)施的 主要瓶頸。
[0003] 基因載體是目的基因進(jìn)入革巴細(xì)胞的工具，是目的基因在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的如提和基 礎(chǔ)。應(yīng)用于基因治療的載體主要分為病毒載體（viral vector)和非病毒載體（non-viral vector)兩類。病毒載體主要包括逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺相關(guān)病毒及單純皰疹病毒。病毒 載體可以克服細(xì)胞屏障和免疫防御機(jī)制具有較高的轉(zhuǎn)染效率，但是缺乏安全性，可能引起 致癌作用與自身免疫反應(yīng)（unexpected immune response)和白細(xì)胞的病毒變化，嚴(yán)重時(shí)會(huì) 造成病人多器官衰竭導(dǎo)致死亡。病毒載體還可能會(huì)引起插入突變的現(xiàn)象，從而導(dǎo)致宿主細(xì) 胞的惡行轉(zhuǎn)化，此外病毒載體攜帶DNA的能力有限，不利于大規(guī)模的生產(chǎn)。與病毒性載體相 t匕，非病毒載體安全性高，并且具有低免疫原性。雖然其無(wú)法克服細(xì)胞內(nèi)外的各種屏障，轉(zhuǎn) 染效率低于病毒性基因載體，但是具有能夠攜帶大量DNA分子、容易大批量生產(chǎn)及費(fèi)用低 廉等顯著優(yōu)點(diǎn)，具有良好的發(fā)展?jié)摿?，因此基因載體領(lǐng)域的研究者把目光投向人工合成的 非病毒載體，致力于合成轉(zhuǎn)染效率高且毒性低的非病毒載體。陽(yáng)離子聚合物是目前研究最 廣泛的人工合成非病毒載體。陽(yáng)離子聚合物能夠自發(fā)與帶負(fù)電荷的基因通過(guò)電荷相互作 用，可形成帶正電荷納米級(jí)的復(fù)合體（complex)，從而協(xié)助基因穿過(guò)帶負(fù)電的細(xì)胞膜有效避 免質(zhì)粒被核酸酶降解，保證目的基因順利表達(dá)。
[0004] 隨著高分子科學(xué)、醫(yī)學(xué)、生物學(xué)以及工程學(xué)等多門學(xué)科的相互交融、相互滲透和迅 速發(fā)展，高分子基因載體材料進(jìn)入一個(gè)快速發(fā)展的時(shí)期。目前，文獻(xiàn)中報(bào)道一系列非病毒陽(yáng) 離子聚合物載體，包括聚-L-賴氨酸（poly (L-Iysine)，PLL)、聚乙二胺樹枝狀聚合物（poly (amidoamine), PAMAM)、聚甲基丙烯酸 N，N-二甲氛基乙酯（poly(2_dimethylaminoethyl methacrylate), PDMAEMA)、聚乙烯亞胺（polyethylenimine, PEI)等。其中 PEI 具有較 高的轉(zhuǎn)染效率，是陽(yáng)離子非病毒載體中公認(rèn)的"金標(biāo)"。但是上述陽(yáng)離子聚合物仍具有相 當(dāng)高的毒性，大大限制了它們的應(yīng)用。因此，開發(fā)低毒而高效陽(yáng)離子聚合物是研究非病 毒基因載體的核心內(nèi)容。為了降低毒性，目前一種思路是在陽(yáng)離子聚合物中引入聚乙二 醇（PEG)等生物相容性成份，另一種思路是多糖陽(yáng)離子化，包括殼聚糖（chitosan)、環(huán)糊 精（cyclodextrin)、葡聚糖（dextran)、普羅蘭等。但是上述報(bào)道的非病毒載體的安全性 和轉(zhuǎn)染效率還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足實(shí)際應(yīng)用的要求。當(dāng)前，已經(jīng)商品化的基因載體只有脂質(zhì)體 lipfect2000,但其成本昂貴，無(wú)法成為癌癥患者的選擇，難以應(yīng)用于臨床治療。
[0005] 多糖廣泛存在于自然界中具有無(wú)毒、極好的生物相容、生物可降解、可再生等特 性，并且在免疫調(diào)節(jié)和抗病毒抗癌方面有著出色的表現(xiàn)，非常實(shí)用于制備藥物釋控體系。以 天然多糖為基質(zhì)，接枝陽(yáng)離子聚合物仍可以保持高的轉(zhuǎn)然效率。在眾多的多糖骨架中，現(xiàn)如 今研究最多的是殼聚糖、葡聚糖、環(huán)糊精、普羅蘭、明膠、纖維素、淀粉等一系列多糖。葡聚糖 (Dextran)作為一種多糖在免疫調(diào)節(jié)、抗輻射、調(diào)節(jié)腸胃、幫助組織結(jié)構(gòu)再生或修復(fù)、促進(jìn)傷 口愈合及預(yù)防心腦血管和糖尿病等方面均具有突出表現(xiàn)，對(duì)肝炎、腫瘤、心血管、糖尿病、降 血脂、抗衰老等方面均有獨(dú)特的生物活性。其特有的靶向性特點(diǎn)，能鎖定休眠期、耐藥性及 亞臨床病灶的"殘存病毒細(xì)胞"，從而"同步"減毒增效，極大限度的保障臨床治療效果。同 時(shí)，葡聚糖可以快速激活機(jī)體自身的免疫監(jiān)管和識(shí)別機(jī)制，從而增強(qiáng)它們的戰(zhàn)斗力，使自身 免疫系統(tǒng)達(dá)到最佳平衡狀態(tài)，保持肌體的健康。普羅蘭多糖（Pullulan)是一種由出芽短梗 霉發(fā)酵所產(chǎn)生的類似葡聚糖、黃原膠的胞外水溶性粘質(zhì)多糖，它除了具備其他多糖所具有 的優(yōu)點(diǎn)之外，其本身帶有一定的腫瘤靶性，因而近幾年在廣泛應(yīng)用于腫瘤治療方面的研究。 環(huán)糊精（Cyclodextrin，簡(jiǎn)稱CD)是直鏈淀粉在由芽孢桿菌產(chǎn)生的環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶 作用下生成的一系列環(huán)狀低聚糖的總稱，通常含有6?12個(gè)D-吡喃葡萄糖單元。環(huán)糊精 分子具有略呈錐形的中空?qǐng)A筒立體環(huán)狀結(jié)構(gòu)，在其空洞結(jié)構(gòu)中，外側(cè)上端（較大開口端）由 C2和C3的仲羥基構(gòu)成，下端（較小開口端）由C6的伯羥基構(gòu)成，具有親水性，而空腔內(nèi)由 于受到C-H鍵的屏蔽作用形成了疏水區(qū)。
[0006] 乙二胺（Ethylenediamine，ED)無(wú)色或微黃色黏稠液體，有類似氨的氣味，呈強(qiáng)堿 性。陽(yáng)離子藥物載體攜帶DNA的能力隨分子量的增大而增大，但同時(shí)毒性也在增大從而限 制了轉(zhuǎn)染效率。因此，發(fā)展可降解陽(yáng)離子載體具有十分重大的意義。除了可生物降解的基 于PLL、PAA和甲基丙烯酸酯的大分子，各種其它可降解的化合物也已經(jīng)合成并用于研究基 因轉(zhuǎn)染。其中包括聚（氨基酸），聚（氨基酯）和含磷基的聚合物。聚氨基酸被廣泛的應(yīng)用 于生物醫(yī)用領(lǐng)域，這得益于它們的低毒性，良好的生物相容性和生物降解性。特別是聚天冬 氨酸，被廣泛的用于制備納米顆粒、膠束、納米膠囊和生物膜，用來(lái)作為藥物載體材料。
[0007] 盡管天然多糖及聚天冬氨酸已被廣泛應(yīng)用于藥物載體領(lǐng)域，有了很多研究成果， 但基于天然多糖接枝聚天冬氨酸基構(gòu)建可降解功能化陽(yáng)離子載體目前還沒(méi)有報(bào)道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的是提供一種基于天然多糖接枝聚天冬氨酸構(gòu)建可降解功能化陽(yáng)離 子藥物載體的方法。該方法利用具有無(wú)毒、極好的生物相容、生物可降解、可再生等優(yōu)良性 能的包括環(huán)糊精、葡聚糖、殼聚糖以及普羅蘭在內(nèi)天然多糖接枝降解性能優(yōu)良的聚天冬氨 酸作為基體，既可以通過(guò)芐酯進(jìn)行胺解、組裝又可以通過(guò)環(huán)糊精空腔與其它分子進(jìn)行組裝， 從而實(shí)現(xiàn)天然多糖接枝聚天冬氨酸基可降解藥物載體的功能化，具有商業(yè)化潛力。
[0009] 本發(fā)明的反應(yīng)體系中，引發(fā)劑的合成從多糖本體開始，激活多糖本體上的官能團(tuán) 羥基，將乙二胺與激活的官能團(tuán)反應(yīng)，使得乙二胺接入到多糖本體上作為大分子引發(fā)劑的 引發(fā)點(diǎn)，得到多糖大分子引發(fā)劑。然后通過(guò)開環(huán)聚合（ring-opening)引發(fā)天冬氨酸節(jié)酯單 體聚合得到天然多糖接枝聚天冬氨酸基體，對(duì)所得的基體或通過(guò)與各種二胺的反應(yīng)形成陽(yáng) 離子藥物載體，或與其它陽(yáng)離子小分子進(jìn)行組裝形成功能化陽(yáng)離子藥物載體。功能性陽(yáng)離 子的引入：一是利用胺解同樣的原理，直接采用或通過(guò)化學(xué)反應(yīng)使帶有功能性基團(tuán)的物質(zhì) 帶上胺基，轉(zhuǎn)化為胺解反應(yīng)。另一種是利用芐基或者引進(jìn)環(huán)糊精空腔與功能性陽(yáng)離子進(jìn)行 自組裝。
[0010] 本發(fā)明所述的基于多糖接枝聚天冬氨酸芐酯構(gòu)建可降解藥物載體的方法，其具體 反應(yīng)條件為：
[0011] 1)聚合反應(yīng)：該聚合反應(yīng)體系由多糖大分子引發(fā)劑、有機(jī)溶劑、單體組成；多糖大 分子引發(fā)劑上的胺基、有機(jī)溶劑、單體之間的摩爾比為（1:0.01:10)-(1:0.07 :100)反應(yīng)溫 度為40-50°C ;無(wú)水無(wú)氧環(huán)境下反應(yīng)3-5天；反應(yīng)完成后用乙醚或丙酮沉淀直到形貌變?yōu)?固體，最后放入真空干燥箱抽干除去乙醚或丙酮得到多糖接枝聚天冬氨酸β-芐酯基聚合 物；
[0012] 2)將步驟1)中初步得到的多糖接枝聚天冬氨酸β -芐酯基聚合物的芐基與含 兩個(gè)及以上氨基的胺類化合物按摩爾比為1:8-1:14溶于二甲基亞砜或吡咯烷酮中進(jìn)行胺 解反應(yīng)，多糖接枝聚天冬氨酸β-芐酯基聚合物與二甲基亞砜質(zhì)量比為多 糖接枝聚天冬氨酸β_芐酯基聚合物與吡咯烷酮質(zhì)量比為（1:10)-(1:20);反應(yīng)溫度為室 溫，無(wú)氧無(wú)水條件下反應(yīng)10-12小時(shí)；同樣反應(yīng)完成后用乙醚或丙酮沉淀直到形貌變?yōu)楣?體，放入真空干燥箱抽干除去乙醚或丙酮，然后將產(chǎn)物溶解在水中，加水量與產(chǎn)物的比例為 100-300ml/g，產(chǎn)物溶解后放入截留分子量為7000MW的透析袋中，在去離子水中透析；最后 將透析袋中的產(chǎn)物冷凍干燥直至除去所有水分即得基于多糖接枝聚天冬氨酸芐酯構(gòu)建的 可降解藥物載體；
[0013] 步驟1)中各組分加入順序?yàn)椋合葘⒍嗵谴蠓肿右l(fā)劑和單體分別溶于有機(jī)溶劑， 然后混合進(jìn)行聚合反應(yīng)。
[0014] 所述的多糖大分子引發(fā)劑的結(jié)構(gòu)式如下：
[0015]

【權(quán)利要求】
1. 一種基于多糖接枝聚天冬氨酸芐酯構(gòu)建可降解藥物載體的方法，其特征在于，其具 體反應(yīng)條件為： 1) 聚合反應(yīng)：該聚合反應(yīng)體系由多糖大分子引發(fā)劑、有機(jī)溶劑、單體組成；多糖大分子 引發(fā)劑上的胺基、有機(jī)溶劑、單體之間的摩爾比為（1:0.01:10)-(1:0.07 :100)反應(yīng)溫度為 40-50°C;無(wú)水無(wú)氧環(huán)境下反應(yīng)3-5天；反應(yīng)完成后用乙醚或丙酮沉淀直到形貌變?yōu)楣腆w， 最后放入真空干燥箱抽干除去乙醚或丙酮得到多糖接枝聚天冬氨酸β-芐酯基聚合物； 2) 將步驟1)中初步得到的多糖接枝聚天冬氨酸β_芐酯基聚合物的芐基與含兩個(gè) 及以上氨基的胺類化合物按摩爾比為1:8-1:14溶于二甲基亞砜或吡咯烷酮中進(jìn)行胺解 反應(yīng)，多糖接枝聚天冬氨酸β-芐酯基聚合物與二甲基亞砜質(zhì)量比為（1:7)-(1:11)，多糖 接枝聚天冬氨酸β-芐酯基聚合物與吡咯烷酮質(zhì)量比為（1:10)-(1:20);反應(yīng)溫度為室 溫，無(wú)氧無(wú)水條件下反應(yīng)10-12小時(shí)；同樣反應(yīng)完成后用乙醚或丙酮沉淀直到形貌變?yōu)楣?體，放入真空干燥箱抽干除去乙醚或丙酮，然后將產(chǎn)物溶解在水中，加水量與產(chǎn)物的比例為 100-300ml/g，產(chǎn)物溶解后放入截留分子量為7000MW的透析袋中，在去離子水中透析；最后 將透析袋中的產(chǎn)物冷凍干燥直至除去所有水分即得基于多糖接枝聚天冬氨酸芐酯構(gòu)建的 可降解藥物載體。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟1)中各組分加入順序?yàn)椋合葘⒍嗵?大分子引發(fā)劑和單體分別溶于有機(jī)溶劑，然后混合進(jìn)行聚合反應(yīng)。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的多糖大分子引發(fā)劑的結(jié)構(gòu)式如下：
R為多糖的羥基被取代后的骨架結(jié)構(gòu)，F(xiàn)為含兩個(gè)及以上氨基的胺類化合物，η=1-40 ;多糖為分子量6000-25000的葡聚糖、分子量為900-1200的環(huán)糊精、分子量為4000-20000 的殼聚糖、分子量為8000-20000的普羅蘭；所述的單體為天冬氨酸β-芐酯N-羰基內(nèi)酸 酐；所述的有機(jī)溶劑選自亞砜類、酰胺類、二氯甲烷、四氫呋喃、乙酸乙酯、正己烷中的一種 或幾種。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述的酰胺類為N，N-二甲基甲酰胺、Ν， N-二甲基乙酰胺；所述的亞砜類為二甲基亞砜、二乙基亞砜、二丙基亞砜、二丁基亞砜、二 戊基亞砜、二己基亞砜。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的方法，其特征在于，所述的含兩個(gè)及以上氨基的胺類化合 物為乙二胺、二亞乙基三胺。
6. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，當(dāng)有機(jī)溶劑為二甲基亞砜時(shí)，聚合反應(yīng)體 系中不包括二氯甲烷。
7. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，當(dāng)反應(yīng)體系中加入二氯甲烷時(shí)，有機(jī) 溶劑為體積比為1:1的酰胺類有機(jī)溶劑與二氯甲烷的混合溶劑。
【文檔編號(hào)】C08G69/40GK104311820SQ201410494284
【公開日】2015年1月28日 申請(qǐng)日期:2014年9月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月24日
【發(fā)明者】徐福建, 宋海情, 竇學(xué)博, 苑慧敏 申請(qǐng)人:北京化工大學(xué)