專利名稱：降解石油、修復(fù)石油污染土壤生態(tài)菌制劑及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
生t/S術(shù)領(lǐng)域，本發(fā)明涉及一種,石油、修復(fù)石油污染土壤生態(tài)的菌制劑及其制備方法。
背景技術(shù)：
在石油開采、運(yùn)輸和使用中不可避免的^t成對(duì)周圍環(huán)境的污染，尤其^X寸土壤生態(tài)系統(tǒng)的 污染日趨嚴(yán)重。對(duì)于石油污染土壤生態(tài)的修復(fù)，國內(nèi)外己有一些研究，但是，絲見高密度、高 活性，能原位大面積j頓的^5油、修復(fù)石油污染土壤生態(tài)的菌制劑的 腿。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是，一種高密度、高活性的1 石油、修復(fù)石油污染土壤生 態(tài)的菌制劑及其制備方法。
本發(fā)明解決該M問^m采用的技術(shù)方案是
利用枯草芽孢桿菌(5oo7/MS做6ft'fe」、熒光假單胞菌(/^e"ofcw /7as /7"orasce/7s入^!球菌 但加eococcms /朋^乃'^和熱帶作巡酵母(0 ^/必的;^0 叫，都是能產(chǎn)生氧化物酶、Efi,和 脂多糖類表面活性劑的菌，倉嫩在,吸附于土 豐4±的石油的同時(shí)逐步[ 石油組分，從而 達(dá)到^f軍石油的目的；因?yàn)檫@四種菌M于土壤，所以^itA土鵬能很,成優(yōu)勢菌群，占據(jù) 一定生縱。這四種菌還具有鵬植艦生長、改善根圍生態(tài)環(huán)境的作用，因此，如果釆用菌劑-植物K^修復(fù)技術(shù)，將會(huì)ifiS石油污染土壤生態(tài)的修復(fù)。將四種菌活tt^H級(jí)液術(shù)廣M養(yǎng)并吸 附、固定化于腐殖社制備成菌制劑。四株菌種均購于中國科學(xué)院微生物研鄰萬菌種保藏中心。
5油、修復(fù)石油污染土壤生態(tài)的菌制劑^bi四種菌經(jīng)優(yōu)化組合的l賊的菌群，其中各 組分的配比基本上是1:1:1:1.這四種菌都是 部允荊吏用的^、無害的菌。
1# 油、修復(fù)石油污染土壤生態(tài)的菌制劑的律恪方跑括下述步驟
1. 將保存的各斜面菌種活化，分別搖瓶培泰基本培養(yǎng)基可溶性淀粉培養(yǎng)基培養(yǎng)，pH7. 0 7.2， 0.1Mpa， 121。C高壓滅菌20 30min; 28 30。C培養(yǎng)12 24h;
2. 將i^搖瓶i歸的各菌群混合，1液體擴(kuò);Ut養(yǎng)(20 L罐)，接種量5% 10%， 28 30°C 培養(yǎng)12 24h;
3. 再纟SH^液W;Ut養(yǎng)(200 L罐)，接種量5% 10%， 28 30。C培養(yǎng)12 24h;
4. 以腐殖m末為載懶每混合菌,勻吸附、固定化于3~5倍腐殖^±。
5. 密封于內(nèi)襯聚乙烯的^^袋內(nèi)，室溫保存，頗期1年。 '、本發(fā)明的有益玄，
1)將復(fù)合菌固定化于腐殖社，使每克菌制劑的有效E^數(shù)(cfu)可高達(dá)100個(gè)億以上 (即廣3X107g)，幾乎達(dá)到了最大可倉激，至領(lǐng)未見如此高含菌量菌制劑的J隨.腐殖酸不僅 能為所培養(yǎng)菌Jli共一些營養(yǎng)成分，還由于其網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，具撤大的比表面積，所以能在單位體積內(nèi)附著、吸附固定化較多的菌體。因此， 一定量的有效菌菌劑一旦施入土駒以很快形成優(yōu)勢菌 群，辦1W^油組分、修復(fù)石油污肚壤生態(tài)的作用。
2)因?yàn)槲廴就寥赖氖徒M分不僅成分，，而且因石油牢固地吸附于土壤微;ai:，單一的菌 或少量的菌^ 隹以進(jìn)行石油組分,的。石油組分的完全糊牟必須由多種微生物產(chǎn)生多種酶才能
最終P絲率為水和二氧化碳。尤其慰隹降解的多環(huán)芳烴，必須由細(xì)菌產(chǎn)生的鄉(xiāng)n氧酶和真菌產(chǎn)生的 單加氧謝乍用才能開環(huán)，否則多環(huán)芳您就撤佳開始糊早。
3) 除油率的測定以二氯甲垸54。C回流12 20h，低真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除二氯甲烷，M法稱重并計(jì)
算加入菌劑和不加菌劑土壤樣品的含油率，二者之差就是除油率，若加入相對(duì)于土壤表土 (耕種
層，約15 20cm)重的2°/^5%菌劑，三個(gè)月內(nèi)除油率^75% (二氯甲垸回流提取，重量法)。
4) 土壤生^f彥OTPCR-DGGE (DNA擴(kuò)iT^變性梯度^電泳)方法iWN結(jié)果顯示微生物多樣性
明顯增加，如圖l、圖2所示，圖1變性梯度 電泳圖，圖2是圖l的Quantity one軟件處理圖。


圖1變性梯度 電泳圖
圖2是圖1的Quantity one軟件處理圖
l~0d， 2—8d， 3—16d， 4一32d，表示不同天數(shù)的電泳條帶。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1
按下列步驗(yàn)行
1) 將化保存的四種菌種斜面活化，分別搖瓶培養(yǎng)。以可溶性淀粉培養(yǎng)基培養(yǎng)，具體配加口
下可溶性淀粉20g, KN03 lg，NaCl 0. 5g， lyPC^ 0. 5g， MgS04. 7H20 0.5g， FeS04 O.Olg，蒸 餾7Kl000mL， pH7.2， 0. lMpa， 12rC高壓滅菌30min 。 28。C培養(yǎng)24h。
2) 二級(jí)液體擴(kuò)^C^養(yǎng)(6L),以就面代替i^培養(yǎng)基中的可溶性淀粉，并加入O. 1°/。腐殖酸(質(zhì) 量分鋭，接種量5%， 28。C培養(yǎng)24h。。
3) ，液體擴(kuò)大培養(yǎng)(60L)，培養(yǎng)基同上；接種量10%， 28。C培養(yǎng)24h。
4) 以腐殖酸為載銅每菌液固定、吸附于其上。密封于聚乙,內(nèi)，室溫保存。 實(shí)施例2
按下列步,行-
1) 將化保存的四種菌種斜面活化，分別搖瓶培養(yǎng)。以可溶性淀粉培養(yǎng)ST大培養(yǎng)，具體配 別口下可溶性淀粉20g，跳lg,NaCl 0.5g, K異0.5g, MgS04. 7H20 0.5g， FeS04 0.01g， 蒸餾7jCl000mL， pH7.0， 0. lMpa， 121。C高壓滅菌30min 。 28。C培養(yǎng)12h。
2) 二級(jí)液體擴(kuò)大培養(yǎng)(10L)，以玉米面代替上述培養(yǎng)基中的可溶性淀粉，并加入0.1%腐殖酸 (質(zhì)量分?jǐn)?shù))，接種量5%， 28。C蹄12h。。3) H0液體擴(kuò)誠養(yǎng)(100L)，培養(yǎng)基同上，接種量10%， 28。C培養(yǎng)12h。
4) 以腐殖酸為載銅每菌液固定、吸附于腐殖l。密封于聚乙烯袋內(nèi)，室溫保存。
實(shí)施例3 按下列步翻亍
1) 將4'C保存的三種菌種斜面活化，分別搖瓶培養(yǎng)。以可溶性淀粉培養(yǎng)對(duì)廣大培養(yǎng)，具體配 方如下可溶性淀粉20g，跳lg，NaCl 0.5g, ,4 0. 5g， MgS04. 7H20 0. 5g, FeS04 0. Olg, 蒸餾^U000mL， pH7.2， 0.1Mpa， 121。C高壓滅菌30min 。 28。C培養(yǎng)12~24h。
2) 二級(jí)液體擴(kuò)大培養(yǎng)(20L),以玉米面代替上述培養(yǎng)基中的可溶性淀粉，并加入0.1%腐殖酸 (質(zhì)量分激，接種量5%， 28。C培養(yǎng)24h。。
3) ，液體擴(kuò)大培養(yǎng)(200L)，培養(yǎng)基同上，接種量1W。， 28。Ci鎌12 24h。
4) 以腐殖酸為載懶每菌液固定、吸附于腐殖社。密封于聚乙烯袋內(nèi)，室溫保存。
權(quán)利要求
1.一種能夠降解石油修復(fù)石油污染土壤生態(tài)的菌制劑，其特征在于該菌制劑由枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)、糞鏈球菌(Enterococcusfaecalis)和熱帶假絲酵母(Candida tropicalis)經(jīng)優(yōu)化組合組成的復(fù)合菌群，其中各菌組分的配比是1～2∶1∶1∶0.5～1。
2. 如權(quán)利要求1臓的糊拓油修復(fù)石油污染土壤生態(tài)的菌制劑的制備方法，辦征在于它 包括下述步驟1) 將保存的枯草芽孢桿菌(feciWas幼Z^7is)、熒光假單胞菌(/tei/GkfflMas /7"orascms^、 ^H球菌敘ferococc"51 Aeca力's,禾口熱帶f^M酵母(t^/7oWa trcp/ca7i5^ 面菌種活化，分別搖瓶培養(yǎng)；基本培養(yǎng)基可溶性淀粉培養(yǎng)基培養(yǎng)，pH7.0 7.2，0.1Mpa， 12rC高壓滅菌20 30min; 28 30。C培養(yǎng)12 24h;2) 將，搖瓶培養(yǎng)的各菌群混合，二級(jí)液^T大:^，總^f只5 20L，以5^面代替可溶 性淀粉培養(yǎng)基中的可溶性淀粉，并添加0.1%的腐殖酸，其他成分與可溶性淀粉培養(yǎng)對(duì)目 同，接種量^f只百分比為5% 10%， 28 30。C培養(yǎng)12 24h;3) 再經(jīng)，液體擴(kuò)i^養(yǎng)，總體積10倍于2)，擴(kuò)大培養(yǎng)基同2)，接種量體積百分比為5% 10%， 28 30。C線12 24h;4) 以腐殖酸為載俐每混合菌群均勻吸附、固定化于腐殖l匕腐殖酸與步驟3)的擴(kuò)対咅養(yǎng) ^M量比為3 5。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種降解石油、修復(fù)石油污染土壤生態(tài)菌制劑及其制備方法。降解石油、修復(fù)石油污染土壤生態(tài)的菌制劑是由巨大芽孢桿菌、熒光假單胞菌、糞鏈球菌和熱帶假絲酵母經(jīng)優(yōu)化組合組成的復(fù)合菌群，其中各組分的配比是1～2∶1∶1∶0.5～1。本發(fā)明的積極效果在于菌制劑施入土壤后能很快形成微生態(tài)優(yōu)勢菌群。若加入相對(duì)于土壤表土(耕種層，約15～20cm)重的2％～5％菌劑，三個(gè)月內(nèi)除油率≥75％(二氯甲烷回流提取，重量法)菌制劑的有效菌落數(shù)高，適應(yīng)性強(qiáng)，對(duì)修復(fù)石油污染土壤生態(tài)環(huán)境具有明顯的作用。
文檔編號(hào)B09C1/10GK101603018SQ200910069620
公開日2009年12月16日 申請(qǐng)日期2009年7月7日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月7日
發(fā)明者俊 喬, 張清敏, 婷 郭, 威 陳, 齊建超 申請(qǐng)人:南開大學(xué)