專(zhuān)利名稱(chēng)：用于人多潛能干(hPS)細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化的3D培養(yǎng)系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及3D培養(yǎng)系統(tǒng)的用途，其用于從人多潛能干細(xì)胞(human pluripotent stem cells,hPS)衍生肝細(xì)胞樣細(xì)胞。特別地，本發(fā)明涉及人多潛能干細(xì)胞在3D中空纖維毛細(xì)管生物反應(yīng)器中至肝細(xì)胞樣細(xì)胞的定向分化和成熟。
背景技術(shù)：
為了在再生醫(yī)學(xué)和應(yīng)用研究例如藥物篩選或毒理學(xué)測(cè)試中開(kāi)發(fā)和實(shí)現(xiàn)基于干細(xì)胞的應(yīng)用，需要大量具有良好確定的特征的細(xì)胞。因此，需要允許hPS以高得率和純度定向、可重現(xiàn)地分化至成熟肝細(xì)胞樣細(xì)胞的培養(yǎng)系統(tǒng)。發(fā)明描述本發(fā)明涉及用于獲得肝細(xì)胞樣細(xì)胞的方法，所述方法包括i)在生物反應(yīng)器中接種hPS或肝前體細(xì)胞ii)用一種或多種培養(yǎng)基灌注生物反應(yīng)器，進(jìn)行10至50天的時(shí)間段，以獲得肝細(xì)胞樣細(xì)胞。在本發(fā)明的一個(gè)方面，本發(fā)明涉及肝組織樣3D結(jié)構(gòu)，其包含通過(guò)用于獲得肝細(xì)胞樣細(xì)胞的方法獲得的肝細(xì)胞樣細(xì)胞，所述方法包括i)在生物反應(yīng)器中接種hPS或肝前體細(xì)胞ii)用一種或多種培養(yǎng)基灌注生物反應(yīng)器，進(jìn)行10至50天的時(shí)間段，以獲得肝細(xì)胞樣細(xì)胞。在本發(fā)明的其他方面，本發(fā)明涉及通過(guò)用于獲得肝細(xì)胞樣細(xì)胞的方法獲得的細(xì)胞用于治療目的，藥物發(fā)現(xiàn)，藥物配制，毒性測(cè)試或再生醫(yī)學(xué)的用途，所述方法包括i)在生物反應(yīng)器中接種hPS或肝前體細(xì)胞ii)用一種或多種培養(yǎng)基灌注生物反應(yīng)器，進(jìn)行10至50天的時(shí)間段，以獲得肝細(xì)胞樣細(xì)胞。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及生物反應(yīng)器用于使hPS細(xì)胞或肝前體細(xì)胞向肝細(xì)胞命運(yùn)分化的用途。引言當(dāng)前，使用聚集體(aggregate)或微載體進(jìn)行分化的3D懸浮培養(yǎng)模型法受到中央物質(zhì)交換(central mass exchange)的限制。通過(guò)在更大的細(xì)胞群中提供基于灌注的動(dòng)態(tài)培養(yǎng)條件(其具有連續(xù)的培養(yǎng)基交換和在可控氣體張力下的分散充氧(decentral oxygenation)), 3D灌注4區(qū)室毛細(xì)管膜生物反應(yīng)器技術(shù)使得能夠利用兩種培養(yǎng)理念的有利方面。此外，適合用于優(yōu)質(zhì)生產(chǎn)規(guī)范(GMP)條件的分化方案在封閉系統(tǒng)中的應(yīng)用是可能的。所述技術(shù)允許進(jìn)行改變，并且可控的培養(yǎng)基參數(shù)和系統(tǒng)參數(shù)包括例如氧張力、氣體系數(shù)應(yīng)用、培養(yǎng)基因子梯度或?qū)?xì)胞產(chǎn)生的物理刺激例如流動(dòng)和壓力。hPS細(xì)胞在生物反應(yīng)器中的培養(yǎng)為了在再生醫(yī)學(xué)和應(yīng)用研究(例如藥物篩選或毒理學(xué)測(cè)試)中開(kāi)發(fā)和實(shí)現(xiàn)基于干細(xì)胞的應(yīng)用，需要大量具有良好確定的特征的細(xì)胞。因此，需要允許未分化的人胚胎干細(xì)胞以高得率和純度定向、可重現(xiàn)地分化至成熟肝細(xì)胞的培養(yǎng)系統(tǒng)。最常使用的培養(yǎng)和分化方法通常利用塑料培養(yǎng)皿形式的2D培養(yǎng)系統(tǒng)，其代表具有不連續(xù)培養(yǎng)基更換的靜態(tài)開(kāi)放系統(tǒng)，這導(dǎo)致培養(yǎng)環(huán)境的周期性改變，表現(xiàn)為培養(yǎng)氧基更換之間培養(yǎng)基中代謝產(chǎn)物的積累和營(yíng)養(yǎng)物的減少。此外，此類(lèi)2D培養(yǎng)是勞動(dòng)密集型的，因?yàn)樗鼈冃枰罅咳斯じ深A(yù)，從而使得更大細(xì)胞數(shù)量的操作不現(xiàn)實(shí)。hPS細(xì)胞在生物反應(yīng)器中的分化由Soto-Gutierrez等人進(jìn)行的hESC的肝分化研究顯示，更復(fù)雜的環(huán)境(使用復(fù)合基質(zhì)結(jié)構(gòu)或與非實(shí)質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng))支持hESC的肝分化(Soto-Gutierrez等人，2006)。 Levenberg等人顯示，在用ES細(xì)胞或EB接種的PLGA-聚(乳酸-乙醇酸)共聚物和PLLA-聚 (L-乳酸)的生物可降解的支架中，通過(guò)用激活蛋白A和IGF進(jìn)行處理，可能誘導(dǎo)肝組織樣結(jié)構(gòu)(Levenberg等人，2003)。Baharvand等人報(bào)導(dǎo)了 hESC在3D膠原支架中的增強(qiáng)的肝分化(Baharvand等人，2006)。因此，提供3D培養(yǎng)環(huán)境的灌注式生物反應(yīng)器的使用可提供更有效且可擴(kuò)展的用于胚胎干細(xì)胞分化的方法。新型方法是利用中空纖維生物反應(yīng)器進(jìn)行胚胎干細(xì)胞的擴(kuò)增和分化。中空纖維毛細(xì)管膜生物反應(yīng)器技術(shù)使得能夠?qū)崿F(xiàn)動(dòng)態(tài)灌注培養(yǎng)條件并且允許增加細(xì)胞密度，正如干細(xì)胞在天然組織中的那樣。此外，按比例放大以用于更大的細(xì)胞群是可能的。然而，典型的兩區(qū)室生物反應(yīng)器裝置(例如，F(xiàn)iberCell Duet, FiberCell systems, Inc.，www. fibercellsystems. com)(其具有圍繞一束周?chē)?xì)管的細(xì)胞區(qū)室，營(yíng)養(yǎng)物主要通過(guò)擴(kuò)散供應(yīng)并且使用外部充氧)受限于不均勻的物質(zhì)交換(沿著數(shù)分米的毛細(xì)管長(zhǎng)度，存在底物梯度間隔)。在由Gerlach等人開(kāi)發(fā)的3D多區(qū)室技術(shù)(Gerlach等人1994)中，將另一個(gè)培養(yǎng)基區(qū)室和另外的充氧膜區(qū)室添加至典型的兩區(qū)室裝置中。交織4個(gè)區(qū)室以形成重復(fù)單元， 從而使得生物反應(yīng)器能夠具有可擴(kuò)縮性，提供分散的培養(yǎng)基灌注和更換，并且物質(zhì)交換得到增強(qiáng)且梯度間隔得以減小。該理念基于在密閉的和從而優(yōu)質(zhì)生產(chǎn)規(guī)范(GMP)的適當(dāng)培養(yǎng)環(huán)境中培養(yǎng)細(xì)胞，這促進(jìn)了生物技術(shù)的應(yīng)用以及結(jié)果的潛在臨床轉(zhuǎn)化。使用培養(yǎng)在生物反應(yīng)器中的原代豬或人肝細(xì)胞進(jìn)行的初步臨床研究證明了利用所述系統(tǒng)進(jìn)行臨床體外肝支持的可行性(Sauer等人，200 。此外，已顯示，原代細(xì)胞可在這樣的體外培養(yǎng)模式中產(chǎn)生它們自已的典型微環(huán)境，包括形成具有新生-血竇和膽道結(jié)構(gòu)的肝樣組織。成體干細(xì)胞可受益于在用于產(chǎn)生anorganotypical微環(huán)境的此類(lèi)系統(tǒng)中進(jìn)行的實(shí)質(zhì)/非實(shí)質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng) (Gerlach 等人，2003)。由于它們的獨(dú)特特征，hPS細(xì)胞在再生醫(yī)學(xué)中作為用于基礎(chǔ)科學(xué)、藥理學(xué)藥物篩選、毒性測(cè)試和基于細(xì)胞的療法的細(xì)胞來(lái)源具有巨大的潛力。已顯示，在某些生長(zhǎng)條件下， hPS細(xì)胞能夠在體外分化成多種體細(xì)胞組織和胚胎外組織(Pera等人，2004)。因此，hPS， 具體地hES/hBS細(xì)胞使得能夠研究在早期胚胎發(fā)育過(guò)程中控制細(xì)胞命運(yùn)的分子途徑和控制機(jī)制，這在之前是不可能的(因?yàn)槿伺咛ゲ荒苡糜谘芯?。hPS細(xì)胞的潛在臨床應(yīng)用可見(jiàn)于干細(xì)胞衍生的細(xì)胞制劑的提供中，所述制劑用于具有器官缺陷如肝功能不全、脊髓損傷或心肌缺陷的患者的基于細(xì)胞的治療。hPS細(xì)胞衍生的分化細(xì)胞在藥物發(fā)現(xiàn)中的可能應(yīng)用可見(jiàn)于臨床前活動(dòng)如靶的鑒定和驗(yàn)證，化合物功效的篩選和安全性評(píng)估研究中(Sartipy 等人，2007)。關(guān)于胚胎毒性測(cè)試，未分化的hPS細(xì)胞也提供了用于開(kāi)發(fā)更好的測(cè)試系統(tǒng)的新型工具。哺乳動(dòng)物肝的發(fā)育肝是在胚胎中最早發(fā)育的器官之一，其快速成為胎兒的最大器官之一。肝從胚胎前腸的限定性?xún)?nèi)胚層上皮發(fā)育而來(lái)。前腸中Wnt和成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(FGF4) 的最初抑制是誘導(dǎo)肝發(fā)育所必需的。隨后來(lái)自心臟中胚層的FGF和來(lái)自原始橫隔間充質(zhì)的骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)誘導(dǎo)導(dǎo)致內(nèi)胚層增厚的空間受限的細(xì)胞增殖。細(xì)胞隨后從上皮脫離并且開(kāi)始遷移至原始橫隔中。從內(nèi)胚層脫離并且集中在原始橫隔中的細(xì)胞團(tuán)稱(chēng)為肝芽。在器官發(fā)生的該階段中，與內(nèi)皮細(xì)胞的相互作用對(duì)于該早期出芽期(budding phase) 是至關(guān)重要的。肝內(nèi)胚層細(xì)胞在該時(shí)間期間在功能和形態(tài)學(xué)方面是相當(dāng)不成熟的，并且現(xiàn)被稱(chēng)為成肝細(xì)胞(h印atoblast)。來(lái)自肝芽的成肝細(xì)胞束滲入中胚層，與卵黃和臍靜脈(其在肝芽附近匯合形成毛細(xì)血管床)混合。這些轉(zhuǎn)變建立了肝的竇狀隙結(jié)構(gòu)(sinusoidal architecture)，這對(duì)于器官功能是至關(guān)重要的并且為肝支持胎兒造血?jiǎng)?chuàng)造了條件。遷移入肝芽的造血干細(xì)胞分泌制癌蛋白M(OsM)，該蛋白與糖皮質(zhì)激素一起誘導(dǎo)進(jìn)一步的肝成熟。 對(duì)胚胎肝有貢獻(xiàn)的其他細(xì)胞類(lèi)型是圍繞肝血竇的內(nèi)皮細(xì)胞、枯否細(xì)胞和肝星形細(xì)胞。由這些細(xì)胞產(chǎn)生的肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)對(duì)于肝的完全功能成熟是重要的。在這些肝分化的更晚期中，Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)不再抑制而是促進(jìn)生長(zhǎng)和分化。病因性(causal)肝療法的缺乏和用于肝移植的供體器官的不充足的可獲得性導(dǎo)致需要開(kāi)發(fā)新型的基于細(xì)胞的肝療法。移植能夠增殖和分化以替代受損的組織的干細(xì)胞可在一些臨床適應(yīng)癥中替代整個(gè)器官的移植。hPS細(xì)胞的體外肝分化對(duì)指導(dǎo)HPS細(xì)胞(特別地hES/hBS細(xì)胞)的體外肝分化的策略的研究導(dǎo)致鑒定了對(duì)肝分化具有作用的幾種細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子和非蛋白質(zhì)化合物(綜述于Heng等人， 2005 ；Snykers等人，2008中)。所述生長(zhǎng)因子包括激活蛋白A、BMP2和BMP4、表皮生長(zhǎng)因子 (EGF)、FGFl、-2和-4、HGF、胰島素和OsM。所述非蛋白質(zhì)因子包括地塞米松(DEX)、二甲亞砜 (DMSO)、煙酰胺和丁酸鈉。對(duì)于各分化因子的作用而言至關(guān)重要的是，時(shí)間安排、濃度和與其他因子的組合。為了表征hPS衍生的肝細(xì)胞樣細(xì)胞，已利用了不同的標(biāo)志物和功能測(cè)試 (由Snykers等人，2008綜述)。通過(guò)免疫化學(xué)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)或酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)檢查的標(biāo)志物包括分泌的血漿蛋白質(zhì)如甲胎蛋白(AFP)、白蛋白(ALB)和尿素、 細(xì)胞角蛋白(CK8、CK18、CK7、CK19)和多種肝細(xì)胞特異性酶如α-1-抗胰蛋白酶(α 1ΑΤ)、 二肽基肽酶IV(DPPIV)和細(xì)胞色素Ρ450同工酶。已例如通過(guò)檢測(cè)糖原的貯存和多種特異于細(xì)胞色素Ρ450同工酶的測(cè)試底物的代謝來(lái)檢查肝細(xì)胞特異性功能的表達(dá)。最早公布的方案描述了用作第一步驟的hPS細(xì)胞的肝分化，EB的誘導(dǎo)，然后貼壁培養(yǎng)，使用不同生長(zhǎng)因子來(lái)富集肝細(xì)胞(Lavon等人，2004)。在這些研究中，只報(bào)導(dǎo)了非常低的終細(xì)胞群體的得率和純度。到目前為止，所描述的試圖模擬肝的器官發(fā)育的最成功的分化方案始于hESC的定型內(nèi)胚層(definitive endoderm, DE)分化的誘導(dǎo)(Cai等人， 2007)?；旧?，高濃度的激活蛋白A與低血清/胰島素條件(用于提供減少的胰島素/胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo))一起被用于DE分化，獲得多至80% DE細(xì)胞的得率(Kubo 等人，2004)。此后，用FGF、BMP、HGF、OsM/DEX進(jìn)行連續(xù)處理。對(duì)于該方法，描述的肝細(xì)胞樣細(xì)胞的得率為約50%。其他方案包括用抑制組蛋白脫乙?；富钚缘亩∷徕c(NaB)處理 hESC (Davie 2003)。在分化方案的第一步驟中應(yīng)用該表觀遺傳學(xué)分化劑導(dǎo)致從hESC產(chǎn)生10%的肝細(xì)胞和達(dá)到70%的終細(xì)胞群體的純度(Rambhatla等人，2003)。NaB處理與利用激活蛋白A進(jìn)行的DE誘導(dǎo)的組合顯示很有前景的結(jié)果，獲得高達(dá)70%的肝細(xì)胞得率(Hay 等人，2008)。概而言之，通過(guò)現(xiàn)有方法產(chǎn)生的hESC衍生的肝細(xì)胞的得率、純度和成熟程度仍然欠佳，從而需要新的方法。本發(fā)明通過(guò)提供用于從hPS例如hBS細(xì)胞獲得肝細(xì)胞(通過(guò)將這些細(xì)胞或從其衍生的DE細(xì)胞接種在其中它們經(jīng)歷分化的生物反應(yīng)器中)的方法解決了這些問(wèn)題。hPS衍生的肝細(xì)胞的應(yīng)用hPS衍生的肝細(xì)胞的未來(lái)臨床用途可見(jiàn)于它們用于具有肝功能不全的患者(例如在某些遺傳缺陷或者急性或慢性肝功能衰竭的情況下)的細(xì)胞移植的應(yīng)用中(Ito等人，2009)。干細(xì)胞衍生的肝細(xì)胞的移植可在某些臨床適應(yīng)癥中替代整個(gè)器官的移植，并且一當(dāng)使用免疫相容性細(xì)胞時(shí)一使得不需要免疫抑制療法。其他治療選擇可見(jiàn)于可靠的人細(xì)胞來(lái)源的提供中，所述人細(xì)胞來(lái)源用于體外肝支持，以過(guò)渡(bridge)肝功能直至移植或直至再生患者器官，這也可解決用于體外肝裝置的細(xì)胞的可獲得性的現(xiàn)存問(wèn)題。此外，體外系統(tǒng)還可提供有利的治療選擇，以在細(xì)胞移植后過(guò)渡肝功能直至施用的細(xì)胞顯示足夠的肝特異性代謝性能。藥學(xué)研究中的潛在應(yīng)用是，使用hPS細(xì)胞衍生的肝細(xì)胞來(lái)開(kāi)發(fā)藥物發(fā)現(xiàn)所需的新型肝測(cè)定。這可克服現(xiàn)有體外工具的較差的預(yù)測(cè)力的問(wèn)題，和導(dǎo)致產(chǎn)生新的基于人細(xì)胞的測(cè)試系統(tǒng)，該系統(tǒng)將允許在臨床前階段進(jìn)行更可靠和更相關(guān)的測(cè)試并且阻止微弱的前導(dǎo)候選物進(jìn)入臨床期(Jensen等人，2009)。本發(fā)明還涉及生物反應(yīng)器用于產(chǎn)生條件化培養(yǎng)基的用途。用于產(chǎn)生條件化培養(yǎng)基 (CM)的標(biāo)準(zhǔn)方法是，在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)容器中溫育培養(yǎng)基M小時(shí)，所述容器以高密度接種滅活的 MEF飼養(yǎng)細(xì)胞。該方法是勞動(dòng)密集型的并且十分耗費(fèi)空間，因?yàn)楸仨毊a(chǎn)生大量的飼養(yǎng)細(xì)胞， 所述飼養(yǎng)細(xì)胞在它們喪失活性前只能在有限量的時(shí)間內(nèi)用于培養(yǎng)基的條件化。因此，更大體積的CM的產(chǎn)生受限于該方法的較差的可擴(kuò)縮性。使用CM來(lái)培養(yǎng)hBS細(xì)胞的備選方法是使用成分確定的培養(yǎng)基。已描述了幾種用于hESC的無(wú)飼養(yǎng)層培養(yǎng)的成分確定的培養(yǎng)基制劑(Li等人，2005 ;Ludwig等人，2006)。雖然成分確定的培養(yǎng)基的使用具有幾個(gè)有利方面， 如能夠在完全不含動(dòng)物來(lái)源的物質(zhì)的條件下培養(yǎng)hBS細(xì)胞，但其主要不利方面是，這些培養(yǎng)基制劑包含大量昂貴的補(bǔ)充劑，如重組細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子。如上文中所概述的，本發(fā)明涉及用于獲得肝細(xì)胞樣細(xì)胞的方法，所述方法包括i)將hPS或肝前體細(xì)胞接種在生物反應(yīng)器中ii)用一種或多種培養(yǎng)基灌注生物反應(yīng)器，進(jìn)行10至50天的時(shí)間段，以獲得肝細(xì)胞樣細(xì)胞。肝細(xì)胞樣細(xì)胞可以以包含肝細(xì)胞樣細(xì)胞的肝組織樣3D結(jié)構(gòu)的形式存在，從而一起簇集在3D聚集體中。hPS細(xì)胞可以是但不限于人胚胎干細(xì)胞或誘導(dǎo)的多潛能干(iPS)細(xì)胞，如定義中所描述的。肝細(xì)胞前體細(xì)胞可以是定型內(nèi)胚層(DE)或與DE不相似，或肝細(xì)胞前體細(xì)胞可具有胎兒內(nèi)胚層或肝內(nèi)胚層的特征。如上文中提及的，生物反應(yīng)器可以是任選地提供有膜區(qū)室的中空纖維毛細(xì)管生物反應(yīng)器。生物反應(yīng)器可包括兩個(gè)或更多個(gè)毛細(xì)管系統(tǒng)和一個(gè)或多個(gè)中空纖維膜。此外，生物反應(yīng)器可包括用于灌注培養(yǎng)基通過(guò)毛細(xì)管系統(tǒng)的工具和用于在毛細(xì)管系統(tǒng)中進(jìn)行氣體交換的工具，任選地，生長(zhǎng)培養(yǎng)基的灌注通過(guò)毛細(xì)管系統(tǒng)發(fā)生，氣體交換通過(guò)中空纖維膜系統(tǒng)發(fā)生?？膳渲妹?xì)管系統(tǒng)和一個(gè)或多個(gè)中空纖維膜以形成整合至室(housing)中的獨(dú)立交織的纖維毛細(xì)管膜系統(tǒng)?？稍诓襟Ei)中接種hPS細(xì)胞，并且可按照下列方案進(jìn)行灌注，只要包括步驟2-6 中的至少3個(gè)步驟
權(quán)利要求
1.用于獲得肝細(xì)胞樣細(xì)胞的方法，所述方法包括 i)在生物反應(yīng)器中接種hPS或肝前體細(xì)胞； )用一種或多種培養(yǎng)基灌注生物反應(yīng)器，進(jìn)行10至50天的時(shí)間段，以獲得肝細(xì)胞樣細(xì)胞。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述肝細(xì)胞樣細(xì)胞以包含肝細(xì)胞樣細(xì)胞的肝組織樣3D結(jié)構(gòu)的形式存在。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述hPS細(xì)胞是人胚胎干細(xì)胞。
4.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述hPS細(xì)胞是誘導(dǎo)的多潛能干(iPS)細(xì)胞。
5.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述肝細(xì)胞前體細(xì)胞是定型內(nèi)胚層(DE)。
6.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述肝細(xì)胞前體細(xì)胞不是定型內(nèi)胚層(DE)。
7.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述肝細(xì)胞前體細(xì)胞具有胎兒內(nèi)胚層的特征。
8.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述肝細(xì)胞前體細(xì)胞具有肝內(nèi)胚層的特征。
9.前述權(quán)利要求的任一項(xiàng)的方法，其中所述生物反應(yīng)器是中空纖維毛細(xì)管生物反應(yīng)ο
10.前述權(quán)利要求的任一項(xiàng)的方法，其中所述生物反應(yīng)器提供有膜區(qū)室。
11.權(quán)利要求10的方法，其中所述膜區(qū)室包括兩個(gè)或更多個(gè)毛細(xì)管系統(tǒng)以及一個(gè)或多個(gè)中空纖維膜。
12.權(quán)利要求9至11的任一項(xiàng)的方法，其中所述生物反應(yīng)器包括用于灌注培養(yǎng)基通過(guò)毛細(xì)管系統(tǒng)的工具和用于在毛細(xì)管系統(tǒng)中進(jìn)行氣體交換的工具。
13.權(quán)利要求9至12的任一項(xiàng)的方法，其中生長(zhǎng)培養(yǎng)基的灌注通過(guò)毛細(xì)管系統(tǒng)發(fā)生，并且氣體交換通過(guò)中空纖維膜系統(tǒng)發(fā)生。
14.權(quán)利要求9至13的任一項(xiàng)的方法，其中所述毛細(xì)管系統(tǒng)和一個(gè)或多個(gè)中空纖維膜經(jīng)配置形成整合在室中的獨(dú)立的交織的纖維毛細(xì)管膜系統(tǒng)。
15.前述權(quán)利要求的任一項(xiàng)的方法，其中在步驟i)中接種hPS細(xì)胞，并且按照下列方案進(jìn)行灌注
16.權(quán)利要求15的方法，其中包括所有步驟。
17.權(quán)利要求15或16的任一項(xiàng)的方法，其中培養(yǎng)基DM-A包含生長(zhǎng)培養(yǎng)基和一種或多種如下成分激活蛋白A、bFGF、Glutamax-I。
18.權(quán)利要求15-17的任一項(xiàng)的方法，其中所述培養(yǎng)基DM-A包含激活蛋白-A和bFGF。
19.權(quán)利要求15-18的任一項(xiàng)的方法，其中所述培養(yǎng)基DM-B包含生長(zhǎng)培養(yǎng)基例如RPMI Advanced培養(yǎng)基等，和一種或多種如下成分激活蛋白A、bFGF、GLutamax-I、FCS。
20.權(quán)利要求15-19的任一項(xiàng)的方法，其中所述培養(yǎng)基DM-B包含激活蛋白-A和bFGF。
21.權(quán)利要求15-20的任一項(xiàng)的方法，其中培養(yǎng)基DM-C包含生長(zhǎng)培養(yǎng)基例如RPMI Advanced 培養(yǎng)基等，和一種或多種如下成分bFGF、aFGF、BMP2、BMP4、Glutamax-I、FCS。
22.權(quán)利要求21的方法，其中所述培養(yǎng)基DM-C包含bFGF、aFGF、BMP2、BMP4。
23.權(quán)利要求15-22的任一項(xiàng)的方法，其中培養(yǎng)基DM-D包含肝培養(yǎng)基例如Williams培養(yǎng)基E等，和一種或多種如下成分BSA、抗壞血酸、Glutamax-I、D-半乳糖/D-山梨醇、氫化可的松、胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、bFGF、EGF、HGF。
24.權(quán)利要求23的方法，其中所述培養(yǎng)基DM-D包含BSA、抗壞血酸、D-半乳糖/D-山梨醇、氫化可的松、胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、bFGF、EGF、HGF。
25.權(quán)利要求15- 的任一項(xiàng)的方法，其中培養(yǎng)基DM-E包含肝培養(yǎng)基例如Williams培養(yǎng)基E等，和一種或多種如下成分BSA、抗壞血酸、Glutamax-I、地塞米松、D-半乳糖/D-山梨醇、氫化可的松、胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、bFGF、EGF、HGF、制癌蛋白M。
26.權(quán)利要求25的方法，其中所述培養(yǎng)基DM-E包含BSA、抗壞血酸、地塞米松、D-半乳糖/D-山梨醇、氫化可的松、胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、bFGF、EGF、HGF、制癌蛋白M。
27.前述權(quán)利要求的任一項(xiàng)的方法，其中在步驟i)之前用滅活的飼養(yǎng)細(xì)胞接種所述生物反應(yīng)器。
28.權(quán)利要求27的任一項(xiàng)的方法，其中所述飼養(yǎng)細(xì)胞是hFF或MEF細(xì)胞。
29.前述權(quán)利要求的任一項(xiàng)的方法，其中用hBS細(xì)胞和飼養(yǎng)細(xì)胞或者DE細(xì)胞和飼養(yǎng)細(xì)胞一無(wú)論哪者是相關(guān)的一共接種所述生物反應(yīng)器。
30.前述權(quán)利要求的任一項(xiàng)的方法，其中在步驟i)中接種肝前體細(xì)胞例如DE細(xì)胞，并且省略權(quán)利要求15的步驟1和2。
31.前述權(quán)利要求的任一項(xiàng)的方法，其中一種或多種培養(yǎng)基包含細(xì)胞存活因子例如 ROCK Mio激酶的抑制劑。
32.通過(guò)前述權(quán)利要求的任一項(xiàng)中定義的方法獲得的肝細(xì)胞樣細(xì)胞。
33.包含通過(guò)權(quán)利要求1-31的任一項(xiàng)的方法獲得的肝細(xì)胞樣細(xì)胞的肝組織樣3D結(jié)構(gòu)。
34.根據(jù)權(quán)利要求32或33的肝細(xì)胞樣細(xì)胞或包含肝細(xì)胞樣細(xì)胞的肝組織樣3D結(jié)構(gòu)， 其中所述細(xì)胞表達(dá)升高水平的一種或多種肝標(biāo)志物基因或肝轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因。
35.根據(jù)權(quán)利要求32-34的肝細(xì)胞樣細(xì)胞或包含肝細(xì)胞樣細(xì)胞的肝組織樣3D結(jié)構(gòu)， 其中所述一個(gè)或多個(gè)肝標(biāo)志物基因選自白蛋白、CYP1A2、CYP2C9、CYP3A4、CYP7A1、TAT & UGT2B7。
36.根據(jù)權(quán)利要求32-34的肝細(xì)胞樣細(xì)胞或包含肝細(xì)胞樣細(xì)胞的肝組織樣3D結(jié)構(gòu)，其中所述一個(gè)或多個(gè)肝標(biāo)志物基因的表達(dá)與對(duì)于本文圖7中的樣品生物反應(yīng)器第沈天所列的肝標(biāo)志物基因的表達(dá)相似。
37.根據(jù)權(quán)利要求32-34的肝細(xì)胞樣細(xì)胞或包含肝細(xì)胞樣細(xì)胞的肝組織樣3D結(jié)構(gòu)，其中所述一個(gè)或多個(gè)肝轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因選自ABCC2/MRP2、FABPl、0ATP2、0CT-1。
38.根據(jù)權(quán)利要求32-34的肝細(xì)胞樣細(xì)胞或包含肝細(xì)胞樣細(xì)胞的肝組織樣3D結(jié)構(gòu)，其中所述一個(gè)或多個(gè)肝轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的表達(dá)與對(duì)于本文圖9中的樣品生物反應(yīng)器第沈天所列的表達(dá)相似。
39.在提供有膜區(qū)室的生物反應(yīng)器中的體外衍生的肝細(xì)胞樣細(xì)胞。
40.根據(jù)權(quán)利要求32-39的任一項(xiàng)的體外衍生的肝細(xì)胞樣細(xì)胞或包含肝細(xì)胞樣細(xì)胞的肝組織樣3D結(jié)構(gòu)，其中所述細(xì)胞已在生物反應(yīng)器中從hPS細(xì)胞或肝細(xì)胞前體分化成肝細(xì)胞樣細(xì)胞。
41.根據(jù)權(quán)利要求32-40的體外衍生的肝細(xì)胞樣細(xì)胞或包含肝細(xì)胞樣細(xì)胞的肝組織樣 3D結(jié)構(gòu)，其中所述生物反應(yīng)器是中空纖維毛細(xì)管生物反應(yīng)器。
42.根據(jù)權(quán)利要求32-41的任一項(xiàng)的體外衍生的肝細(xì)胞樣細(xì)胞或包含肝細(xì)胞樣細(xì)胞的肝組織樣3D結(jié)構(gòu)，其中所述生物反應(yīng)器包括用于灌注培養(yǎng)基通過(guò)毛細(xì)管系統(tǒng)的工具和用于在毛細(xì)管系統(tǒng)中進(jìn)行氣體交換的工具。
43.根據(jù)權(quán)利要求32-42的任一項(xiàng)的體外衍生的肝細(xì)胞樣細(xì)胞或包含肝細(xì)胞樣細(xì)胞的肝組織樣3D結(jié)構(gòu)，其中所述膜區(qū)室包括兩個(gè)或更多個(gè)毛細(xì)管系統(tǒng)以及一個(gè)或多個(gè)中空纖維膜。
44.根據(jù)權(quán)利要求32-43的任一項(xiàng)的體外衍生的肝細(xì)胞樣細(xì)胞或包含肝細(xì)胞樣細(xì)胞的肝組織樣3D結(jié)構(gòu)，其中生長(zhǎng)培養(yǎng)基的灌注通過(guò)毛細(xì)管系統(tǒng)發(fā)生，并且氣體交換通過(guò)中空纖維膜系統(tǒng)發(fā)生。
45.根據(jù)權(quán)利要求32-44的任一項(xiàng)的體外衍生的肝細(xì)胞樣細(xì)胞或包含肝細(xì)胞樣細(xì)胞的肝組織樣3D結(jié)構(gòu)，其中所述毛細(xì)管系統(tǒng)和所述中空纖維膜經(jīng)配置形成整合在室中的獨(dú)立的交織的纖維毛細(xì)管膜系統(tǒng)。
46.根據(jù)權(quán)利要求32-45的任一項(xiàng)的體外衍生的肝細(xì)胞樣細(xì)胞或包含肝細(xì)胞樣細(xì)胞的肝組織樣3D結(jié)構(gòu)，其中在細(xì)胞存活因子例如ROCK Rho激酶的抑制劑存在的情況下培養(yǎng)所述肝細(xì)胞樣細(xì)胞或包含肝細(xì)胞樣細(xì)胞的肝組織樣3D結(jié)構(gòu)。
47.生物反應(yīng)器用于使hPS細(xì)胞或肝前體朝向肝細(xì)胞命運(yùn)分化的用途。
48.用于產(chǎn)生條件化培養(yǎng)基的方法，所述方法包括步驟a)在生物反應(yīng)器中接種飼養(yǎng)細(xì)胞，b)培養(yǎng)飼養(yǎng)細(xì)胞。
49.權(quán)利要求48的方法，其中所述生物反應(yīng)器是中空纖維毛細(xì)管生物反應(yīng)器。
50.權(quán)利要求48或49的方法，其中所述生物反應(yīng)器提供有膜區(qū)室。
51.權(quán)利要求50的方法，其中所述膜區(qū)室包括兩個(gè)或更多個(gè)毛細(xì)管系統(tǒng)以及一個(gè)或多個(gè)中空纖維膜。
52.權(quán)利要求48-51的任一項(xiàng)的方法，其中所述生物反應(yīng)器包括用于灌注培養(yǎng)基通過(guò)毛細(xì)管系統(tǒng)的工具和用于在毛細(xì)管系統(tǒng)中進(jìn)行氣體交換的工具。
53.權(quán)利要求52的方法，其中在所述生物反應(yīng)器中，生長(zhǎng)培養(yǎng)基的灌注通過(guò)毛細(xì)管系統(tǒng)發(fā)生，并且氣體交換通過(guò)中空纖維膜系統(tǒng)發(fā)生。
54.權(quán)利要求48-53的任一項(xiàng)的方法，其中毛細(xì)管系統(tǒng)以及一個(gè)或多個(gè)中空纖維膜經(jīng)配置形成整合在室中的獨(dú)立的交織的纖維毛細(xì)管膜系統(tǒng)。
55.權(quán)利要求1-46的任一項(xiàng)中獲得的細(xì)胞用于治療目的、藥物發(fā)現(xiàn)、藥物配制、毒性測(cè)試或再生醫(yī)學(xué)中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及3D培養(yǎng)系統(tǒng)用于從人多潛能干細(xì)胞(hPS)衍生肝細(xì)胞樣細(xì)胞的用途。特別地，本發(fā)明涉及人多潛能干細(xì)胞在3D中空纖維毛細(xì)管生物反應(yīng)器中至肝細(xì)胞樣細(xì)胞的定向分化和成熟。
文檔編號(hào)C02F3/12GK102459574SQ201080026712
公開(kāi)日2012年5月16日 申請(qǐng)日期2010年6月18日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月18日
發(fā)明者H·施塔赫爾沙伊德, J·延森, K·蔡林格, T·厄巴尼亞克 申請(qǐng)人:塞拉提斯股份公司