專利名稱：石油降解菌固定化方法及其應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物固定領(lǐng)域，具體地，涉及一種石油降解菌固定化方法及其應用。
背景技術(shù)：
隨著工業(yè)的不斷發(fā)展，全球多數(shù)地表水和地下水都受到不同程度的污染，嚴重威脅人們的身體健康。據(jù)估計全世界每年約有10億噸石油及其產(chǎn)品通過各種途徑進入地下水、地表水及土壤中。石油中的難降解化學物質(zhì)(如苯、甲苯、酚類等)可以通過食物鏈進入人體，引起急慢性中毒，損傷神經(jīng)系統(tǒng)。石油中的多環(huán)芳烴類物質(zhì)會影響皮膚、肝、腎等組織器官的正常功能，甚至會引發(fā)皮膚癌。關(guān)于水體中石油污染物的去除，目前使用較多的是采用人工濕地對受污染水體進行生物凈化的方法。生物凈化法是利用天然水中的微生物和植物，采用人工措施來創(chuàng)造更有利的生長繁殖的環(huán)境，從而可提高對污染水體有機物的降解效率，將廢水中的有機物質(zhì)轉(zhuǎn)化為較穩(wěn)定的或者礦質(zhì)形態(tài)物質(zhì)的過程。在自然條件下的凈污能力十分有限，尤其是針對特殊污染物的降解，必須采取有效措施提高生物降解能力。微生物固定化技術(shù)是通過采用化學或物理的方法將游離微生物固定于限定空間區(qū)域內(nèi)，保留其固有活性，且能夠被重復和連續(xù)使用的現(xiàn)代生物工程工藝。由于微生物固定化技術(shù)具有處理效率高、運行穩(wěn)定、可純化和保持高效優(yōu)勢菌種、反應器生物量大、固液分離效果好以及運營成本低的優(yōu)點，目前該技術(shù)在處理氮、氨等富含營養(yǎng)物質(zhì)的生活和生產(chǎn)廢水中應用廣泛，但在涉及微生物降解水體中石油污染物的實際應用極少。專利 CN101768583A報道了一種以蘆葦秸稈為載體的石油降解菌固定化方法，效果也并不好，20 天后對石油污染水的凈化效果僅為71%，而且蘆葦秸稈的使用壽命有限，不利于大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化、商品化。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有的缺陷，提供了一種石油降解菌固定化方法，該方法具有成本低、利于大規(guī)模應用及凈化效率高的優(yōu)點。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了如下的技術(shù)方案 一種石油降解菌固定化方法，包括以下步驟
(1)石油降解菌的馴化、分離及純化；
(2)石油降解菌在聚乙烯泡沫上的固定化。具體地，步驟(1)所述石油降解菌的馴化包括以下過程吸取石油污染的水加入液體富集培養(yǎng)基中，在25-35°C、80-120r/min的條件下于振蕩搖床上培養(yǎng)7 10天，待培養(yǎng)液混濁后，吸取相同體積的培養(yǎng)液注入新的液體富集培養(yǎng)基中；重復上述操作至少五次。具體地，所述液體富集培養(yǎng)基包含以下重量分數(shù)的組分0.2-0.3% (NH4)2SO4, 0. 03-0. 05%酵母浸膏、1- 石油污染物及0. 1-0. 2%Na2HP04 ；所述液體富集培養(yǎng)基以石油污染物為唯一碳源，其PH為6. 8-7. 2，滅菌使用。
具體地，步驟(1)所述石油降解菌的分離及純化包括以下過程取馴化后的液體富集培養(yǎng)基中單菌落稀釋分離，涂布在固體營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，在30-35°C進行恒溫培養(yǎng) 30-50小時，得到分離、純化的石油降解菌株；將純化菌株接入固體營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基試管斜面，30-35°C恒溫培養(yǎng)M-48小時，待菌生長豐滿后，放入4°C冰箱保存?zhèn)溆?。具體地，所述固體營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基包含以下重量分數(shù)的組分8-10%蛋白胨，2-3% 牛肉浸膏，5_6%NaCl，1. 7- 瓊脂；所述固體營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的pH為7. 0，滅菌使用。具體地，步驟(2)所述石油降解菌在聚乙烯泡沫上的固定化包括以下過程將步驟(1)得到的石油降解菌接種于液體營養(yǎng)培養(yǎng)基中，在25-35°C、80-100r/min條件下培養(yǎng) 2-3天至培養(yǎng)基中石油降解菌的數(shù)量為IO8個/mL以上時，與滅菌后的聚乙烯醇泡沫充分混勻，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)2-3天。具體地，所述液體營養(yǎng)培養(yǎng)基包含以下重量分數(shù)的組分8-10%蛋白胨、2-3%牛肉浸膏及 5-6%NaCl，pH 為 7. 0。具體地，所述聚乙烯醇泡沫是體積為Icm3的聚乙烯醇正方體泡沫。本發(fā)明提出的石油降解菌固定化方法在凈化被石油污染的水體中的應用。在應用中，首先在污水中添加礦物鹽(即尿素和磷酸銨)，使污水中的C:N: P=IOO 10 1 (質(zhì)量比)，同時把pH調(diào)為6. 5-7. 5，將固定于聚乙烯泡沫的石油降解菌放入柱形反應容器中形成固定床，該反應器主要包括一個水和礦物鹽存儲罐，一個石油污染物存儲罐，一個充填了泡沫的柱狀反應罐(固定床)，一個壓縮空氣泵，以及一個吸附揮發(fā)有機氣體的活性炭小瓶。這樣就可以通過一個來回活動的泵將石油污染物不斷地注入水中，經(jīng)由內(nèi)置的攪拌系統(tǒng)將水與污染物充分混合，使污染液從反應罐的頂部流入，反應后液體從底部流出，被污染的水流過泡沫流動床，首先被其中的充填物吸收，然后被固定在填充物里面的微生物菌叢降解。壓縮空氣泵提供的空氣逆流，給這些微生物的混合物帶來氧氣，在反應器的下游，安裝有一個活性炭瓶，已經(jīng)轉(zhuǎn)化成氣體的污染物在通過時可以被活性炭吸附。這種穩(wěn)定、連續(xù)的處理方式能盡量降低將填充物內(nèi)的淤積現(xiàn)象。污水在該柱形容器中的滯停時間根據(jù)污染物的種類和濃度設(shè)定為0. 5-2小時。本發(fā)明所提出的石油降解菌固定化方法具有以下有益效果
(1)使用固定化材料為聚乙烯醇泡沫，對微生物的固定作用效果好、壽命長、成本低，有利于商品化、產(chǎn)業(yè)化。(2)通過穩(wěn)定、連續(xù)的處理方式，污染物首先被填充物吸收，然后被固定在填充物里面的微生物降解。這種方式的優(yōu)勢在于，能夠保證固定物內(nèi)部更好的物質(zhì)轉(zhuǎn)換，解決了目前石油生物降解中效率低下的技術(shù)問題。(3)經(jīng)實地工程運作實踐檢驗，使用固定床的設(shè)備和工藝操作方便、無需加熱能耗小、固液分離效果好、運營維護成本低。具體的有益效果將體現(xiàn)在隨后的實施例中。


附圖用來提供對本發(fā)明的進一步理解，并且構(gòu)成說明書的一部分，與本發(fā)明的實施例一起用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對本發(fā)明的限制。在附圖中
圖1是本發(fā)明的應用的流程示意圖。
具體實施例方式以下結(jié)合附圖對本發(fā)明的優(yōu)選實施例進行說明，應當理解，此處所描述的優(yōu)選實施例僅用于說明和解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。固定化實施例 實施例1
(1)石油降解菌的馴化、分離及純化
馴化吸取ImL石油污染的水加入液體富集培養(yǎng)基中，在30°c、100r/min的條件下于振蕩搖床上培養(yǎng)8天；待培養(yǎng)液混濁后，吸取ImL培養(yǎng)液注入新的液體富集培養(yǎng)基中，重復上述操作五次完成石油降解菌的馴化；
其中，所述液體富集培養(yǎng)基包含以下重量分數(shù)的組分0. 2% (NH4)2SO4，0. 04%酵母浸膏，2%石油污染物，0. l%Na2HP04,調(diào)pH至7. 0，分裝在250mL錐形三角搖瓶，每瓶裝液量為 IOOmL,滅菌后冷卻至室溫。分離及純化取馴化后的液體富集培養(yǎng)基中單菌落稀釋分離，涂布在固體營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，在30°C進行恒溫培養(yǎng)48小時，得到分離、純化的石油降解菌株；將純化菌株接入固體營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基試管斜面，3(TC恒溫培養(yǎng)M小時，待菌生長豐滿后，放入4°C冰箱保存?zhèn)溆?。其中，固體營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基包含以下重量分數(shù)的組分8%蛋白胨二％牛肉浸膏， 5%NaCl，1. 8% 瓊脂，pH=7. 0，滅菌使用。(2)石油降解菌在聚乙烯泡沫上的固定化
將步驟(1)得到的石油降解菌接種于液體營養(yǎng)培養(yǎng)基中，在25°C、80r/min條件下培養(yǎng) 3天至培養(yǎng)基中石油降解菌的數(shù)量為8 X IO8個/mL，與滅菌后的聚乙烯醇泡沫充分混勻，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)2天，通過有機氮分析顯示有大量細菌被固定于泡沫中。實施例2
(1)石油降解菌的馴化、分離及純化
馴化吸取ImL石油污染的水加入液體富集培養(yǎng)基中，在25°C、80r/min的條件下于振蕩搖床上培養(yǎng)10天；待培養(yǎng)液混濁后，吸取ImL培養(yǎng)液注入新的液體富集培養(yǎng)基中，重復上述操作七次完成石油降解菌的馴化；
其中，所述液體富集培養(yǎng)基包含以下重量分數(shù)的組分0. 3% (NH4)2SO4，0. 05%酵母浸膏，1%石油污染物，0. 2%Na2HP04,調(diào)pH至6. 8，分裝在250mL錐形三角搖瓶，每瓶裝液量為 IOOmL,滅菌后冷卻至室溫。分離及純化取馴化后的液體富集培養(yǎng)基中單菌落稀釋分離，涂布在固體營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，在35°C進行恒溫培養(yǎng)30小時，得到分離、純化的石油降解菌株；將純化菌株接入固體營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基試管斜面，30°C恒溫培養(yǎng)48小時，待菌生長豐滿后，放入4°C冰箱保存?zhèn)溆?。其中，固體營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基包含以下重量分數(shù)的組分10%蛋白胨，3%牛肉浸膏， 6%NaCl，1. 7% 瓊脂，pH=7. 0，滅菌使用。(2)石油降解菌在聚乙烯泡沫上的固定化
將步驟(1)得到的石油降解菌接種于液體營養(yǎng)培養(yǎng)基中，在25°C、80r/min條件下培養(yǎng) 3天至培養(yǎng)基中石油降解菌的數(shù)量為2X IO8個/mL，與滅菌后的體積為Icm3的聚乙烯醇正方體泡沫充分混勻，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)3天，通過有機氮分析顯示有大量細菌被固定于泡沫中。 其中，液體營養(yǎng)培養(yǎng)基包含以下重量分數(shù)的組分8%蛋白胨、2%牛肉浸膏及5%NaCl，pH為 7. 0。實施例3
(1)石油降解菌的馴化、分離及純化
馴化吸取ImL石油污染的水加入液體富集培養(yǎng)基中，在30°C、120r/min的條件下于振蕩搖床上培養(yǎng)7天；待培養(yǎng)液混濁后，吸取ImL培養(yǎng)液注入新的液體富集培養(yǎng)基中，重復上述操作六次完成石油降解菌的馴化；
其中，所述液體富集培養(yǎng)基包含以下重量分數(shù)的組分0. 3% (NH4)2SO4，0. 03%酵母浸膏，2%石油污染物，0. l%Na2HP04,調(diào)pH至7. 2，分裝在250mL錐形三角搖瓶，每瓶裝液量為 IOOmL,滅菌后冷卻至室溫。分離及純化取馴化后的液體富集培養(yǎng)基中單菌落稀釋分離，涂布在固體營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，在32°C進行恒溫培養(yǎng)40小時，得到分離、純化的石油降解菌株；將純化菌株接入固體營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基試管斜面，35°C恒溫培養(yǎng)32小時，待菌生長豐滿后，放入4°C冰箱保存?zhèn)溆?。所用固體營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基成分與實施例2相同。(2)石油降解菌在聚乙烯泡沫上的固定化
將步驟(1)得到的石油降解菌接種于液體營養(yǎng)培養(yǎng)基中，在30°C、90r/min條件下培養(yǎng) 3天至培養(yǎng)基中石油降解菌的數(shù)量為6X IO8個/mL，與滅菌后的體積為Icm3的聚乙烯醇正方體泡沫充分混勻，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)3天，通過有機氮分析顯示有大量細菌被固定于泡沫中。 其中，液體營養(yǎng)培養(yǎng)基成分與實施例2相同。應用實施例實施例4
石油降解菌由實施例1固定化；
污水水與汽油充分混合配制成污水，其中，污水中石油烴含量為50000ppb，苯含量為 IOOppb,甲苯含量為lOOOppb，乙苯含量為500ppb，二甲苯含量為400ppb。在污水中添加尿素和磷酸銨，使使污水中的C =N =P (質(zhì)量比)為100 10 :1，同時把 pH調(diào)為7. 0。如圖1所示，圖1為本發(fā)明應用的流程示意圖，將固定于大量聚乙烯泡沫的石油降解菌放入柱形反應容器中形成固定床，壓縮空氣泵將污水以及水和礦物鹽抽入并進行充分混合，混合后的污染液從固定床的頂部流入，被其中的充填物吸收，然后被固定在填充物里面的微生物菌叢降解，反應后液體從底部流出，首先被其中的充填物吸收，然后被固定在填充物里面的微生物菌叢降解。在固定床的下端，壓縮空氣泵提供的空氣逆流給微生物提供氧氣，在固定床的下游頂端，安裝有一個活性炭瓶，已經(jīng)轉(zhuǎn)化成氣體的污染物在通過時可以被活性炭吸附。污水在10升的柱形容器中的滯停時間設(shè)定為0. 5小時，控制該過程中的溫度在M°C，壓縮空氣泵提供的空氣的通氣量0. 12VVM。對處理前和處理后水中的石油烴和BETX (苯、甲苯、乙苯、二甲苯)定期(每周兩次) 進行分析發(fā)現(xiàn)，石油烴去除率達92%，BETX去除率達96%。在連續(xù)系統(tǒng)中進行5周試驗，處理結(jié)果相當穩(wěn)定。
實施例5
與實施例4不同的是
石油降解菌由實施例2固定化；
控制該過程中的溫度在12°C，通氣量0. 15VVM。對處理前和處理后水中的石油烴和BETX (苯、甲苯、乙苯、二甲苯)都定期(每周兩次)進行分析。石油烴去除率達89%，BETX去除率達84%。在連續(xù)系統(tǒng)中進行了 5周試驗， 在整個運行過程中，處理結(jié)果相當穩(wěn)定。實施例6
與實施例4不同的是 石油降解菌由實施例3固定化；
污水在10升的柱形容器中的滯停時間設(shè)定為1小時，通氣量0. 13VVM。對處理前和處理后水中的石油烴和BETX (苯、甲苯、乙苯、二甲苯)都定期(每周兩次)進行分析。處理結(jié)果為石油烴去除率達98%，BETX去除率達98%。對該結(jié)果作了進一步物質(zhì)平衡的分析對于石油烴，生物降解占92. 6%，出水殘留占1. 7%，基質(zhì)吸附占5. 7% ；對于 BETX 生物降解占78. 1%，揮發(fā)占20. 3%，出水殘留占1. 5%，基質(zhì)吸附0. 8%。在連續(xù)系統(tǒng)中進行了 5周試驗，在整個運行過程中，處理結(jié)果相當穩(wěn)定。實施例7 實地檢測
石油降解菌由實施例2固定化；
污水取自汽油、柴油存儲地的地下水，石油烴濃度為7000 ppb, BETX濃度為50ppb。在污水中添加尿素和磷酸銨，使使污水中的C =N =P=IOO :10 :1，同時把pH調(diào)為7， 污水在500升柱形容器中的滯停時間設(shè)定為2小時，該過程中的溫度在25°C之間，通氣量 35L / ho對處理前和處理后水中的石油烴和BETX (苯、甲苯、乙苯、二甲苯)實時進行分析。處理結(jié)果為石油烴去除率為92%，主要為生物降解，BETX去除率為96%，其中揮發(fā)占1%，生物降解占76%，吸附占m。該項目共處理370噸污水，時間為10周，在整個運行過程中，處理結(jié)果相當穩(wěn)定。最后應說明的是以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實施例而已，并不用于限制本發(fā)明， 盡管參照前述實施例對本發(fā)明進行了詳細的說明，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，其依然可以對前述各實施例所記載的技術(shù)方案進行修改，或者對其中部分技術(shù)特征進行等同替換。 凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種石油降解菌固定化方法，其特征在于，包括以下步驟(1)石油降解菌的馴化、分離及純化；(2)石油降解菌在聚乙烯泡沫上的固定化。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的石油降解菌固定化方法，其特征在于，步驟(1)所述石油降解菌的馴化包括以下過程吸取石油污染的水加入液體富集培養(yǎng)基中，在25-35°C、80-120r/ min的條件下于振蕩搖床上培養(yǎng)7 10天，待培養(yǎng)液混濁后，吸取相同體積的培養(yǎng)液注入新的液體富集培養(yǎng)基中；重復上述操作至少五次。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的石油降解菌固定化方法，其特征在于，所述液體富集培養(yǎng)基包含以下重量分數(shù)的組分0. 2-0. 3% (NH4)2SO4^O. 03-0. 05%酵母浸膏、1- 石油污染物及 0. 1-0. 2%Na2HP04 ；所述液體富集培養(yǎng)基以石油污染物為唯一碳源，其pH為6. 8-7. 2，滅菌使用。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的石油降解菌固定化方法，其特征在于，步驟(1)所述石油降解菌的分離及純化包括以下過程取馴化后的液體富集培養(yǎng)基中單菌落稀釋分離，涂布在固體營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，在30-35°C進行恒溫培養(yǎng)30-50小時，得到分離、純化的石油降解菌株；將純化菌株接入固體營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基試管斜面，30-35°C恒溫培養(yǎng)M-48小時，待菌生長豐滿后，放入4°C冰箱保存?zhèn)溆谩?br> 5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的石油降解菌固定化方法，其特征在于，所述固體營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基包含以下重量分數(shù)的組分8-10%蛋白胨，2-3%牛肉浸膏，5-6%NaCl，l. 7- 瓊脂；所述固體營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的PH為7. 0，滅菌使用。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的石油降解菌固定化方法，其特征在于，步驟(2)所述石油降解菌在聚乙烯泡沫上的固定化包括以下過程將步驟(1)得到的石油降解菌接種于液體營養(yǎng)培養(yǎng)基中，在25-35°C、80-100r/min條件下培養(yǎng)2_3天至培養(yǎng)基中石油降解菌的數(shù)量為IO8 個/mL以上時，與滅菌后的聚乙烯醇泡沫充分混勻，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)2-3天。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的石油降解菌固定化方法，其特征在于，所述液體營養(yǎng)培養(yǎng)基包含以下重量分數(shù)的組分8-10%蛋白胨、2-3%牛肉浸膏及5-6%NaCl，pH為7. 0。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的石油降解菌固定化方法，其特征在于，所述聚乙烯醇泡沫是體積為Icm3的聚乙烯醇正方體泡沫。
9.權(quán)利要求1-8任意一項所述石油降解菌固定化方法在凈化被石油污染的水體中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種石油降解菌固定化方法，屬于微生物固定領(lǐng)域，具體地，包括石油降解菌的馴化、分離及純化以及石油降解菌在聚乙烯泡沫上的固定化。同時，本發(fā)明公開了其在凈化被石油污染的水體中的應用。本發(fā)明所提出的石油降解菌固定化方法及其應用具有成本低、利于大規(guī)模應用及凈化效率高的優(yōu)點。
文檔編號C02F3/34GK102433318SQ201210006059
公開日2012年5月2日 申請日期2012年1月10日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月10日
發(fā)明者李建洲, 雷繼雨 申請人:江蘇麥可博生物環(huán)保工程技術(shù)有限公司