一種用于鉛鉻污染修復(fù)的芽孢桿菌cp-1及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及修復(fù)鉛鉻污染的芽孢桿菌CP-1及其應(yīng)用，可有效解決修復(fù)鉛鉻污染的微生物問題，方法是，將鉻污染土壤與滅菌水制成混懸液，涂布于LB固體培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)，挑取各個單菌落平板劃線法劃線于LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃恒溫培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)；取單菌落分別接種于含六價鉻的LB固體培養(yǎng)基平板上和含鉛的LB固體培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)，挑取單菌落平板劃線法劃線于LB固體培養(yǎng)基平板上過夜培養(yǎng)；將1株細(xì)菌菌株分離純化，經(jīng)生理生化和16S rDNA測定芽孢桿菌P-1（ Bacillus sp），分類命名為芽孢桿菌，保藏號為CGMCC No.9989；再經(jīng)K2Cr2O7LB液體培養(yǎng)基和(CH3COO)2Pb LB液體培養(yǎng)基的芽孢桿菌CP-1（ Bacillus sp）馴化，成種子液，即成，本發(fā)明芽孢桿菌CP-1能有效去除鉛、六價鉻，操作簡單，經(jīng)濟(jì)有效，環(huán)境友好。
CGMCC No.9989
20141120
【專利說明】一種用于鉛鉻污染修復(fù)的芽孢桿菌CP-1及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及微生物領(lǐng)域，特別是一種用于鉛鉻污染修復(fù)的芽孢桿菌CP-1及其應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002]隨著工業(yè)的迅猛發(fā)展，重金屬污染問題日益嚴(yán)重。土壤中或水中的重金屬離子可以作為中心離子與土壤中的水、羥基、氨以及一些有機質(zhì)中的某些分子形成螯合物，并在土壤中迀移轉(zhuǎn)化，易于被植物或微生物吸收利用，超標(biāo)的重金屬還可通過污染糧食和肉蛋等農(nóng)副產(chǎn)品，在食物鏈中蓄積、傳遞和放大，繼而通過食物鏈進(jìn)入人體，引起各種生理功能改變，導(dǎo)致各種急慢性疾病，如慢性中毒、致癌和致畸等，嚴(yán)重威脅生態(tài)環(huán)境和人類健康。另夕卜，重金屬一旦污染環(huán)境，很難自然修復(fù)，因此，研宄重金屬污染的脫污修復(fù)技術(shù)，對保護(hù)生態(tài)環(huán)境、呵護(hù)人類健康意義重大。
[0003]鉛和鉻是毒性極強的重金屬，也是國際公認(rèn)的致癌金屬物，嚴(yán)重危害生態(tài)環(huán)境和人類健康。目前，已建立的鉛和六價鉻污染修復(fù)方法主要有物理，化學(xué)，生物等方法。常用的物理、化學(xué)方法成本高，操作復(fù)雜，且容易造成二次污染。而生物修復(fù)技術(shù)憑借二次污染較小、處理形式多樣、操作相對簡單、對環(huán)境的擾動較小且不破壞植物生長所需要的土壤環(huán)境等優(yōu)點，越來越受人們的關(guān)注。目前已分離出多種分別對鉛和六價鉻有作用的菌種，然而，利用所分離出來的菌株進(jìn)行鉛鉻污染土壤的實際修復(fù)的研宄卻相對較少。并且，土壤重金屬污染往往不是重金屬的單一污染，而是多重污染，只是各種重金屬污染程度不同。因此，本領(lǐng)域迫切需要獲得能去除不止一種重金屬、耐受力強的菌株應(yīng)用于鉛鉻污染土壤的實際修復(fù)，但至今未見有能夠?qū)ｉT用于鉛鉻污染土壤實際修復(fù)的微生物的公開報導(dǎo)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]針對上述情況，為克服現(xiàn)有技術(shù)之缺陷，本發(fā)明之目的就是提供一種修復(fù)鉛鉻污染的芽孢桿菌CP-1及其應(yīng)用，可有效解決修復(fù)鉛鉻污染的微生物問題。
[0005]本發(fā)明解決的技術(shù)方案是，該微生物是芽孢桿菌CP-1，分類命名為芽孢桿菌{Bacillus sp)，2014年11月20日保藏于保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC N0.9989，保藏地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號。
[0006]所述的保藏號為CGMCC N0.9989的芽孢桿菌CP-1在修復(fù)鉛鉻污染物中的應(yīng)用；所述的污染物為土壤或水。
[0007]所述的保藏號為CGMCC N0.9989的芽孢桿菌CP-1在制備修改鉛鉻污染的菌劑中的應(yīng)用，所述的菌劑的制備方法是:
(1)、將鉻污染土壤與滅菌水制成混懸液，涂布于LB固體培養(yǎng)基平板上，30°C培養(yǎng)I?2天，挑取各個單菌落平板劃線法劃線于LB固體培養(yǎng)基平板上，37°C恒溫培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)，4°C保存；
(2)、取上述單菌落分別接種于含六價鉻的LB固體培養(yǎng)基平板上和含鉛的LB固體培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)，挑取單菌落平板劃線法劃線于LB固體培養(yǎng)基平板上過夜培養(yǎng)，備用；
(3)、將上述既能在含六價鉻的LB固體培養(yǎng)基上生長又能在含Pb的LB固體培養(yǎng)基上生長的I株細(xì)菌菌株分離純化，經(jīng)生理生化和16S rDNA測定芽孢桿菌CP-KfeciBm sp),分類命名為芽孢桿菌，2014年11月20日保藏于保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC N0.9989 ；
(4 )、再經(jīng)K2Cr2O7LB液體培養(yǎng)基和(CH3COO) 2Pb LB液體培養(yǎng)基的芽孢桿菌CP-1{Bacillus sp)馴化，成種子液，即為去除鉛和六價鉻的菌劑。
[0008]本發(fā)明芽孢桿菌CP-1為一種新的微生物，可有效用于對鉛鉻污染的修復(fù)，特別是對鉛鉻污染土壤的修復(fù)，可有效解決土壤或水中的重金屬污染問題，既能有效去除鉛，又能有效去除六價鉻。操作簡單，經(jīng)濟(jì)有效，環(huán)境友好，為鉛鉻污染生物修復(fù)的推進(jìn)提供了技術(shù)支撐，是微生物和對鉛鉻污染修復(fù)上的一大創(chuàng)新，經(jīng)濟(jì)和社會效益巨大。

【具體實施方式】
[0009]以下結(jié)合具體情況對本發(fā)明的【具體實施方式】作詳細(xì)說明。
[0010]本發(fā)明在具體實施中，該微生物是芽孢桿菌CP-1，分類命名為芽孢桿菌sp)，2014年11月20日保藏于保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為 CGMCC N0.9989。
[0011]所述的保藏號為CGMCC N0.9989的芽孢桿菌CP-1在修復(fù)鉛鉻污染物中的應(yīng)用；所述的污染物優(yōu)選為土壤或水；
所述的保藏號為CGMCC N0.9989的芽孢桿菌CP-1在制備鉛鉻污染菌劑中的應(yīng)用；
所述菌劑的制備方法是:
(1)、將絡(luò)污染土壤與滅菌水以重量比1: 9制成混懸液，然后再用混懸液10倍體積的滅菌水進(jìn)行稀釋，涂布于LB固體培養(yǎng)基平板上，30°C培養(yǎng)I?2天，挑取單菌落，平板劃線法劃線于LB固體培養(yǎng)基平板上，37°C恒溫培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)，成含有培養(yǎng)基的菌落，4°C保存；其中LB固體培養(yǎng)基為:蛋白胨lg，酵母提取物0.5g，氯化鈉0.5g，加蒸飽水至100mL，調(diào)PH至7.2?7.4，加瓊脂1.5%?2.0%，高壓滅菌；所說的滅菌水是蒸餾水經(jīng)滅菌后的水；
(2)、取上述含有培養(yǎng)基的菌落分別接種于含六價鉻濃度為100mg/L的LB固體培養(yǎng)基平板上和含鉛濃度為300mg/L的LB固體培養(yǎng)基平板上，30°C培養(yǎng)I?2天后，分別挑取單菌落，采用平板劃線法劃線于LB固體培養(yǎng)基平板上，37°C恒溫培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)，成既能在含100mg/L六價鉻的LB固體培養(yǎng)基上生長又能在含300mg/L的Pb的LB固體培養(yǎng)基上生長的菌株，4°C保存?zhèn)溆茫?br> 含六價鉻濃度為100mg/L的LB固體培養(yǎng)基為:蛋白胨lg，酵母提取物0.5g，氯化鈉
0.5g，加蒸飽水至10mL,調(diào)PH至7.2?7.4，加瓊脂1.5%?2.0%，高壓滅菌后冷卻至50°C，添加過濾滅菌后的K2Cr2O7，使六價鉻濃度為100mg/L制成；含鉛濃度為300mg/L的LB固體培養(yǎng)基為:蛋白胨lg，酵母提取物0.5g，氯化鈉0.5g，加蒸飽水至10mLdjf PH至7.2?7.4，加瓊脂1.5%?2.0%，尚壓滅囷后冷卻至50 C，添加過濾滅囷后的(CH3COO)2Pb，使鉛濃度為300mg/L制成；
(3)、將上述既能在含100mg/L六價鉻的LB固體培養(yǎng)基上生長又能在含300mg/L的Pb的LB固體培養(yǎng)基上生長的I株細(xì)菌菌株分離純化，經(jīng)生理生化和16S rDNA測定為芽孢桿菌CP-1，分類命名為芽孢桿菌(ifeci77心sp)，4°C保存，并于2014年11月20日保藏于保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC N0.9989 ；
(4)、再經(jīng)K2Cr2O7LB液體培養(yǎng)基和(CH3COO) 2Pb LB液體培養(yǎng)基馴化，方法是，取上述芽孢桿菌CP-1分別接種于K2Cr2O7LB液體培養(yǎng)基和(CH3COO)2Pb LB液體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)2天后，再分別接種于含鉻質(zhì)量濃度為150mg/L的K2Cr2O7LB液體培養(yǎng)基和含鉛質(zhì)量濃度為400mg/L的(CH3COO) 2Pb LB液體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)2天后，再分別接種于含鉻質(zhì)量濃度為200mg/L的K2Cr2O7LB液體培養(yǎng)基和含鉛質(zhì)量濃度為500mg/L的(CH3COO) 2Pb LB液體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)2天后，再分別接種于含鉻質(zhì)量濃度為250mg/L的液體培養(yǎng)基和含鉛質(zhì)量濃度為600mg/L的(CH3COO) 2Pb LB液體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)2天，以此連續(xù)培養(yǎng)，每次使得鉻質(zhì)量濃度增加50mg/L，至鉻最終濃度達(dá)250mg/L，鉛質(zhì)量濃度增加100mg/L，至鉛最終濃度達(dá)600mg/L為止，成馴化的菌株，將馴化r菌株接種于LB培養(yǎng)基斜面上，制成斜面菌種，_4°C保存；將斜面菌種在鉻濃度為100mg/L的K2Cr2O7LB培養(yǎng)基上活化I?3天后，挑取單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)生長期，5000r/min離心lOmin，收集菌體，經(jīng)0.05mol/L、ρΗ7.4 的 Tris-HCl 洗滌 3 次，再用 0.05mol/L、ρΗ7.4 的 Tris-HCl 調(diào)整菌液濃度為 I X 101°個/mL，成種子液，該種子液即為去除鉛和六價鉻的細(xì)菌菌劑。
[0012]本發(fā)明經(jīng)實驗和試用，表明本發(fā)明微生物芽孢桿菌CP-1sp)具有很好的除去鉛和六價鉻的作用，有關(guān)實驗資料如下:
1、挑取芽孢桿菌CP-ι (BacilIussp)單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)生長期，5000r/min離心1min,收集菌體，經(jīng)0.05mol/L、pH7.4的Tris-HCl洗滌3次，再用0.05mol/L、pH7.4的Tris-HCl調(diào)整菌液濃度，使其濃度為I X 1ltl個/mL，成種子液，按4%的接種量接種于10mL含鉻濃度為100mg/L LB培養(yǎng)基中，同時以不接菌的LB培養(yǎng)基為對照，35°C培養(yǎng)3天后，二苯碳酰二肼法測得對六價鉻的去除率為87.7% ;將CP-1種子液按4%的接種量接種于10mL pH7.0含鉛濃度為600mg/L的(CH3COO)2Pb的LB培養(yǎng)基中，同時以不接菌的LB培養(yǎng)基為對照，35°C培養(yǎng)3天后，原子吸收分光光度法測得對鉛的去除率為97.4%。
[0013]2、將芽孢桿菌CP-1 {Bacillus sp)種子液按4%的接種量分別接種于不同pH (5、6、7、8、9)含鉻濃度100mg/L和含鉛濃度600mg/L LB培養(yǎng)基中，同時以不接菌的LB培養(yǎng)基為對照，30°C培養(yǎng)2天后，二苯碳酰二肼法測得對六價鉻的去除率為60.2%?79.7%，原子吸收分光光度法測得對鉛的去除率為86.7?93.3%。
[0014]3、將芽孢桿菌CP-1種子液按4%的接種量接種于100mLpH7.0含鉻濃度100mg/L和含鉛濃度為600mg/L的LB培養(yǎng)基中，同時以不接菌的LB培養(yǎng)基為對照，分別于25°C、30 V、35°C、40°C，培養(yǎng)2天后，二苯碳酰二肼法測得對六價鉻的去除率為66.4%?78.8%，原子吸收分光光度法測得對鉛的去除率為87.9?93.2%。
[0015]4、稱取1g過100目篩的鉻污染土壤(采自河南省三門峽義馬市，六價鉻含量為447.8mg/kg)于10mL滅菌水中，然后按6%的接種量接種上述芽孢桿菌CP-1 {Bacillussp)種子液于其中，37°C培養(yǎng)5~7天后，二苯碳酰二肼法測得六價鉻含量為137.82mg/kg，故其對六價鉻的去除率是69.2%。
[0016]5、稱取1g過100目篩的鉛污染土壤(采自河南省濟(jì)源市，鉛含量為183.6mg/kg)于10mL滅菌水中，然后按6%的接種量接種上述芽孢桿菌CP-1 {Bacillus sp)種子液于其中，37°C培養(yǎng)5~7天后，原子吸收分光光度法測得鉛含量為12.7mg/kg，故其對鉛的去除率是93.1%。
[0017]本發(fā)明經(jīng)多次反復(fù)實驗，均取得了與上述實驗相同或相近似的效果，表明本發(fā)明微生物及菌劑(種子液)能有效去除鉛和六價鉻，有效用于對鉛鉻污染的修復(fù)，特別適用于對鉛鉻污染土壤或水的修復(fù)，經(jīng)濟(jì)和社會效益巨大。
【權(quán)利要求】
1.一種修復(fù)鉛鉻污染的芽孢桿菌CP-1，分類命名為芽孢桿菌(Bacillus sp)，2014年11月20日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCCN0.9989。
2.權(quán)利要求1所述的保藏號為CGMCCN0.9989的芽孢桿菌CP-1在修復(fù)鉛鉻污染物中的應(yīng)用。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的保藏號為CGMCCN0.9989的芽孢桿菌CP-1在修復(fù)鉛鉻污染物中的應(yīng)用，其特征在于，所述的污染物為土壤或水。
4.權(quán)利要求1所述的保藏號為CGMCCN0.9989的芽孢桿菌CP-1在制備鉛鉻污染菌劑中的應(yīng)用。
5.權(quán)利要求4所述的保藏號為CGMCCN0.9989的芽孢桿菌CP-1在制備鉛鉻污染菌劑中的應(yīng)用，其特征在于，所述菌劑的制備方法是: (1)、將絡(luò)污染土壤與滅菌水以重量比1: 9制成混懸液，然后再用混懸液10倍體積的滅菌水進(jìn)行稀釋，涂布于LB固體培養(yǎng)基平板上，30°C培養(yǎng)I?2天，挑取單菌落，平板劃線法劃線于LB固體培養(yǎng)基平板上，37°C恒溫培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)，成含有培養(yǎng)基的菌落，4°C保存；其中LB固體培養(yǎng)基為:蛋白胨lg，酵母提取物0.5g，氯化鈉0.5g，加蒸飽水至100mL，調(diào)PH至7.2?7.4，加瓊脂1.5%?2.0%，高壓滅菌；所說的滅菌水是蒸餾水經(jīng)滅菌后的水； (2)、取上述含有培養(yǎng)基的菌落分別接種于含六價鉻濃度為100mg/L的LB固體培養(yǎng)基平板上和含鉛濃度為300mg/L的LB固體培養(yǎng)基平板上，30°C培養(yǎng)I?2天后，分別挑取單菌落，采用平板劃線法劃線于LB固體培養(yǎng)基平板上，37°C恒溫培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)，成既能在含100mg/L六價鉻的LB固體培養(yǎng)基上生長又能在含300mg/L的Pb的LB固體培養(yǎng)基上生長的菌株，4°C保存?zhèn)溆茫? 含六價鉻濃度為100mg/L的LB固體培養(yǎng)基為:蛋白胨lg，酵母提取物0.5g，氯化鈉.0.5g，加蒸飽水至10mL,調(diào)PH至7.2?7.4，加瓊脂1.5%?2.0%，高壓滅菌后冷卻至50°C，添加過濾滅菌后的K2Cr2O7，使六價鉻濃度為100mg/L制成；含鉛濃度為300mg/L的LB固體培養(yǎng)基為:蛋白胨lg，酵母提取物0.5g，氯化鈉0.5g，加蒸飽水至10mLdjf PH至7.2?.7.4，加瓊脂1.5%?2.0%，尚壓滅囷后冷卻至50 C，添加過濾滅囷后的(CH3COO)2Pb，使鉛濃度為300mg/L制成； (3)、將上述既能在含100mg/L六價鉻的LB固體培養(yǎng)基上生長又能在含300mg/L的Pb的LB固體培養(yǎng)基上生長的I株細(xì)菌菌株分離純化，經(jīng)生理生化和16SrDNA測定為芽孢桿菌CP-1 {Bacillus sp)，分類命名為芽孢桿菌，4°C保存，并于2014年11月20日保藏于保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC N0.9989 ； (4)、再經(jīng)K2Cr2O7LB液體培養(yǎng)基和(CH3COO)2Pb LB液體培養(yǎng)基馴化，方法是，取上述芽孢桿菌CP-1 {Bacillus sp)分別接種于K2Cr2O7LB液體培養(yǎng)基和(CH3COO)2Pb LB液體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)2天后，再分別接種于含鉻質(zhì)量濃度為150mg/L的K2Cr2O7LB液體培養(yǎng)基和含鉛質(zhì)量濃度為400mg/L的(CH3COO) 2Pb LB液體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)2天后，再分別接種于含鉻質(zhì)量濃度為200mg/L的K2Cr2O7LB液體培養(yǎng)基和含鉛質(zhì)量濃度為500mg/L的(CH3COO)2PbLB液體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)2天后，再分別接種于含鉻質(zhì)量濃度為250mg/L的液體培養(yǎng)基和含鉛質(zhì)量濃度為600mg/L的(CH3COO)2Pb LB液體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)2天，以此連續(xù)培養(yǎng)，每次使得鉻質(zhì)量濃度增加50mg/L，至鉻最終濃度達(dá)250mg/L，鉛質(zhì)量濃度增加100mg/L，至鉛最終濃度達(dá)600mg/L為止，成馴化的菌株，將馴化的菌株接種于LB培養(yǎng)基斜面上，制成斜面菌種，-4°C保存；將斜面菌種在鉻濃度為100mg/L的K2Cr2O7LB培養(yǎng)基上活化I?3天后，挑取單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)生長期，5000r/min離心lOmin，收集菌體，經(jīng) 0.05mol/L、ρΗ7.4 的 Tris-HCl 洗滌 3 次，再用 0.05mol/L、ρΗ7.4 的 Tris-HCl 調(diào)整菌液濃度為I X 101°個/mL，成種子液，該種子液即為去除鉛和六價鉻的細(xì)菌菌劑。
【文檔編號】C02F101/22GK104498404SQ201410807594
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2014年12月23日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月23日
【發(fā)明者】楊文玲, 鞏濤, 王繼雯, 慕琦, 甄靜, 劉瑩瑩, 李冠杰, 陳國參 申請人:河南省科學(xué)院生物研究所有限責(zé)任公司