一種利用重組脂肪氧合酶降解三苯甲烷類(lèi)染料的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種利用重組脂肪氧合酶降解三苯甲烷類(lèi)染料的 方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 三苯甲烷類(lèi)染料是一種多苯環(huán)化合物，使用面較廣，用量也較大，其產(chǎn)量被列為第 三大主要染料。其中某些染料及中間降解產(chǎn)物具有"三致"作用。且這類(lèi)染料中的一部分 難以降解，常常導(dǎo)致常規(guī)的生物處理系統(tǒng)處理效果不夠理想。行之有效的染料廢水處理方 法和技術(shù)是改善生態(tài)環(huán)境、保證食品安全和維護(hù)人類(lèi)健康的重要保證。生物法即通過(guò)篩選 或構(gòu)建具有高效性能的特定微生物菌株用于染料廢水的脫色，是一種經(jīng)濟(jì)、有效且適于大 規(guī)模廢水處理的技術(shù)。
[0003] 生物方法對(duì)染料的脫色主要通過(guò)降解和生物吸附兩方面發(fā)揮作用，降解是由微生 物分泌胞外氧化酶-木質(zhì)素降解酶系統(tǒng)進(jìn)行脫色，包括漆酶、木素過(guò)氧化物酶和錳過(guò)氧化 物酶等；而吸附主要是通過(guò)菌體的自身結(jié)構(gòu)與染料等大分子物質(zhì)相契合所致。因此，對(duì)用于 染料的生物脫色方法通常以微生物和酶為載體進(jìn)行研宄。
[0004] LOX屬于氧化還原酶，廣泛存在于植物體中，它的結(jié)構(gòu)中含有非血紅素鐵，能專(zhuān)一 催化含順，順一 1，4 一戊二烯的多不飽和脂肪酸及酯，通過(guò)分子加氫，形成具有共扼雙鍵的 氫過(guò)氧化衍生物，這些氫過(guò)氧化物性質(zhì)活潑，是重要的化學(xué)反應(yīng)中間體。LOX對(duì)于它作用的 底物具有特異性的要求，需要含有順，順一 1，4 一戊二烯的直鏈脂肪酸、脂肪酸酯和醇等。 例如，LOX通過(guò)與其天然底物亞油酸作用，是處于未活化狀態(tài)的酶中的還原態(tài)的Fe變成氧 化態(tài)的Fe，從而使酶激活?；罨瘧B(tài)的酶通過(guò)催化氧化亞油酸，生成氫過(guò)氧化物，不穩(wěn)定的氫 過(guò)氧化物將裂解產(chǎn)生脂質(zhì)自由基，脂質(zhì)自由基具有非常高的反應(yīng)活性，爭(zhēng)奪生物分子如蛋 白質(zhì)、多糖等的電子，進(jìn)而造成生物分子結(jié)構(gòu)的變化。
[0005] 三苯甲烷類(lèi)的染料是一類(lèi)帶有苯環(huán)及其他側(cè)鏈結(jié)構(gòu)的化合物，其降解過(guò)程即是其 結(jié)構(gòu)被破壞，產(chǎn)生無(wú)毒無(wú)害降解產(chǎn)物的過(guò)程。目前尚未見(jiàn)將脂肪氧合酶用于催化降解三苯 甲烷類(lèi)染料的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的現(xiàn)有缺陷，提供一種重組銅綠假單胞菌脂肪氧合 酶的應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明的另一目的是提供一種利用重組銅綠假單胞菌脂肪氧合酶降解三苯甲烷 類(lèi)染料的方法。
[0008] 本發(fā)明的目的可通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
[0009] 重組脂肪氧合酶rLOX-27853在降解三苯甲烷類(lèi)染料中的應(yīng)用，所述的重組脂肪 氧合酶rLOX-27853氨基酸序列如SEQIDNO. 2所示。
[0010] 其中，所述的三苯甲烷類(lèi)染料優(yōu)選孔雀石綠、亮綠或苯胺藍(lán)中的任意一種或多種。
[0011] 所述的重組脂肪氧合酶rLOX-27853優(yōu)選通過(guò)以下方法制備得到：
[0012] (1)從銅綠假單胞菌ATCC27853菌株基因組克隆SEQ ID NO. 1所示的脂肪氧合酶 基因；
[0013] (2)構(gòu)建脂肪氧合酶基因原核表達(dá)載體；
[0014] (3)在大腸桿菌中發(fā)酵生產(chǎn)所述的重組脂肪氧合酶rLOX-27853。
[0015] 所述的從銅綠假單胞菌ATCC27853菌株基因組克隆SEQIDNO. 1所示的脂肪氧合 酶基因優(yōu)選包含以下步驟：（1)提取保藏號(hào)為ATCC27853的銅綠假單胞桿菌的基因組DNA; (2)以F-2和R-2為上、下游引物，銅綠假單胞桿菌ATCC27853的基因組DNA為模板，PCR 擴(kuò)增脂肪氧合酶基因；（3)回收純化目標(biāo)PCR產(chǎn)物；其中，所述的引物F-2序列為：SEQID NO. 5,引物 R-2 序列為：SEQIDNO. 6。
[0016] 所述的構(gòu)建脂肪氧合酶基因原核表達(dá)載體優(yōu)選將步驟（1)克隆得到的脂肪氧合 酶基因插入載體pET-23a的SacI、XhoI酶切位點(diǎn)得到表達(dá)質(zhì)粒pET-23a-L0X-27853。將表 達(dá)質(zhì)粒pET-23a-L0X-27853通過(guò)熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達(dá)宿主菌株BL21 (DE3)pLysS獲得 重組大腸桿菌，對(duì)重組大腸桿菌進(jìn)行發(fā)酵，生產(chǎn)所述的重組脂肪氧合酶rLOX-27853。
[0017] 其中，發(fā)酵使用的發(fā)酵培養(yǎng)基配方為：l〇g/L乳糖，0.5g/L葡萄糖，5g/L甘 油，3. 4g/LKH2P04,1. 2g/L MgS04,10g/L 酶解酪蛋白酸鈉，5g/L 酵母提取物，8. 95g/ L Na2HP04. 12H20,1. 42g/LNa2S04, 2. 67g/L NH4C1 以及 lml 微量元素混合液；所述的微 量元素混合液配方為：50 y MFeCl3. 6H20, 20 y M CaCl2. 2H20, 10 y M MnCl2. 4H20, 10 y M ZnS04. 7H20, 2 y MCoC12. 6H20, 2 yMCuC12, 2 y M NiCl2, 2 y M Na2Se03, 2 y M H3B407.
[0018] -種利用重組脂肪氧合酶rLOX-27853降解三苯甲烷類(lèi)染料的方法，包含以下步 驟：
[0019] (1)以F-2和R-2為上、下游引物從銅綠假單胞菌ATCC27853菌株基因組克隆SEQ ID NO. 1所示的脂肪氧合酶基因；
[0020] ⑵將步驟⑴克隆得到的脂肪氧合酶基因插入載體pET-23a的SacI、XhoI酶切 位點(diǎn)得到表達(dá)質(zhì)粒pET-23a-L0X-27853 ;
[0021] (3)將表達(dá)質(zhì)粒pET-23a-L0X-27853通過(guò)熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達(dá)宿主菌株 BL21 (DE3) pLysS獲得重組大腸桿菌，對(duì)重組大腸桿菌進(jìn)行發(fā)酵，生產(chǎn)所述的重組脂肪氧合 酶 rLOX-27853 ;
[0022] (4)向含有亞油酸鈉和三苯甲烷類(lèi)染料的介質(zhì)中加入所述的重組脂肪氧合酶 rLOX-27853對(duì)其進(jìn)行降解。
[0023] 其中，所述的三苯甲烷類(lèi)染料為孔雀石綠、亮綠或苯胺藍(lán)中的任意一種或多種。
[0024] 有益效果：
[0025] 本發(fā)明人從銅綠假單胞菌ATCC27853基因組中，克隆獲得一種新型的原核脂肪氧 合酶基因L0X-27853,以大腸桿菌BL21 (DE3)pLysS為宿主菌，構(gòu)建基因工程菌，通過(guò)發(fā)酵的 方法，實(shí)現(xiàn)了重組銅綠假單胞菌脂肪氧合酶rLOX-27853異源高效生產(chǎn)。重組銅綠假單胞 菌脂肪氧合酶rLOX-27853應(yīng)用于高效地催化三苯甲烷類(lèi)染料孔雀石綠、亮綠、苯胺藍(lán)的降 解。
【附圖說(shuō)明】
[0026] 圖lrLOX-27853對(duì)苯胺藍(lán)的降解效果圖（A)及降解前后全波長(zhǎng)掃描圖（B)。
[0027] 圖2rLOX-27853對(duì)孔雀石綠的降解效果圖（A)及降解前后全波長(zhǎng)掃描圖（B)。
[0028] 圖3rLOX-27853對(duì)亮綠的降解效果圖（A)及降解前后全波長(zhǎng)掃描圖（B)。
【具體實(shí)施方式】
[0029] 以下通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的闡述。
[0030] 實(shí)施例1 :銅綠假單胞菌ATCC27853脂肪氧合酶基因（LOX-27853)的克隆
[0031] 離心收集銅綠假單胞菌ATCC27853菌體，用上海生工基因組DNA提取試劑盒提取 銅綠假單胞菌ATCC278