專利名稱：一種生物膜色譜介質(zhì)及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新型的生物膜色譜介質(zhì)及其制備方法。這種介質(zhì)填充的液相色譜柱或毛細(xì)管柱可以與高效液相色譜儀或電泳儀配套使用，可以用于建立藥物(包括肽類藥物)在人體內(nèi)的吸收及分布的可能狀況進行體外檢測的模型，也可從成分復(fù)雜的樣品中提取和制備一種或幾種活性組分。
通過活性篩選指導(dǎo)新藥物的開發(fā)已經(jīng)有幾十年的歷史了，一種新藥物的誕生往往是人們在篩選了8,000～10,000種化合物后才得到的，如此低的成功率是使得制藥公司非常關(guān)注新的更有效的藥物快速篩選方法和技術(shù)的主要原因。以往的藥物篩選只能在動物模型上進行，但這種方法勞動密集，耗時間長，而且只能是小規(guī)模篩選。為克服動物模型的種種不利因素，人們試圖建立各種高效、快速、準(zhǔn)確的體外藥物篩選方法。
從模擬人體細(xì)胞膜對藥物的吸收的角度進行藥物活性的評價，是近幾年藥物分析研究工作的新亮點。現(xiàn)在大多數(shù)的藥物學(xué)家相信一種化合物細(xì)胞膜的通透性對于它的活性起關(guān)鍵作用，因為絕大多數(shù)的藥物必須進入細(xì)胞才能表現(xiàn)它的活性而且內(nèi)用藥物還必須能透過目標(biāo)細(xì)胞的細(xì)胞膜才能起作用。而且藥物的活性、毒性、在體內(nèi)的分布及其它生理過程都與藥物在膜上的分配狀況相關(guān)。因而考察化合物的細(xì)胞膜的通透性是藥物活性篩選和評價的關(guān)鍵步驟之一。
常用的檢測藥物細(xì)胞膜的通透性的模型有有機溶劑—水系統(tǒng)如辛醇-水，ODS(十八烷基硅膠)為固定相的反相液相色譜系統(tǒng)以及人工培養(yǎng)的單層小腸絨毛細(xì)胞模型。前兩種模式都只能模擬藥物在膜上的疏水作用，而無法模擬膜磷脂的極性頭部與藥物的相互作用，而后一種則顯得繁瑣、費時。
生物膜色譜模型是用于考察藥物的細(xì)胞膜通透性的一種新的方法。通過藥物在生物細(xì)胞膜或細(xì)胞模擬膜固定相上的色譜保留的強弱，判斷藥物在細(xì)胞膜上通透能力的大小。由于固定相的組成及結(jié)構(gòu)與人體內(nèi)的細(xì)胞膜相同或非常類似，因而實驗結(jié)果能夠與藥物的體內(nèi)吸收及分布的實際情況基本吻合。
目前，已經(jīng)研制成功的生物膜色譜介質(zhì)有以下兩大類一類是以硅膠為固定化載體，采用共價鍵合的方法，在硅膠表面接上單層磷脂類似物，如磷脂酰膽堿類似物、磷脂酰絲氨酸類似物、磷脂酰乙醇胺類似物、磷脂酰甘油類似物等。另一類是以凝膠類基質(zhì)為載體，將卵磷脂、磷脂酰絲氨酸、腦磷脂等形成的脂質(zhì)體，通過凍融法、疏水吸附等方法固載到凝膠基質(zhì)表面。兩類介質(zhì)各有明顯的優(yōu)缺點，第一類介質(zhì)由于以硅膠為基質(zhì)因而能夠耐受較高的柱壓，可在較高流速下進行分離，而且由于采用了共價鍵合的方法，因而流動相中可以使用有機溶劑改善混合組分的分離效果；但最大的缺點是，硅膠表面為單磷脂層，且無流動性，與生物細(xì)胞膜的實際組成與結(jié)構(gòu)都存在一定的差別，因而所得結(jié)果的生物相關(guān)性往往不很令人滿意。第二類介質(zhì)以凝膠類基質(zhì)為載體，其生物相容性好，不可逆吸附效應(yīng)小；固載對象為脂質(zhì)體，脂質(zhì)體的脂雙層能夠很好的模擬生物細(xì)胞的細(xì)胞膜；但缺點也顯而易見，凝膠類基質(zhì)不能耐受較高的柱壓，因而分析過程中不能使用高的流速，分析速度也因此受到限制；且比表面積小，磷脂固載量低等。
本發(fā)明的目的在于提供一種既能耐受較高流速，能夠?qū)崿F(xiàn)快速分析，而且又有較好的生物相關(guān)性的生物膜色譜分離介質(zhì)及其制備方法。由這種方法制備的生物膜色譜介質(zhì)可以與液相色譜儀或電泳儀匹配直接對藥物在生物細(xì)胞膜上的通透情況進行測定，比直接用小鼠小腸模型更加簡便、省時，比辛醇—水系統(tǒng)模型的結(jié)果更可靠。
本發(fā)明提供的適合于檢測藥物膜通透性的生物膜分離介質(zhì)，其特征是以活化硅膠為基質(zhì)，再固載化脂質(zhì)體而得到的生物膜色譜基質(zhì)。所固載的脂質(zhì)體可根據(jù)需要，調(diào)整不同的組成。
在上述本發(fā)明的生物膜色譜介質(zhì)中，其特征是以硅膠為基質(zhì)，并固載化脂質(zhì)體。所述的固載化脂質(zhì)體為卵磷脂或磷脂混合物。而磷脂混合物是指卵磷脂與組成生物細(xì)胞膜的天然磷脂的混合物。
另外，所述硅膠的孔徑為100-300，粒徑為5-20μm。所述固載化脂質(zhì)體的固載量為150-300μmol/g硅膠。
本發(fā)明的生物膜色譜介質(zhì)的制備包以下述步驟1.活化硅膠；2.用溶解卵磷脂或磷脂混合物涂敷的有機溶劑浸泡活化硅膠；3.除去有機溶劑，干燥硅膠用含鹽的緩沖液中溶脹，然后洗去未固載的磷脂。
在上述的制備方法中，所述磷脂混合物為含上述含卵磷脂與天然磷脂的混合物，脂質(zhì)體的固載量為150-300μmol/g硅膠。
在上述的制備方法中，所述硅膠活化是將硅膠用鹽酸進行回流不少于1小時后，用水洗至中性。
另外，所述磷脂混合物是指卵磷脂與組成生物細(xì)胞膜的天然磷脂的混合物。所述硅膠為孔徑100-300，粒徑為5-20μm的硅膠，而所述有機溶劑最好為氯仿。
另外，在上述的制備方法中，有機溶劑可采用真空蒸發(fā)的方法除去。所述含鹽緩沖液為含100-200mmol的NaCl溶液。
具體地說生物膜色譜介質(zhì)的制備過程中首先要進行硅膠的活化，將硅膠置于15～25％(v/v)鹽酸中回流3～5h，大量水洗至中性，真空干燥箱中，于10～130℃下真空干燥過夜。將活化后的硅膠置于磷脂或磷脂混合物的氯仿溶液中震20～40min，然后在30～50℃，真空條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機溶劑，使磷脂與磷脂混合物涂敷在硅膠表面。使用前，用含100～200mmol NaCl的pH7.4的緩沖液浸泡2～4小時，使涂敷的卵磷脂或其混合物溶脹形成脂質(zhì)體。然后多次洗滌洗去未固載的磷脂。按上述方法制備的生物膜色譜介質(zhì)，磷脂的固載量可達(dá)150-300μmol/g硅膠。且由于以硅膠為基質(zhì)，因而能夠耐受較快流速，可在0.1～1ml/min的流速范圍內(nèi)進行分離與分析。下面通過實施例對本發(fā)明的色譜柱的應(yīng)用作進一步的說明。
實例1將硅膠(天津試劑二廠制，粒徑10μm，孔徑100-300)置于25％(v/v)鹽酸中回流5h，用大量水洗至中性，在真空干燥箱中，于120℃下真空干燥過夜。將活化后的硅膠置于磷脂或磷脂混合物的氯仿溶液中震40分，然后在40℃，真空條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機溶劑，使磷脂與磷脂混合物涂敷在硅膠表面。使用前，用含100～200mmol NaCl的pH7.4的緩沖液浸泡4小時，使涂敷的卵磷脂或其混合物溶脹形成脂質(zhì)體。然后多次洗滌洗去未固載的磷脂。經(jīng)檢測按上述方法制得的固定相的磷脂固載量在160-200μmol/g硅膠。
實例2用實施例1所制備的生物膜色譜柱對聚乙二醇、甘露糖、氫化可的松、皮質(zhì)甾酮、水楊酸、華法令等六種樣品分別在pH5.4，pH7.0，pH7.4三種含150mM NaCl的磷酸鹽緩沖液為流動相的條件下進行分離分析。

圖1顯示pH7.4時的分離譜圖。
對三組分離結(jié)果進行分析，取這六種樣品的保留時間與分子量的比值的對數(shù)值，并對三種pH下的對數(shù)值進行平均計算后，與六種樣品的小腸吸收常數(shù)進行擬合，結(jié)果顯示，擬合線性方程為y＝0.032x-3.01，線性相關(guān)系數(shù)為0.9365。
實例3，用實施例1所制備的50×4.6mm i.d.的生物膜色譜柱對中藥當(dāng)歸的甲醇提取液進行分離分析，流動相為含150mM NaCl的pH7.4的磷酸鹽緩沖液，分離結(jié)果如圖2所示。
由上述實例的結(jié)果可知，本發(fā)明的生物膜色譜介質(zhì)的制備過程簡便。這種介質(zhì)所填充的生物膜色譜柱可與液相色譜儀匹配用于藥物的細(xì)胞膜通透能力的測定，所得結(jié)果與藥物的小腸吸收系數(shù)有很好的線性相關(guān)性。
對附圖的簡單說明。
圖1為混合樣品的拆分譜圖。圖中，1-水楊酸，2-甘露醇，3-華法令，4-聚乙二醇，5-氫化可的松，6-皮質(zhì)甾酮。譜圖為200nm下的檢測結(jié)果。
圖2為當(dāng)歸的甲醇提取液在生物膜色譜柱上的分離譜圖。譜圖為200nm下的檢測結(jié)果。
權(quán)利要求
1.一種生物膜色譜介質(zhì)，其特征是以硅膠為基質(zhì)，并固載化脂質(zhì)體。
2.按照權(quán)利要求1所述的生物膜色譜介質(zhì)，其特征在于所固載化脂質(zhì)體為卵磷脂或磷脂混合物，而磷脂混合物是指卵磷脂與組成生物細(xì)胞膜的天然磷脂的混合物。
3.按照權(quán)利要求1所述的生物膜色譜介質(zhì)，其特征在于所述硅膠的孔徑為100-300，粒徑為5-20μm。
4.按照權(quán)利要求1、2或3所述的生物膜色譜介質(zhì)，其特征在于所述固載化脂質(zhì)體的固載量為150-300μmol/g硅膠。
5.一種按權(quán)利要求1所述生物膜介質(zhì)的制備方法，包括硅膠活化，用溶解卵磷脂或磷脂混合物的有機溶劑浸泡活化硅膠，除去有機溶劑，干燥硅膠用含鹽緩沖液浸泡，然后洗去未固載的磷脂。
6.按照權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于所述硅膠活化是將硅膠用鹽酸進行回流不少于1小時后，用水洗至中性。
7.按權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于所述硅膠為孔徑100-300，粒徑為5-20μm，所述磷脂混合物是指卵磷脂與組成生物細(xì)胞膜的天然磷脂的混合物。
8.按權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于所述有機溶劑為氯仿。
9.按權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于有機溶劑采用真空蒸發(fā)的方法除去。
10.按權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于所述含鹽緩沖液為含100-200mmolNaCl緩沖液。
全文摘要
一種生物膜色譜介質(zhì)是以硅膠作為基質(zhì)再固載化脂質(zhì)體而得到的。這種介質(zhì)所填充的生物膜色譜柱可與液相色譜儀匹配用于藥物的細(xì)胞膜通透能力的測定,所得結(jié)果與藥物的小腸吸收系數(shù)有很好的線性相關(guān)性,線性相關(guān)系數(shù)可達(dá)0.9365。由于這種新型生物膜色譜柱同時有較好的分離功能,因而可用于多種藥物的混合樣品(包括肽類藥物)的分離分析,所得結(jié)果能夠顯示各組分在體內(nèi)吸收及分布的大致趨勢。它還可用于蛋白、核酸的分離純化等領(lǐng)域。
文檔編號B01J20/10GK1369707SQ0110402
公開日2002年9月18日 申請日期2001年2月16日 優(yōu)先權(quán)日2001年2月16日
發(fā)明者毛希琴, 鄒漢法, 孔亮 申請人:中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所