專利名稱：金屬摻雜型納米沸石親和色譜分離材料的制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及的是一種納米技術領域的制備方法，具體涉及一種金屬摻雜型納米沸石親和色譜分離材料的制備方法。
背景技術：
隨著現(xiàn)代生命科學研究領域的不斷深入，明確闡明復雜生物樣品體系中功能生物大分子在生命活動中的作用與意義，以進一步探索目前嚴重威脅人類健康的重大疾病如癌癥、心血管病等的致病機制，已成為生命科學、醫(yī)學、藥理學等眾多相關學科關注的熱點問題。在這一研究過程中，建立有效的功能蛋白質分子的分離與純化技術，是一個十分關鍵性的環(huán)節(jié)。蛋白質的磷酸化和去磷酸化這一可逆過程參與了高等真核生物細胞信號轉導，細胞分化和細胞生長等幾乎所有的生命活動過程，建立簡便、快速、高選擇性的磷酸化蛋白的分離純化技術，已成為相關領域研究工作者關注的熱點問題。傳統(tǒng)固定金屬離子親和色譜技術中使用的大多是葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠等天然或合成高分子色譜基質材料，明顯存在機械強度差，難以提高淋洗速度；容易滋生微生物危險的缺點。
經對現(xiàn)有技術的文獻檢索發(fā)現(xiàn)，J.G.Krabbe等在《Journal ofChromatography A》(《色譜學雜志》，2006，1130卷2期287-295)，發(fā)表了題為“Selective detection and identification of phosphorylated proteins by simultaneousligand-exchange fluorescence detection and mass spectrometry”(“同時通過配基交換的熒光探測以及質譜方法對磷酸化蛋白進行選擇性分析及鑒定”)的文章，報道通過固定金屬離子親和色譜技術采用高分子色譜基質材料分離磷酸化蛋白質分子，但是，由于金屬離子等親和配基是通過離子間螯合作用同相應基質材料結合的，因此，淋洗過程中存在金屬離子等親和配基的流失等“瓶頸”問題，將直接影響生物分離體系中目標蛋白質分子等生物大分子的生物穩(wěn)定性，使其更進一步的實際應用受到限制。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術中的不足，提供一種金屬摻雜型納米沸石親和色譜分離材料的制備方法，使其通過調變特定形貌與組成結構的納米沸石關鍵合成技術的條件，將鐵和鈦等金屬親和活性位點通過水熱合成過程固定摻雜在相應無機納米沸石晶體材料的骨架結構中，從而低成本、簡便可控地制備得到剛性無機納米沸石親和色譜分離材料，特異性地實現(xiàn)目標低豐度磷酸化肽和磷酸化蛋白質分子的富集分離。
本發(fā)明是通過如下技術方案實現(xiàn)的，本發(fā)明方法具體步驟包括(1)稱取固體FeCl3.6H2O，溶解于去離子水中，得到濃度為0.11-0.15moL/L呈黃色的FeCl3溶液備用；(2)在鈦酸四丁酯中逐滴加入四乙基氫氧化胺，使兩者的摩爾比為0.04∶1-0.06∶1，充分攪拌3-4小時，至溶液呈透明狀；(3)在步驟(2)得到的溶液中加入質量百分數(shù)為80％-99％的白炭黑，快速攪拌，得到白色懸濁狀溶液，將步驟(1)配制好的FeCl3溶液逐滴加入到該白色懸濁狀溶液中，使溶液中FeCl3最終濃度為0.03-0.04moL/L，并迅速地充分攪拌；(4)將步驟(3)得到的溶液完全轉移至內襯聚四氟乙烯反應容器的不銹鋼反應釜中，然后在烘箱內于140-165℃下水熱晶化48-72小時，反應后，將反應產物利用去離子水反復清洗，至清洗后的懸浮溶液至中性后，80-100℃下干燥，得到一系列不同尺寸(300-500nm)的結構中固定摻雜有鐵和鈦活性位點的金屬摻雜型納米沸石親和色譜分離材料。
本發(fā)明通過向骨架結構中固定摻雜不同種類金屬元素(鐵和鈦)作為親和活性位點，制備金屬摻雜型納米沸石親和色譜分離材料，特異性地實現(xiàn)目標低豐度磷酸化肽和磷酸化蛋白質分子的富集分離。
對本發(fā)明制備的金屬摻雜型納米沸石親和色譜分離材料進行透射電鏡表征，結果表明本發(fā)明方法制備的鐵和鈦摻雜型納米沸石親和色譜分離材料，晶體顆粒粒度均勻、形狀規(guī)則、沒有膠態(tài)或無定形物質存在，表明產品為純相、結晶度很好、粒徑在300-500納米左右。此外，還對本發(fā)明制備的金屬摻雜型納米沸石親和色譜分離材料進行透射電鏡表征進行了XRD表征，結果顯示鐵和鈦摻雜型納米沸石親和色譜材料，具有鐵和鈦摻雜型納米沸石的全部特征衍射峰信號。
通過本發(fā)明方法制備的金屬摻雜型納米沸石親和色譜分離材料，具有優(yōu)良的物理化學穩(wěn)定性以及低反壓、高流速等特性，過程中能有效避免由于金屬活性位點的流失而引起的目標生物大分子的降解及結構的干擾變化，完全符合生物制品的生產規(guī)范和質量標準，可直接實現(xiàn)復雜生物樣品體系中目標磷酸化肽和磷酸化蛋白質分子等具有特定結構的低豐度功能生物大分子的特異性富集分離與靈敏鑒定，為實驗室規(guī)模和生產規(guī)模的具有特定結構的生物大分子富集分離提供一個技術平臺，并可以進一步發(fā)展成為分離純化具有特定結構的多肽、蛋白質、寡核苷酸及質粒DNA等的方法。
具體實施例方式
下面對本發(fā)明的實施例作詳細說明本實施例在以本發(fā)明技術方案為前提下進行實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護范圍不限于下述的實施例。
實施例1(1)稱取固體FeCl3.6H2O 0.196g，溶解于5.12g去離子水中，得到濃度為0.14moL/L呈黃色的FeCl3溶液備用；(2)稱取固體鈦酸四丁酯0.2934g，逐滴加入12.373g 25％四乙基氫氧化胺(兩者摩爾比為0.06∶1)，溶液共12.7mL，然后通過磁力攪拌器充分攪拌3小時，至溶液呈透明狀；(3)在步驟(2)所得溶液中加入2.346g質量百分數(shù)為99％的白炭黑，快速攪拌，得到白色懸濁狀溶液，將上述已配制好的FeCl3溶液逐滴加入到此溶液中，使FeCl3溶液的最終濃度為0.04moL/L，并迅速充分攪拌；(4)將步驟(3)所得溶液完全轉移至內襯聚四氟乙烯反應容器的不銹鋼反應釜中，在烘箱內140℃溫度下水熱晶化反應48小時，反應后，將反應產物利用去離子水反復清洗，至清洗后的懸浮溶液至中性后，100℃下干燥，得到一系列不同尺寸(300-500nm)的結構中固定摻雜有鐵和鈦活性位點的金屬摻雜型納米沸石親和色譜分離材料。
取0.5g/L的α磷酸化酪蛋白溶液5mL放入15mL離心管中，加入不同固液比(1∶1-6∶1)(g/L)的實施例1中制備的金屬摻雜型納米沸石親和色譜分離材料，放入25℃恒溫震蕩水浴中，進行吸附試驗，結果表明最佳固液比為4∶1(g/L)時吸附效率幾乎達到了90％。
將飽和吸附α磷酸化酪蛋白的本實施例中制備的金屬摻雜型納米沸石親和色譜分離材料，加入到5mL的1mol/L碳酸氫銨溶液中，放于25℃水浴中，振蕩2小時，之后烘干上述親和色譜分離材料，從其中取0.01g，放入0.5g/L的酪蛋白溶液5mL放入15mL離心管中，放入25℃恒溫水浴中，進行吸附再生試驗。吸附1小時取出，并測定上述親和色譜分離材料的吸附效率為88％。重復以上再生實驗，獲得經二次再生后的吸附效率為85％。與相同條件下新鮮吸附劑的吸附效率90％基本重復。
實施例2(1)稱取固體FeCl3·6H2O 0.196g，溶解于6.53g去離子水中，得到濃度為0.11moL/L呈黃色的FeCl3溶液備用；(2)稱取固體鈦酸四丁酯0.2g，逐滴加入20g 15％四乙基氫氧化胺(兩者摩爾比為0.04∶1)，溶液共20mL，然后通過磁力攪拌器充分攪拌3.5小時，至溶液呈透明狀；(3)在步驟(2)所得溶液中加入2.2g質量百分數(shù)為90％的白炭黑，快速攪拌，得到白色懸濁狀溶液，將上述已配制好的FeCl3溶液逐滴加入到此溶液中，使FeCl3的最終濃度為0.03moL/L，并迅速地充分攪拌；(4)將步驟(3)所得溶液完全轉移至內襯聚四氟乙烯反應容器的不銹鋼反應釜中，在烘箱內160℃溫度下水熱晶化反應72小時，反應后，將反應產物利用去離子水反復清洗，至清洗后的懸浮溶液至中性后，100℃下干燥，得到一系列不同尺寸(300-500nm)的結構中固定摻雜有鐵和鈦活性位點的金屬摻雜型納米沸石親和色譜分離材料。
取0.5g/L的α磷酸化酪蛋白溶液5mL放入15mL離心管中，加入NaCL，使α磷酸化酪蛋白溶液中鹽濃度(NaCL濃度)分別為0.05mol/L、0.10mol/L以及0.15mol/L，加入0.01g本實施例中制備的金屬摻雜型納米沸石親和色譜分離材料，放入25℃恒溫水浴中，進行吸附試驗。1小時后取出，結果表明上述親和色譜分離材料隨著鹽度的增加并沒有改變α磷酸化酪蛋白與親和色譜材料之間的結合強弱，可見α磷酸化酪蛋白與所制備的金屬摻雜型納米沸石親和色譜分離材料之間有較強的親和性。
實施例3(1)稱取固體FeCl3·6H2O 0.196g，溶解于5.12g去離子水中，得到濃度為0.11moL/L呈黃色的FeCl3溶液備用；(2)稱取固體鈦酸四丁酯0.3g，逐滴加入13g 25％四乙基氫氧化胺(兩者摩爾比為0.055∶1)，溶液共13mL，然后通過磁力攪拌器充分攪拌4小時，至溶液呈透明狀；(3)在步驟(2)所得溶液中加入3.7g質量百分數(shù)為80％的白炭黑，快速攪拌，得到白色懸濁狀溶液，將上述已配制好的FeCl3溶液逐滴加入到此溶液中，使FeCl3的最終濃度為0.035moL/L，并迅速地充分攪拌；(4)將步驟(3)所得溶液完全轉移至內襯聚四氟乙烯反應容器的不銹鋼反應釜中，然后在烘箱內165℃溫度下水熱晶化反應48小時，反應后，將反應產物利用去離子水反復清洗，至清洗后的懸浮溶液至中性后，80℃下干燥，得到一系列不同尺寸(300-500nm)的結構中固定摻雜有鐵和鈦活性位點的金屬摻雜型納米沸石親和色譜分離材料。
在室溫操作條件下，取0.05-0.5g上述合成得到的一系列不同尺寸(300-500nm)的結構中固定摻雜有鐵和鈦活性位點的金屬摻雜型納米沸石晶體親和分離材料；配制濃度為5.0μmol/ml的α磷酸化酪蛋白、牛血清白蛋白以及馬肌紅蛋白的蛋白混合溶液，取0.5-1ml上述蛋白混合溶液加入到上述親和色譜分離材料中，放置于恒溫振蕩器中，待蛋白混合溶液同上述親和色譜分離材料間充分作用后，分別以去離子水和緩沖溶液反復淋洗上述親和色譜分離材料，以除去可能的非特異性結合的蛋白質分子。
配制一系列不同梯度濃度(0.1-1.0mol/L)的碳酸氫銨緩沖溶液，充分淋洗相應的結合有目標蛋白質分子的上述親和色譜分離材料，利用聚丙烯電泳分離鑒定根據(jù)淋洗得到的流出溶液組分，實驗結果表明固定摻雜有鐵和鈦活性位點的金屬摻雜型納米沸石親和色譜分離材料，對于蛋白混合溶液中具有磷酸化位點的α磷酸化酪蛋白具有明確的親和選擇性。
實施例4(1)稱取固體FeCl3.6H2O 0.196g，溶解于4.9g去離子水中，得到濃度為0.15moL/L呈黃色的FeCl3溶液備用；(2)稱取固體鈦酸四丁酯0.2934g，逐滴加入12.373g 25％四乙基氫氧化胺(兩者摩爾比為0.06∶1)，溶液共12.7mL，然后通過磁力攪拌器充分攪拌3.5小時，至溶液呈透明狀；(3)在步驟(2)所得溶液中加入2.346g質量百分數(shù)為99％的白炭黑，快速攪拌，得到白色懸濁狀溶液，將上述已配制好的FeCl3溶液逐滴加入到此溶液中，使溶液中FeCl3的最終濃度為0.04moL/L，并迅速地充分攪拌；(4)將步驟(3)所得溶液完全轉移至內襯聚四氟乙烯反應容器的不銹鋼反應釜中，然后在烘箱內150℃溫度下水熱晶化反應56小時，反應后，將反應產物利用去離子水反復清洗，至清洗后的懸浮溶液至中性后，90℃下干燥，得到一系列不同尺寸(300-500nm)的結構中固定摻雜有鐵和鈦活性位點的金屬摻雜型納米沸石親和色譜分離材料。
在室溫操作條件下，利用內徑為5-15mm的石英或玻璃材質的親和色譜分離柱，取0.05-0.5g上述合成得到的一系列不同尺寸(300-500nm)的結構中固定摻雜有鐵和鈦活性位點的金屬摻雜型納米沸石親和色譜分離材料濕法均勻填柱，然后分別以3-5倍柱體積的去離子水和3-5倍柱體積的緩沖溶液反復平衡柱體。
配制濃度為1.0μmol/ml的α磷酸化酪蛋白、牛血清白蛋白以及馬肌紅蛋白的蛋白混合溶液，取0.5-1ml上述蛋白混合溶液滴加上柱，待蛋白混合溶液同柱體內填充材料間充分作用后，分別以去離子水和緩沖溶液反復淋洗柱體，以除去可能的非特異性結合的蛋白質分子。
配制一系列不同梯度濃度(0.1-1.0mol/L)的碳酸氫銨緩沖溶液，充分淋洗相應的結合有目標蛋白質分子的柱體，利用聚丙烯電泳分離鑒定根據(jù)淋洗得到的流出溶液組分，實驗結果表明固定摻雜有鐵和鈦活性位點的金屬摻雜型納米沸石親和色譜分離材料，對于蛋白混合溶液中具有磷酸化位點的α磷酸化酪蛋白具有明確的親和選擇性。
權利要求
1.一種金屬摻雜型納米沸石親和色譜分離材料的制備方法，其特征在于，具體步驟包括(1)稱取固體FeCl3.6H2O，溶解于去離子水中，得到呈黃色的FeCl3溶液備用；(2)在鈦酸四丁酯中逐滴加入四乙基氫氧化胺，攪拌至溶液呈透明狀；(3)在步驟(2)得到的溶液中加入白炭黑，攪拌，得到白色懸濁狀溶液，將步驟(1)配制好的FeCl3溶液逐滴加入到該白色懸濁狀溶液中攪拌；(4)將步驟(3)得到的溶液完全轉移至內襯聚四氟乙烯反應容器的不銹鋼反應釜中，然后在烘箱內水熱晶化，反應后，將反應產物利用去離子水反復清洗，至清洗后的懸浮溶液為中性后，干燥，得到金屬摻雜型納米沸石親和色譜分離材料。
2.根據(jù)權利要求1所述的金屬摻雜型納米沸石親和色譜分離材料的制備方法，其特征是，步驟(1)中所述的FeCl3溶液，其濃度為0.11-0.15mol/L。
3.根據(jù)權利要求1所述的金屬摻雜型納米沸石親和色譜分離材料的制備方法，其特征是，步驟(2)中所述的在鈦酸四丁酯中逐滴加入四乙基氫氧化胺，兩者的摩爾比為0.04∶1-0.06∶1。
4.根據(jù)權利要求1所述的金屬摻雜型納米沸石親和色譜分離材料的制備方法，其特征是，步驟(2)中所述的攪拌，是指攪拌3-4小時。
5.根據(jù)權利要求1所述的金屬摻雜型納米沸石親和色譜分離材料的制備方法，其特征是，步驟(3)中所述的加入白炭黑，是指加入質量百分數(shù)為80％-99％的白碳黑。
6.根據(jù)權利要求1所述的金屬摻雜型納米沸石親和色譜分離材料的制備方法，其特征是，步驟(3)中，所述的將步驟(1)配制好的FeCl3溶液逐滴加入白色懸濁狀溶液中，是溶液中FeCl3的最終濃度為0.03-0.04mol/L。
7.根據(jù)權利要求1所述的金屬摻雜型納米沸石親和色譜分離材料的制備方法，其特征是，步驟(4)中所述的水熱晶化，溫度為140-165℃，時間為48-72小時。
8.根據(jù)權利要求1所述的金屬摻雜型納米沸石親和色譜分離材料的制備方法，其特征是，步驟(4)中所述的干燥，是指在80-100℃下干燥。
9.根據(jù)權利要求1所述的金屬摻雜型納米沸石親和色譜分離材料的制備方法，其特征是，所述的金屬摻雜型納米沸石親和色譜分離材料，其骨架結構中同時固定摻雜有鐵和鈦作為親和活性位點。
10.根據(jù)權利要求1或9所述的金屬摻雜型納米沸石親和色譜分離材料的制備方法，其特征是，所述的金屬摻雜型納米沸石親和色譜分離材料為純相、粒徑300-500nm。
全文摘要
一種金屬摻雜型納米沸石親和色譜分離材料的制備方法，屬于納米技術領域。本發(fā)明方法具體步驟包括(1)稱取固體FeCl
文檔編號B01J20/18GK101028591SQ20071003679
公開日2007年9月5日 申請日期2007年1月25日 優(yōu)先權日2007年1月25日
發(fā)明者徐芳, 王德舉, 楊芃原, 張蔚霞, 楊明 申請人:上海交通大學