專利名稱：無孔兩性離子交換生物分離介質(zhì)及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種無孔兩性離子交換生物分離介質(zhì)及其制備方法和用途。
背景技術(shù)：
無孔高聚物類型的高效液相色譜(HPLC)固定相，自八十年代后期出現(xiàn) 以來已得到迅速發(fā)展，與多孔填料相比，其最主要的特點(diǎn)是，消除了停滯流 動(dòng)相傳質(zhì)帶來的峰加寬，提高了柱效及分離效果，同時(shí)由于被分離的生物大 分子不會(huì)進(jìn)入顆粒內(nèi)部，只在表面進(jìn)行傳質(zhì)交換，故可用于蛋白質(zhì)和多肽等 生物大分子的快速分離分析。兩性離子交換材料是一類在同一樹脂顆粒內(nèi)同時(shí)存在著陰陽兩種交換基 團(tuán)的材料。這類樹脂中的兩種基團(tuán)彼此接近，可以互相結(jié)合，遇到溶液中的 離子又可以同時(shí)與陰、陽兩種離子進(jìn)行離子交換。兩性離子交換材料作為離 子色譜固定相的研究開始于1981年，Knox等選用長鏈co-氨基羧酸對(duì)反相柱 填料進(jìn)行動(dòng)態(tài)涂敷，表現(xiàn)出一定的陰陽離子保留特性。Yu, L.W.等首次通過 化學(xué)鍵合的方法，制備下硅膠基質(zhì)的弱堿-弱酸和強(qiáng)堿-強(qiáng)酸兩種類型兩性離 子交換固定相，應(yīng)用于無機(jī)陰陽離子的同時(shí)分離，1999年，Irgum等以商品 化的Spheron 300樹脂為基質(zhì)和硅膠表面涂敷制備了聚合物強(qiáng)堿-強(qiáng)酸兩性離 子分fe介質(zhì)，用于無機(jī)陰陽離子的同時(shí)和單獨(dú)分離，但未見對(duì)生物大分子分 離的報(bào)道。申請(qǐng)日為2005年11月9日、公告號(hào)為CN U32213A、發(fā)明名稱為無孔單分散聚合物弱陽離子交換樹脂及其制備方法和用途是采用"一步種子溶脹 聚合法"制備了 3.0-7.(Him無孔單分散交聯(lián)聚聚甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯樹脂，并 以無孔樹脂為基質(zhì)制備了弱陽離子交換分離介質(zhì)，用于堿性標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)和基 因工程產(chǎn)品的快速分離純化。但基因工程產(chǎn)品多數(shù)屬于酸性重組蛋白，用單純用陽離子或陰離子交換 分離介質(zhì)很難達(dá)到良好的分離。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，以3.0|_im無孔單分散交聯(lián)聚甲 基丙烯酸環(huán)氧丙酯樹脂為基質(zhì)，采用了新的化學(xué)改性方法制備了一種新型 的可同時(shí)分離酸和堿性蛋白質(zhì)、易再生、耐強(qiáng)酸強(qiáng)堿、機(jī)械強(qiáng)度高、分離 速度快，蛋白質(zhì)量和活性回收率高，可廣泛用基因工程產(chǎn)品及蛋白質(zhì)的快 速分離純化的無孔兩性離子交換分離介質(zhì)及其制備方法和用途。
為了實(shí)現(xiàn)發(fā)明目的，本發(fā)明通過如下方式實(shí)現(xiàn)一種無孔兩性離子交換生物分離介質(zhì)其結(jié)構(gòu)式為 o oh h3 —och26h-ch2 二fji-ch2 —ch2 —ch2 —so3-其中P的結(jié)構(gòu)為"j"Oi-c—Qi-c-c-00"tQiOJp卞ai十 to % n—h hf …d所述的無孔兩性離子交換生物分離介質(zhì)的制備方法，其特征是該制 備方法為在4.0-6.0g無孔單分散P (GMA/EDMA)樹脂中加入 40-60mL1. 0mol/L稀HCl*,超聲分散10_15min后于30-40。C恒溫反應(yīng)2-3 h，抽濾，用蒸餾水反復(fù)洗滌至中性，產(chǎn)物再加入30-50mL 二甲胺的水溶 液，恒溫60-70。C反應(yīng)20-24h，產(chǎn)物用大量水及丙酮反復(fù)洗滌，真空干燥 即得氨化的微球，氨化后的微球于120-150mL的乙睛中，并加入3-5gl， 3-丙磺酸內(nèi)酯，超聲分散后于80-9(TC回流攪拌20-24h，產(chǎn)物用大量丙酮 和乙醇洗滌，真空干燥，即可；所述的無孔兩性離子交換生物分離介質(zhì)的制備方法，其特征是該制 備方法為將4. 0-6. 0g干燥無孔單分散的PGMA/EDMA樹脂分散于40_60mL 二甲胺溶液中，恒溫60-7CTC回流攪拌反應(yīng)20-24h，產(chǎn)物用玻璃砂漏斗抽 濾，再用大量水、丙酮和乙醇反復(fù)洗滌，真空干燥，即得氨化的微球，將 氨化的微球加加入到120-150ml的乙腈中，并加入3.0-5.0克1， 3-丙 磺酸內(nèi)酯，超聲分散后于80-9(TC回流攪拌20-24h，產(chǎn)物用大量丙酮和乙 醇洗滌，真空干燥，即對(duì)；所述的無孔兩性離子交換生物分離介質(zhì)作為蛋白質(zhì)、酶和生物工程產(chǎn) 品的分離純化中的應(yīng)用。本發(fā)明合成無孔兩性離子交換分離介質(zhì)所用的原料及分離所用的標(biāo) 準(zhǔn)蛋白質(zhì)為3.0pm無孔單分散交聯(lián)聚甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯樹脂 (PGMA/EDMA)， 1,3—丙磺酸內(nèi)脂，33%二甲胺水溶液，色譜純乙腈， 卵清蛋白(OVA，雞蛋清)，牛血清白蛋白(BSA)， a-淀粉酶(a-Amy)，肌 紅蛋白(Myo,馬心)，細(xì)胞色素-C(Cyt-C,來源于馬心)，P-乳球蛋白((3-Lact， 來源于牛奶)，胰島素(Ins,來源于牛胰臟)，(x-糜蛋白酶原-A(a-Chy-A，牛 胰臟)，核糖核酸酶(RNase-A,牛紅細(xì)胞)和溶菌酶(Lys，雞蛋清)均購 自美國Sigma公司。本發(fā)明有如下效果.1) 工藝過程獨(dú)特本發(fā)明提供了兩種制備無孔兩性離子交換生物分 離介質(zhì)的方法，第一種改性方法使用鹽酸與環(huán)氧基反應(yīng)，這步改性可以 使環(huán)氧基反應(yīng)比較完全，對(duì)蛋白質(zhì)的不可逆吸附小，但第二步反應(yīng)即氯化 的微球與二甲胺的水溶液反應(yīng)的產(chǎn)率比較低，蛋白質(zhì)的分離性能相對(duì)差 些，只能分離4種標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)；第二種改性方法直接使用二甲胺的水溶 液與環(huán)氧基反應(yīng)，這步改性方法有反應(yīng)不完全的殘余環(huán)氧基對(duì)蛋白質(zhì)會(huì)產(chǎn) 生一定的不可逆吸附，但制備的分離介質(zhì)對(duì)蛋白質(zhì)的分離性能好可以實(shí)現(xiàn) 基線分離5種標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)。2) 本發(fā)明所介紹的制備方法步驟簡單、操作方便、容易控制、容易 放大設(shè)備，制備不需要特殊復(fù)雜的設(shè)備就可以獲得所需要的產(chǎn)品。3) 性能好、用途廣泛本發(fā)明機(jī)械性能好，耐壓〉80Mpa，可用于高效液相色譜和毛細(xì)管電色譜，大大提高了分離和分析速度，蛋白質(zhì)活性回收率高，在室溫下，溶菌酶的活性回收率〉98%。卵清蛋白、(3-乳球蛋白，a-糜蛋白酶原-A和溶菌酶的質(zhì)量回收率>97%。分離重現(xiàn)性好、速度快，可 廣泛應(yīng)用于蛋白、酶和生物工程產(chǎn)品的分離純化。4) 該分離介質(zhì)使用壽命長，在pH=l-12情況下使用1000小時(shí)，經(jīng)清 洗后，分離性能未見改變。5) 耐強(qiáng)酸強(qiáng)堿.該分離介質(zhì)分別用0.1mol/L鹽酸和0.1mol/L氫氧化 鈉浸泡一天一夜后，用大量蒸餾水洗滌中性后，用于分離標(biāo)準(zhǔn)蛋白，其分 離性能未見改變。 .6) 該分離介質(zhì)很容易再生，只要用1 0倍體積的lmol/L氯化鈉洗滌 劑可再生使用，不象一些商品柱要在每次進(jìn)樣后用氫氧化鈉再生。7) 生物工程產(chǎn)品的脲提取液可以直接上樣， 一步分離達(dá)到了較高純度。


圖1為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)和酶在本發(fā)明實(shí)施例一、二和三制備的無孔兩性離 子交換生物分離介質(zhì)的分離圖；圖2為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)和酶在本發(fā)明實(shí)施例四、五和六的制備的無孔兩性 離子交換生物分離介質(zhì)的快速分離圖；圖3為基因工程產(chǎn)品重組人粒細(xì)胞-巨嗤細(xì)胞集落刺激因子的8mol/L 脲提取液分離圖。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例一 一種無孔兩性離子交換生物分離介質(zhì)其結(jié)構(gòu)式為<formula>formula see original document page 5</formula> 其中P的結(jié)構(gòu)為<formula>formula see original document page 6</formula>該無孔兩性離子交換生物分離介質(zhì)的制備方法在4. 0 g無孔單分散P(GMA/EDMA)樹脂中加入40mLl. 0mol/L稀HC1 ，超聲分散lOmin后于 30-4(TC恒溫反應(yīng)2h，抽濾，用蒸餾水反復(fù)洗滌至中性，產(chǎn)物再加入30mL 二甲胺的水溶液，恒溫6(TC反應(yīng)20h,產(chǎn)物用大量水及丙酮反復(fù)洗滌，真 空干燥即得氨化的微球，氨化后的微球于120mL的乙睛中，并加入3gl， 3-丙磺酸內(nèi)酯，超聲分散后于80。C回流攪拌20h，產(chǎn)物用大量丙酮和乙醇 洗滌，真空干燥，即可，合成路線如下<formula>formula see original document page 6</formula>如圖l所示分離條件1、色譜柱5.0X4.6 cm不銹鋼柱，2、流動(dòng)相A(平衡 液)20mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH 5,0);流動(dòng)相B(洗脫液)20mmol/L磷酸鹽緩 沖液+ 1.0mol/LNaCl(pH5.0); 3、流動(dòng)相流速l.OmL/min; 4、線性梯度lOmin, lOCBA-100o/。B, 100呢B延遲5min, 5、標(biāo)準(zhǔn)蛋白1:0VA,2:p-Lact， 3:a-Chy-A， 4:Cyt-C。實(shí)施例二 一種無孔兩性離子交換生物分離介質(zhì)其結(jié)構(gòu)式為>—s-och2&h-ch2」+-ch2 6h3<formula>formula see original document page 6</formula>;其中P的結(jié)構(gòu)為:<formula>formula see original document page 6</formula>該無孔兩性離子交換生物分離介質(zhì)的制備方法在5. 0g無孔單分散 P(GMA/EDMA)樹脂中加入50mLl. 0mol/L稀HC1 ，超聲分散12min后于 30-4(TC恒溫反應(yīng)2.5 h，抽濾，用蒸餾水反復(fù)洗滌至中性，產(chǎn)物再加入 40mL 二甲胺的水溶液，恒溫65"C反應(yīng)22h，產(chǎn)物用大量水及丙酮反復(fù)洗滌， 真空干燥即得氨化的微球，氨化后的微球于135mL的乙睛中，并加入4gl， 3-丙磺酸內(nèi)酯，超聲分散后于85。C回流攪拌22h，產(chǎn)物用大量丙酮和乙醇 洗滌，真空干燥，即可，合成路線如下。 。 h h/H3參s糊2"2 。 1喊HCI.必j-oc;，、.0oh|—c-och2ch-ch2 —N;,0ch3 一、、0 ■ch3 ~^0 oh ch3》—s-oc—-ch2 二—-ch2 —ch2 —ch2 —so; 6h3如圖l所示分離條件1、色譜柱5.0X4.6 cm不銹鋼柱，2、流動(dòng)相A(平 衡液)20mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH 5.0);流動(dòng)相B(洗脫液)20mmol/L磷酸鹽 緩沖液+ l. 0mol/LNaCl (pH 5. 0); 3、流動(dòng)相流速1. 0 mL/min; 4、線性梯度lOmin， 100%A-100%B， 100。/。B延遲5min. 5、標(biāo)準(zhǔn)蛋白1:0VA，2:卩-Lact，3:a-Chy-A， 4:Cyt-C。實(shí)施例三 一種無孔兩性離子交換生物分離介質(zhì)其結(jié)構(gòu)式為o oh h3och26h-ch2 2——ch2 —ch2 —ch2 —so;其中P的結(jié)構(gòu)為"j"CH-c—CH-c-c-oaiaioc卞ai十 to H& 11—H P h該無孔兩性離子交換生物分離介質(zhì)的制備方法在6.0g無孔單分散P (GMA/EDMA)樹脂中加入60mLl. 0mol/L稀HCI ，超聲分散15min后于40°C 恒溫反應(yīng)3h，抽濾，用蒸餾水反復(fù)洗滌至中性，產(chǎn)物再加入50mL二甲胺 的水溶液，恒溫7(TC反應(yīng)24h，產(chǎn)物用大量水及丙酮反復(fù)洗滌，真空干燥 即得氨化的微球，氨化后的微球于150mL的乙睛中，并加入5gl， 3-丙磺 酸內(nèi)酯，超聲分散后于9(TC回流攪拌24h,產(chǎn)物用大量丙酮和乙醇洗滌， 真空干燥，即可，合成路線如下:<formula>formula see original document page 8</formula>d;H3如圖l所示分離條件1、色譜柱5.0X4.6 cm不銹鋼柱，2、流動(dòng)相A(平 衡液)20mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH 5. 0);流動(dòng)相B(洗脫液)20mmol/L磷酸鹽 緩沖液+ 1.0mol/LNaCl(pH5.0); 3、流動(dòng)相流速1.0mL/min; 4、線性梯度10min， 100%A-100%B， 100呢B延遲5min. 5、標(biāo)準(zhǔn)蛋白1:0VA，2:p-Lact， 3:a-Chy-A， 4:Cyt-C。實(shí)施例四 一種無孔兩性離子交換生物分離介質(zhì)其結(jié)構(gòu)式為 —6-OCH26h-CH2 2|jl_CH2 —CH2 —CH2 —S03_ 其中P的結(jié)構(gòu)為.<formula>formula see original document page 8</formula>該無孔兩性離子交換生物分離介質(zhì)的制備方法為將4.0-6.0g干燥 無孔單分散的PGMA/EDM樹脂分散于40-60mL 二甲胺溶液中，恒溫60_70°C 回流攪拌反應(yīng)20-24h，產(chǎn)物用玻璃砂漏斗抽濾，再用大量水、丙酮和乙醇 反復(fù)洗滌，真空干燥，即得氨化的微球，將氨化的微球加加入到120-150ml 的乙腈中，并加入3.0-5.0克l， 3-丙磺酸內(nèi)酯，超聲分散后于80-9(TC 回流攪拌20-24h,產(chǎn)物用大量丙酮和乙醇洗滌，真空干燥，即可，合成路 線如下 <formula>formula see original document page 9</formula>-6-och2(!;h-ch2」—ch2 —ch2 —ch2 —so孓 6h3如圖2所示為蛋白質(zhì)和酶在3. 0 |am無孔單分散弱陽離子交換填料上 的分離圖，其中1、色譜柱5.0X4.6 cm不銹鋼柱，2、流動(dòng)相A(平衡 液)20mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH 5. 0);流動(dòng)相B(洗脫液)20mmol/L磷 酸鹽緩沖液+ 1.0mol/LNaCl(pH 5.0); 3、流動(dòng)相流速3.0 mL/min; 4、 線性梯度3min, 100%A-100%B， 100%B延遲2min. 5、標(biāo)準(zhǔn)蛋白l:OVA， 2:p—Lact， 3:a—Chy—A，4:Cyt—C， 5: Lys。實(shí)施例五 一種無孔兩性離子交換生物分離介質(zhì)其結(jié)構(gòu)式為<formula>formula see original document page 9</formula>其中P的結(jié)構(gòu)為:<formula>formula see original document page 9</formula>該無孔兩性離子交換生物分離介質(zhì)的制備方法為將5.0g干燥無孔單分散的PGMA/EDM樹脂分散于50mL 二甲胺溶液中，恒溫65。C回流攪拌反 應(yīng)22h，產(chǎn)物用玻璃砂漏斗抽濾，再用大量水、丙酮和乙醇反復(fù)洗滌，真 空干燥，即得氨化的微球，將氨化的微球加加入到130ml的乙腈中，并加 入4.0克1， 3-丙磺酸內(nèi)酯，超聲分散后于85"C回流攪拌22h，產(chǎn)物用 大量丙酮和乙醇洗滌，真空干燥，即可,合成路線如下<formula>formula see original document page 9</formula>如圖2所示為蛋白質(zhì)和酶在3.0 pm無孔單分散弱陽離子交換填料上
的分離圖，其中1、色譜柱5.0X4.6 cm不銹鋼柱，2、流動(dòng)相A(平衡液)20mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH 5.0):流動(dòng)相B(洗脫液)20咖ol/L磷酸鹽緩沖液+ 1.0mol/LNaCl(pH 5.0); 3、流動(dòng)相流速3.0mL/min; 4、線性i度3min， 100%A-100%B， 100%B延遲2min. 5、標(biāo)準(zhǔn)蛋白1:0VA，2:p-Uct， 3:a-Chy-A，4:Cyt-C， 5: Lys。實(shí)施例六 一種無孔兩性離子交換生物分離介質(zhì)其結(jié)構(gòu)式為9 9h3 ⑩—6_OCH26h_CH2」fJj_CH2 —CH2 —CH2 —S03—6h3其中P的結(jié)構(gòu)為 <formula>formula see original document page 10</formula>該無孔兩性離子交換生物分離介質(zhì)的制備方法為將6.0g干燥無孔單分散的PGMA/EDM樹脂分散于60mL 二甲胺溶液中，恒溫7(TC回流攪拌反 應(yīng)24h，產(chǎn)物用玻璃砂漏斗抽濾，再用大量水、丙酮和乙醇反復(fù)洗滌，真 空干燥，即得氨化的微球，將氨化的微球加加入到150ml的乙腈中，并加 入5.0克1， 3-丙磺酸內(nèi)酯，超聲分散后于9(TC回流攪拌24h，產(chǎn)物用 大量丙酮和乙醇洗滌，真空干燥，即可，合成路線如下<formula>formula see original document page 10</formula>如圖2所示為蛋白質(zhì)和酶在3. 0 無孔單分散弱陽離子交換填料上 的分離圖，其中1、色譜柱5.0X4.6 cm不銹鋼柱，2、流動(dòng)相A(平衡 液)20mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH 5.0);流動(dòng)相B(洗脫液)20咖ol/L磷 酸鹽緩沖液+ 1.0mol/LNaCl(pH 5.0); 3、流動(dòng)相流速3.0 mL/min; 4、 線性梯度3min， 100%A-100°/。B， 100°/必延遲2min. 5、標(biāo)準(zhǔn)蛋白l:OVA， 2:卩-Lact， 3:a-Chy-A， 4:Cyt-C， 5: Lys。如圖3所示為本發(fā)明在基因工程產(chǎn)品重組人干擾素-Y的8mol/L脲提取液分 離圖，1、、色譜柱:5.0X4.6cm不銹鋼柱，2、流動(dòng)相A(平衡液):20咖ol/L PBS (pH 5. 0);流動(dòng)相B(洗脫液)A + 1. 0mol/l NaCl (pH 5. 0) ， 3、流動(dòng)相流速2ml/min，
線性梯度6min, 10%A- 60%B， 60%B延長2min， 5、 *為純化后重組人粒細(xì)胞-巨嗤 細(xì)胞集落刺激因子，純化后重組人粒細(xì)胞-巨嗤細(xì)胞集落刺激因子的純度為93%。
權(quán)利要求
1.一種無孔兩性離子交換生物分離介質(zhì)其結(jié)構(gòu)式為其中P的結(jié)構(gòu)為
2.如權(quán)利要求1所述的無孔兩性離子交換生物分離介質(zhì)的制備方法，其特征是該制備方法為在4.0-6.0g無孔單分散交聯(lián)聚甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯樹脂(PGMA/EDMA)樹脂中加入40-60mLL 0mol/L稀HC1 ，超聲分 散10-15min后于30-4(TC恒溫反應(yīng)2-3 h，抽濾，用蒸餾水反復(fù)洗滌至中 性，產(chǎn)物再加入30-50mL二甲胺的水溶液，恒溫60-70'C反應(yīng)20-24h，產(chǎn) 物用大量水及丙酮反復(fù)洗滌，真空干燥即得氨化的微球，氨化后的微球于 120-150mL的乙睛中，并加入3-5gl， 3-丙磺酸內(nèi)酯，超聲分散后于80-90°C 回流攪拌20-24h，產(chǎn)物用大量丙酮和乙醇洗滌，真空干燥，即可。
3.如權(quán)利要求1所述的無孔兩性離子交換生物分離介質(zhì)的制備方法， 其特征是該制備方法為將4.0-6.0g干燥無孔單分散的PGMA/EDM樹脂 分散于40-60mL二甲胺溶液中，恒溫60-70。C回流攪拌反應(yīng)20-24h，產(chǎn)物 用玻璃砂漏斗抽濾，再用大量水、丙酮和乙醇反復(fù)洗滌，真空干燥，即得 氨化的微球，將氨化的微球加加入到120-150ml的乙腈中，并加入3.0-5.0 克l， 3-丙磺酸內(nèi)酯，超聲分散后于80-90。C回流攪拌20-24h，產(chǎn)物用大 量丙酮和乙醇洗滌，真空干燥，即可。
4.如權(quán)利要求1所述的無孔兩性離子交換生物分離介質(zhì)作為蛋白質(zhì)、 酶和生物工程產(chǎn)品的分離純化中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種無孔兩性離子交換生物分離介質(zhì)其結(jié)構(gòu)式為(見圖)該無孔兩性離子交換生物分離介質(zhì)的制備方法為在4.0-6.0g無孔單分散P(GMA/EDMA)樹脂中加入40-60mL1.0mol/L稀HCl，超聲分散10-15min后于30-40℃恒溫反應(yīng)2-3h，抽濾，用蒸餾水反復(fù)洗滌至中性，產(chǎn)物再加入30-50mL二甲胺的水溶液，恒溫60-70℃反應(yīng)20-24h，產(chǎn)物用大量水及丙酮反復(fù)洗滌，真空干燥即得氨化的微球，氨化后的微球于120-150mL的乙睛中，并加入3-5g1，3-丙磺酸內(nèi)酯，超聲分散后于80-90℃回流攪拌20-24h，產(chǎn)物用大量丙酮和乙醇洗滌，真空干燥，即可；本發(fā)明以3.0μm無孔單分散交聯(lián)聚甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯樹脂為基質(zhì)，采用了新的化學(xué)改性方法制備了一種新型的可同時(shí)分離酸和堿性蛋白質(zhì)、易再生、耐強(qiáng)酸強(qiáng)堿、機(jī)械強(qiáng)度高、分離速度快，蛋白質(zhì)量和活性回收率高，可廣泛用基因工程產(chǎn)品及蛋白質(zhì)的快速分離純化。
文檔編號(hào)B01J43/00GK101157059SQ20071014144
公開日2008年4月9日 申請(qǐng)日期2007年8月15日 優(yōu)先權(quán)日2007年8月15日
發(fā)明者龔波林 申請(qǐng)人:寧夏大學(xué)