專利名稱：：核酸大小檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：0001本發(fā)明大體上涉及醫(yī)學(xué)診斷領(lǐng)域。特別是，本發(fā)明涉及檢測特征為串聯(lián)重復(fù)序列增殖的基因突變的方法。
背景技術(shù)：
：0002在DNA中串聯(lián)重復(fù)代表兩個或兩個以上連續(xù)的近似拷貝的核苷酸模式。串聯(lián)重復(fù)己經(jīng)顯示出了與多種人類疾病的起因有關(guān)。三核苷酸重復(fù)序列的急劇增殖已發(fā)現(xiàn)與這些疾病有關(guān)，如脆性X智力遲鈍(參見Verkerk等，(1991)Cell,65,905-914)、亨廷頓氏癥(參見Huntington'sDiseaseCollaborativeResearchGroup.(1993)Cell,72，971-983)、強直性肌營養(yǎng)不良癥(參見Fu等，(1992)Science,255,1256-1258)、脊髓和延髓肌萎縮癥(參見LaSpada等，(1991)Nature,352,77-79)和弗里德賴希型共濟失調(diào)(參見Campuzano等，(1996)Science,271,1423-1427)。0003脆性X綜合癥是遺傳性智力遲鈍的最常見的原因之一，在1250個男性(雄性)中大約出現(xiàn)1個，在2500個女性(雌性)中大約出現(xiàn)一個。具有脆性X綜合癥的男性通常表現(xiàn)出一定程度的智力損害，在從學(xué)習(xí)障礙到智力遲鈍到孤獨癥的范圍內(nèi)變化。還可表現(xiàn)出典型的身體特征(例如增大的耳朵、有突出下巴的拉長的臉)、結(jié)締組織問題(如二尖瓣脫垂和雙關(guān)節(jié)手指)和典型的行為(如注意力缺陷障礙、言語錯亂和對各種觸覺、聽覺或視覺刺激的不尋常反應(yīng))。受侵襲女性顯示出與那些受侵襲男性類似的智力損害、身體特征和行為特征，但是較為輕微。0004造成脆性X綜合癥的突變涉及位于X染色體上FMR1基因5'非翻譯區(qū)的三核苷酸(CGG)串聯(lián)重復(fù)序列的增殖。在FMR1基因中，CGG重復(fù)數(shù)目決定一個人是否正常或是否具有兩類突變前突變和全突變中的一種。在正常、非攜帶個體中重復(fù)數(shù)目范圍少于55個重復(fù)，而前突變由55到200個重復(fù)組成，全突變由200以上個重復(fù)組成(Chen等。Hum.Mol.Genetics12(23):3067-74,2003)。0005在一個FMR1基因中有前突變的男性和有前突變的女性都是攜帶者，然而不受侵襲。男性攜帶者被稱為"正常傳遞的"男性，并以大小相對不變的方式將突變傳遞到每一個女兒。盡管這樣的女兒不受侵襲，但是她們處于有受侵襲的后代的危險，因為在經(jīng)過女性減數(shù)分裂途徑之后，前突變可被擴增。而且，前突變越大，在任何一個后代中擴大到全突變的風(fēng)險越高。0006有全突變的大多數(shù)男性顯示出智力遲鈍和刻板的身體以及行為特征。對在一個FMR1基因中有全突變的女性，約三分之一顯示出正常智力，約三分之10一顯示出臨界智力，大約有三分之一顯示出智力遲鈍。0007目前，用于篩選具有串聯(lián)重復(fù)區(qū)域擴增如脆性X的攜帶者或受侵襲個體的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)是串聯(lián)重復(fù)區(qū)域的PCR擴增和Southern印跡分析的結(jié)合。發(fā)明概述0008本發(fā)明的一個方面，提供在核酸樣品中確定一個感興趣的特定核酸區(qū)段(segment)的大小的方法。這個方法通過如下完成分離核酸片段(fragment)，其中從包含核酸的樣品中制備片段，其中片段包括一些含有區(qū)段和標(biāo)記序列的片段，其中分離是依照大小分離成部分(級分，fraction)中，在包含所述區(qū)段的片段將依照區(qū)段大小定位于所述部分的條件下進(jìn)行，以及通過檢測所述標(biāo)記序列來鑒定包含所述區(qū)段的那些部分(一個或多個)，其中由鑒定到所述區(qū)段的組分確定所述區(qū)段大小。0009這個方法適合于基本上任何感興趣的核酸區(qū)段，然而該方法特別可改良用于確定這樣的核酸區(qū)段的大小，該核酸區(qū)段例如難以通過利用擴增(例如PCR)整個核酸區(qū)段的方法測定大小。難以通過利用擴增整個核酸區(qū)段的方法測定大小的核酸區(qū)段例子包括具有高含量鳥嘌呤和胞嘧啶堿基的核酸區(qū)段、大的核酸區(qū)段和/或具有大量串聯(lián)重復(fù)的核酸區(qū)段。在優(yōu)選的實施方式中，感興趣的特定核酸區(qū)段是串聯(lián)重復(fù)的核酸序列。難以通過PCR擴增的核酸的長度一般大于50,000個堿基，更為典型地大于100,000個堿基，更為典型地大于150,000個堿基，或者超過200,000個堿基，乃至超過250,000個堿基。0010在另外一方面，本發(fā)明方法用于確定來自于人樣品中的特定核酸區(qū)段的大小，由此確定該個體的該特定核酸區(qū)段的大小是否具有異常，其中異常的原因是在特定核酸區(qū)段中的復(fù)制、添加或者刪除。0011在還有另外一方面，本發(fā)明提供了檢測核酸樣品中基因串聯(lián)重復(fù)區(qū)段中的突變的方法，其中該突變的特征是與在野生型等位基因中的重復(fù)數(shù)量相比，重復(fù)數(shù)量增加。該方法通過如下完成分離核酸片段，其中該片段從包含核酸的樣品中制備，其中該片段包括一些包含串聯(lián)重復(fù)區(qū)段和標(biāo)記序列的片段，其中該分離是依照大小分離成為部分，這在包含串聯(lián)重復(fù)區(qū)段的片段將依照所述串聯(lián)重復(fù)區(qū)段的重復(fù)數(shù)量定位于所述部分的條件下進(jìn)行，和通過檢測所述標(biāo)記序列來鑒定包含所述區(qū)段的那些部分。通過在其中片段是被識別的組分來確定在串聯(lián)重復(fù)區(qū)段中的重復(fù)數(shù)量。將該重復(fù)數(shù)量與在相應(yīng)的野生型等位基因中的數(shù)量相比較，其中重復(fù)數(shù)量比在野生型等位基因中的數(shù)量大則表示突變。0012在某些實施方式中，本發(fā)明上述方面還包括確定突變是否是前突變或者全突變。通過比較來自于核酸樣品的串聯(lián)重復(fù)區(qū)段的重復(fù)數(shù)量與在相應(yīng)的全突變等位基因中的數(shù)量來完成這種確定，其中比野生型等位基因大但是比全突變小的重復(fù)數(shù)量表示是前突變等位基因，重復(fù)數(shù)量大于或者等于全突變表示是全突11變等位基因。在其它實施方式中，在核酸樣品的串聯(lián)重復(fù)區(qū)域中的重復(fù)數(shù)量能與在野生型等位基因、前突變等位基因和全突變等位基因的每一個中所發(fā)現(xiàn)的重復(fù)數(shù)量進(jìn)行比較。0013在本發(fā)明以上的特定實施方式中，提供了在個體的核酸中識別具有正常串聯(lián)重復(fù)數(shù)量、前突變或者全突變的FMR1等位基因的方法，其中該方法包括將來自個體樣品中的核酸斷裂成為片段，其中在片段中FMR1基因的重復(fù)串聯(lián)區(qū)段與標(biāo)記序列連接，分離核酸片段，其中從包含核酸的個體樣品制備片段，其中片段包括一些包含F(xiàn)MR1基因的重復(fù)串聯(lián)區(qū)段和標(biāo)記序列的片段，依照大小分離成部分，這在以下條件下進(jìn)行其中包含具有正常重復(fù)數(shù)量的串聯(lián)重復(fù)區(qū)段的片段將定位在第一部分中，包含具有前突變的串聯(lián)重復(fù)區(qū)段的片段將定位在第二部分中；和包含具有全突變的串聯(lián)重復(fù)區(qū)域的片段將定位在第三部分中，通過檢測標(biāo)記序列來鑒定包含所述區(qū)段的那些部分，其中通過在其中片段被鑒定的部分確定串聯(lián)重復(fù)區(qū)段中的重復(fù)數(shù)量，其中，在第一部分中的陽性結(jié)果表示個體具有擁有正常數(shù)量的串聯(lián)重復(fù)的FMR1等位基因；在第二部分中的陽性結(jié)果表示個體具有前突變FMR1等位基因；和在第三部分中的陽性結(jié)果表示個體具有全突變FMR1等位基因。0014在另外一方面，提供了用于檢測特征在于基因的串聯(lián)重復(fù)區(qū)段擴增或減少的遺傳突變的攜帶者和診斷受由這種擴增所引起疾病折磨的個體的方法。如以上所描述地，該方法涉及檢測特定基因的野生型等位基因、前突變等位基因和/或全突變等位基因。根據(jù)個體中存在的等位基因可隨后確定基因型，從而能夠指明正常、攜帶者或受侵襲的狀況。0015在這里所使用的"攜帶者"是攜帶了基因的突變或改變的等位基因，但是沒有受到與突變相關(guān)的障礙或者疾病侵襲的個體。攜帶者能將突變傳遞到子女或者后代子孫，他們可能受到疾病或者障礙的侵襲。對脆性X綜合癥，男性和女性都可能是攜帶者。對于男性，在這里所使用的術(shù)語"攜帶者"與"前突變攜帶者"可交替地使用并且指的是有前突變等位基因的男性。對于女性，在這里所使用的術(shù)語攜帶者包括具有前突變等位基因或者全突變等位基因的女性。這樣的女性攜帶者在這里也可指的是"前突變攜帶者"(也就是，具有前突變FMR1等位基因)或者"全突變攜帶者"(也就是，具有全突變FMR1等位基因)。0016這里所使用"受侵襲的"指的是特定基因中具有一個或者多個突變的等位基因并顯出了與突變相關(guān)的疾病或者障礙(也就是，表現(xiàn)型)的個體。對于脆性X綜合癥，具有全突變FMR1等位基因的男性是受侵襲的，而具有單個全突變等位基因的女性可能是受侵襲的或者可能是全突變攜帶者。0017在本發(fā)明以上方面的一些實施方式中，受脆性X綜合癥(全突變)侵襲的男性個體能夠與攜帶者(前突變)個體或者與那些正常個體區(qū)分開。來自個體的核酸樣品被斷裂產(chǎn)生核酸片段，其中在片段中FMR1基因的串聯(lián)重復(fù)區(qū)段與標(biāo)記序列連接。該片段依照大小分離成部分，這在以下條件下進(jìn)行在其中包含串聯(lián)重復(fù)區(qū)段的片段將按照串聯(lián)重復(fù)區(qū)段中的重復(fù)數(shù)量定位于所述部分中，和通過檢測標(biāo)記序列識別那些包含區(qū)段的部分。在一些實施方式中，選擇部分以便第一部分捕獲具有在正常等位基因的重復(fù)范圍之內(nèi)的重復(fù)數(shù)目的片段；第二部分捕獲具有在前突變等位基因的重復(fù)范圍之內(nèi)的重復(fù)數(shù)目的片段；第三部分捕獲具有在全突變等位基因的重復(fù)范圍之內(nèi)的重復(fù)數(shù)目的片段。依照在脆性X領(lǐng)域最新研究，對于FMR1基因的正常等位基因的重復(fù)范圍是小于55個重復(fù)；對于前突變等位基因的重復(fù)范圍是55-220;對于全突變等位基因的重復(fù)范圍是大于220個重復(fù)。這些變化范圍可以是±10%。這些變化范圍可能會隨著時間而改變，因為新的研究在被進(jìn)行并得到了更多關(guān)于重復(fù)數(shù)量和疾病狀況之間相關(guān)性的信息。由于男性一般具有單X-染色體(FMR1基因位于其中)，對于標(biāo)記序列只有一部分應(yīng)該是陽性。因此，根據(jù)按照以下的基因型，男性被給予表現(xiàn)型如果對于標(biāo)記序列第一部分是陽性，那么個體是正常的；如果對于標(biāo)記序列第二部分是陽性，那么個體是攜帶者；如果對于標(biāo)記序列僅第三部分是陽性，那么個體受脆性X綜合癥侵襲。0018在另外一方面，提供了篩査男性和女性個體在FMR1基因的串聯(lián)重復(fù)區(qū)域中的突變攜帶者狀況的方法，該方法包括分析來自于個體的核酸，以確定性別；和分析核酸，以確定FMR1基因的串聯(lián)重復(fù)區(qū)域的長度，其中所述確定包括擴增串聯(lián)重復(fù)區(qū)域，檢測擴增產(chǎn)物，和確定在擴增產(chǎn)物中串聯(lián)重復(fù)的數(shù)量，其中，在男性個體中具有小于55個串聯(lián)重復(fù)的擴增產(chǎn)物的存在表示個體不是攜帶者，具有55個或者更多個串聯(lián)重復(fù)的擴增產(chǎn)物的存在表示個體是攜帶者，或者不存在擴增產(chǎn)物時，攜帶者狀況是不確定的；和在女性個體中具有多于55個串聯(lián)重復(fù)的擴增產(chǎn)物的存在表示個體是攜帶者；或具有小于55個串聯(lián)重復(fù)的單個擴增產(chǎn)物的存在表示攜帶者狀況是不確定的。0019在某些實施方式中，上述方法還包括，分析未確定的個體來確定攜帶者狀況，其中該分析包括，分離核酸片段，其中該片段由包含核酸的個體樣品制備，其中該片段包括了13一些包含F(xiàn)MR1基因的串聯(lián)重復(fù)區(qū)段和標(biāo)記序列的片段，按照大小分離成部分，這在以下條件下進(jìn)行含有具有正常重復(fù)數(shù)量的串聯(lián)重復(fù)區(qū)段的片段將定位在第一部分中；含有具有前突變的串聯(lián)重復(fù)區(qū)段的片段將定位在第二部分中；以及含有具有全突變的串聯(lián)重復(fù)區(qū)域的片段將定位在第三部分中，通過檢測標(biāo)記序列來識別包含區(qū)段的那些部分，其中通過在其中片段被識別的部分來確定在串聯(lián)重復(fù)區(qū)段中的重復(fù)數(shù)量，其中，在男性個體中在第一部分中的陽性結(jié)果表示個體不是攜帶者，在第二部分中的陽性結(jié)果表示個體是前突變攜帶者，在第三部分中的陽性結(jié)果表示個體是受侵襲的；和在女性個體中僅在第一部分中的陽性結(jié)果表示個體對于正常等位基因是純合的(同型接合的)；在第二部分中的陽性結(jié)果表示個體是前突變攜帶者，和在第三部分中的陽性結(jié)果表示個體是全突變攜帶者。0020在上述方法的優(yōu)選實施方式中，分析核酸確定性別包括擴增核酸區(qū)域，優(yōu)選地用PCR擴增。例如，對Y染色體特異的序列，如SRY基因座可以是擴增的目標(biāo)。在這種情況下，擴增僅在Y染色體存在時發(fā)生。(參見SinclairA.H.,等，Nature346:240244(1990))。在其它例子中，某些在X染色體和Y染色體上都出現(xiàn)的基因可以被檢測以確定性別，如果相應(yīng)基因的長度在每個染色體上是不同的。因此，擴增產(chǎn)生具有對X或Y染色體特異的長度的不同大小的擴增子。在這種情況下，來自于男性的核酸的擴增將產(chǎn)生兩個擴增子，而來自于女性樣品將僅有一個擴增子。這樣基因的例子包括DXZ1、DXZ2和牙釉蛋白基因。在更優(yōu)選的實施方式中，確定性別的分析包括-從X染色體上的牙釉蛋白基因和Y染色體上的牙釉蛋白基因擴增產(chǎn)生不同大小擴增產(chǎn)物的牙釉蛋白基因的區(qū)域，確定擴增產(chǎn)物或多個產(chǎn)物的大小，其中單一大小的一個產(chǎn)物的存在表示性別是女性，而兩種不同大小產(chǎn)物的存在表示性別是男性。0021在還有進(jìn)一步的實施方式中，確定性別的分析用串聯(lián)重復(fù)區(qū)域的多重擴增來實現(xiàn)，優(yōu)選地是多重PCR;優(yōu)選地在多重反應(yīng)中包括一個或多個內(nèi)對照。在優(yōu)選實施方式中，雄激素不敏感基因的區(qū)域作為內(nèi)對照擴增。0022在本發(fā)明以上方面的優(yōu)選實施方式中，分析包含基因組DNA的樣品用于FMR1基因的串聯(lián)重復(fù)區(qū)域的擴張。因此，基因組樣品進(jìn)行核酸片段化(斷裂)并且產(chǎn)生的核酸片段依照大小分離成多個部分。FMR1基因的串聯(lián)重復(fù)區(qū)域的上游或下游的標(biāo)記序列通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴增，標(biāo)記序列與片段化核酸中的串聯(lián)重復(fù)區(qū)域連接。在一些實施方式中，使用TaqMan系統(tǒng)進(jìn)行標(biāo)記序列的擴增和擴增子的檢測。在其它實施方式中，使用標(biāo)記的引物擴增標(biāo)記序列和使用毛細(xì)管電泳檢測產(chǎn)生的標(biāo)記的擴增子。0023本領(lǐng)域技術(shù)人員會容易認(rèn)識到通過大小將片段分離成部分是能夠改進(jìn)的，使得所述部分對應(yīng)于串聯(lián)重復(fù)的正常數(shù)量或者串聯(lián)重復(fù)的異常數(shù)量。在一些實施方式中，成片段的核酸可以依照大小分成兩個部分，較大尺寸片段的上部分和較小尺寸片段的下部分。在這種方法中，設(shè)計部分，使得來自于包含正常數(shù)量的串聯(lián)重復(fù)的核酸的片段將在下部分中找到，而來自于包含異常增加數(shù)量的串聯(lián)重復(fù)的核酸的片段將在上部分中找到。在其它實施方式中，片段化的DNA可分離成任意數(shù)量的部分。在一些實施方式中，片段化的DNA可分離成選自2-16的數(shù)量的部分，優(yōu)選地3個部分，或者4個部分，或者5個部分，或者6個部分，或者8個部分，或者甚至16個部分。0024在以上方法的優(yōu)選實施方式中，片段化的DNA分離成上部分和下部分，其中下部分對應(yīng)于包含小于55個重復(fù)的串聯(lián)重復(fù)區(qū)域(正常的重復(fù)數(shù)量)和上部分包含55個或更多個重復(fù)(前突變和全突變)。因此，正常等位基因與前突變或者全突變區(qū)別開來。0025在以上方法的另一個優(yōu)選實施方式中，片段化DNA分離成三部分，其中第一部分對應(yīng)于正常等位基因的串聯(lián)重復(fù)區(qū)域(也就是小于55個重復(fù))，第二部分對應(yīng)于前突變等位基因的串聯(lián)重復(fù)區(qū)域(也就是55-200個重復(fù))，第三部分對應(yīng)于全突變等位基因的串聯(lián)重復(fù)區(qū)域(也就是大于200個重復(fù))。0026在以上方法的另外一個優(yōu)選的實施方式中，片段化的DNA分離成四個部分，其中第一部分對應(yīng)于正常等位基因的串聯(lián)重復(fù)區(qū)域，第二部分對應(yīng)于小的前突變等位基因的串聯(lián)重復(fù)區(qū)域，第三部分對應(yīng)于大的前突變等位基因的串聯(lián)重復(fù)區(qū)域，第四部分對應(yīng)于全突變的等位基因的串聯(lián)重復(fù)區(qū)域。在特定實施方式中，第一部分對應(yīng)于0-60個重復(fù)；優(yōu)選地第二部分對應(yīng)于60-200個重復(fù)；優(yōu)選地第三部分對應(yīng)于200-2000個重復(fù)；優(yōu)選地第四部分對應(yīng)于2000以上的重復(fù)。在另外一個實施方式中，DNA用Blpl和Mlyl片段化并分級，這樣第一部分對應(yīng)于6-62個重復(fù)；優(yōu)選地第二部分對應(yīng)于63-140個重復(fù)；優(yōu)選地第三部分對應(yīng)于141-220個重復(fù)；和優(yōu)選地第四部分對應(yīng)于221-2000以上個重復(fù)。在另外一個實施方式中，DNA用Alul片段化并分級，這樣第一部分對應(yīng)于6-68個重復(fù)；優(yōu)選地第二部分對應(yīng)于69-102個重復(fù)；優(yōu)選地第三部分對應(yīng)于102-202個重復(fù)；和優(yōu)選地第四部分對應(yīng)于203以上個重復(fù)。在還有另外一個實施方式中，DNA用Sphl和Bmtl片段化并分級，這樣第一部分對應(yīng)于6-62個重復(fù)；優(yōu)選地第二部分對應(yīng)于63-163個重復(fù)；優(yōu)選地第三部分對應(yīng)于164-196個重復(fù)；和優(yōu)選地第四部分對應(yīng)于197以上個重復(fù)。0027也提供了估計基因組DNA樣品中串聯(lián)重復(fù)的數(shù)量方法。在這個方法中，包含基因組DNA的樣品進(jìn)行核酸片段化。產(chǎn)生的核酸片段根據(jù)大小分離成三個或更多的大小范圍部分，通過檢測位于串聯(lián)重復(fù)區(qū)段側(cè)翼的標(biāo)記序列識別在各個部分中包含串聯(lián)重復(fù)區(qū)段的片段，所述標(biāo)記序列與片段化的核酸中的串聯(lián)重復(fù)區(qū)域連接。接著通過將包含重復(fù)的部分大小與在這種核酸片段中存在的串聯(lián)重復(fù)區(qū)段的大小相關(guān)聯(lián)，來確定所檢測的串聯(lián)重復(fù)區(qū)域的大小。分離成三個或更多個大小范圍部分使得能夠更精細(xì)地估計串聯(lián)重復(fù)的數(shù)量。在脆性X情況下，能評價前突變或者全突變的擴張程度。0028在本發(fā)明以上方面的優(yōu)選實施方式中，所述方法包括第二核酸片段化。優(yōu)選地，在大小分離之后進(jìn)行第二片段化，而大小分離在第一核酸片段化之后；優(yōu)選地，第二片段化通過限制性酶消化進(jìn)行。在更優(yōu)選的實施方式中，第二片段化作用從位于特定核酸區(qū)段側(cè)翼的標(biāo)記序列剪切感興趣的特定核酸區(qū)段(例如，串聯(lián)重復(fù)區(qū)段)。優(yōu)選地，第二核酸片段化不在標(biāo)記序列內(nèi)剪切。0029在本發(fā)明以上方面的一些實施方式中，通過擴增所有或者一部分標(biāo)記序列和檢測擴增子來檢測標(biāo)記序列。在優(yōu)選的實施方式中，通過PCR來擴增標(biāo)記序列和通過電泳來檢測擴增子。在更優(yōu)選的實施方式中，在PCR擴增反應(yīng)中所使用的引物包含標(biāo)記，因而對所產(chǎn)生的擴增子進(jìn)行標(biāo)記。如此標(biāo)記的擴增子然后可以通過諸如毛細(xì)管電泳的方法進(jìn)行檢測。0030在本發(fā)明以上方面的其它實施方式中，用實時PCR方法例如TaqMan系統(tǒng)來檢測標(biāo)記序列。在這種方法中，用探針檢測標(biāo)記序列的擴增區(qū)域。0031在本發(fā)明以上方面的其它實施方式中，標(biāo)記序列不需要擴增并且能通過雜交兩種不同標(biāo)記的寡核苷酸探針進(jìn)行直接檢測。這兩種探針一一與標(biāo)記序列的不同區(qū)段雜交，這樣兩種探針能夠同時結(jié)合_一在雜交條件下與片段化的核酸接觸。同時檢測到與多個部分中的單個核酸片段雜交的不同標(biāo)記的探針，表明包含在那部分中的片段中存在串聯(lián)重復(fù)區(qū)域。這個實施方式中的兩個寡核苷酸探針可設(shè)計成與串聯(lián)重復(fù)上游或者下游的標(biāo)記序列的區(qū)段雜交。標(biāo)記序列的這些區(qū)段可以鄰接串聯(lián)重復(fù)區(qū)域或者可以在上游或者下游的遠(yuǎn)處。在優(yōu)選的實施方式中，標(biāo)記序列的區(qū)段在串聯(lián)重復(fù)區(qū)域上游或者下游的500個堿基范圍之內(nèi)；在更優(yōu)選的實施方式中，標(biāo)記序列的區(qū)段在串聯(lián)重復(fù)區(qū)域上游或者下游的250個堿基范圍之內(nèi)；在最優(yōu)選的實施方式中，標(biāo)記序列的區(qū)段在串聯(lián)重復(fù)區(qū)域上游或者下游的IOO個堿基范圍之內(nèi)。探針可設(shè)計成與雙鏈標(biāo)記序列的同一鏈或者相對鏈雜交。探針可與串聯(lián)重復(fù)區(qū)域的上游或者下游雜交。可選地，一個探針可與串聯(lián)重復(fù)區(qū)域上游雜交，而另一個探針與串聯(lián)重復(fù)區(qū)域下游雜交。在一個或多個片段化步驟后，如果兩個區(qū)段都位于相同的連續(xù)核酸分子上，探針可與被零個堿基或者數(shù)十萬個堿基隔開的標(biāo)記序列的區(qū)段雜交。優(yōu)選地，探針被小于lkb個堿基，或者優(yōu)選地小于500個堿基，或者小于300個堿基，或者小于200個堿基，或者小于100個堿基，或者小于50個堿基，或者小于20個堿基，或者小于10個堿基，或者小于5個堿基，或者1個堿基，或者O個堿基隔開。0032在本發(fā)明的另外一方面，提供了確定核酸樣品中特定核酸區(qū)段大小的方法，其中應(yīng)用使用第一種和第二種方法獲得的信息確定大小。因此，該方法包含用第一種方法測量串聯(lián)重復(fù)區(qū)段的大小，用第二種方法測量串聯(lián)重復(fù)區(qū)段的大小，和用通過第一種和第二種方法得到的信息確定串聯(lián)重復(fù)區(qū)域的大小。在一些實施方式中，第一種方法包括串聯(lián)重復(fù)區(qū)域的擴增，優(yōu)選地用PCR擴增。在優(yōu)選的實施方式中，PCR擴增包含標(biāo)記的引物。在另外優(yōu)選的實施方式中，擴增子可以進(jìn)行電泳，優(yōu)選毛細(xì)管電泳，和通過與平行進(jìn)行的標(biāo)準(zhǔn)品比較來確定擴增子大小。在其它實施方式中，第一種方法包括Southern印跡。在優(yōu)選實施方式中，第二種方法包括使樣品的核酸片段化，依照大小將片段化的核酸分離為幾個部分，和檢測感興趣的特定核酸區(qū)段上游或者下游的標(biāo)記序列，其中標(biāo)記序列與片段化的核酸中感興趣的特定核酸區(qū)段連接。然后通過將包含特定核酸區(qū)段的部分大小與核酸樣品中特定核酸區(qū)段的大小相關(guān)聯(lián)，來確定特定感興趣核酸區(qū)段的大小。在某些實施方式中，第一種方法用作起始篩選，對于通過這種方法不能確定特定核酸區(qū)段的大小的樣品通過第二種方法進(jìn)一步分析。在其它實施方式中，使用以上兩種方法中的一種方法進(jìn)行分級，確認(rèn)通過上述兩種方法中另一種方法分級的結(jié)果。在還有其它實施方式中，通過第一種方法進(jìn)行的分級被用于精確地確定特定核酸片段的大小。0033在本發(fā)明的另外一方面，提了用于擴增位于FMR1基因的串聯(lián)重復(fù)區(qū)域側(cè)翼的標(biāo)記序列的引物。在特定的實施方式中，引物選自SEQIDNO:4-9。0034在本發(fā)明的還有另外一方面，提供了用于檢測樣品中特定核酸區(qū)段大小的試劑盒，其包含用于擴增特定核酸區(qū)段上游或下游標(biāo)記核苷酸序列的引物對，和一種或多種限制性內(nèi)切核酸酶，所述限制性內(nèi)切核酸酶用于剪切核酸樣品以產(chǎn)生包含特定核酸區(qū)段和上游或下游標(biāo)記序列的核酸樣品片段。在某些實施方式中，試劑盒還包含一種或者多種限制性內(nèi)切核酸酶，其用于從標(biāo)記核苷酸序列剪切特定的核酸區(qū)段。在還有其它的實施方式中，試劑盒還可包含用于證實片段的合適大小分離的一種或者多種對照；優(yōu)選地對照由一種或多種引物對組成，用于擴增來自大小分離的核酸樣品的一個或多個對照片段。在進(jìn)一步的實施方式中，試劑盒還包含用于證實一種或多種酶消化已經(jīng)完成的一種或多種對照；優(yōu)選地對照包含設(shè)計用于擴增包括所使用酶的識別位點的對照片段的一種或多種引物對。試劑盒還可包含任何必要的緩沖液或者其它試劑。0035在本發(fā)明以上方面的優(yōu)選實施方式中，特定核酸區(qū)段包含串聯(lián)重復(fù)序列區(qū)段。在更優(yōu)選的實施方式中，試劑盒用于檢測FMR1基因的串聯(lián)重復(fù)區(qū)段；優(yōu)選地用于產(chǎn)生核酸樣品片段的酶是優(yōu)選地用于從串聯(lián)重復(fù)剪切標(biāo)記序列的酶是^^7V/;優(yōu)選地試劑盒包含一對或多對用于確定酶消化是否完成的對照引物；優(yōu)選地試劑盒包含一對或多對用于檢測在大小分離的核酸樣品中一個或多個對照片段存在的引物。在其它優(yōu)選的實施方式中，試劑盒用于檢測FMR1基因的串聯(lián)重復(fù)區(qū)段；優(yōu)選地用于產(chǎn)生核酸樣品片段的酶是5/;/和Mfy/;優(yōu)選地用于從串聯(lián)重復(fù)切割標(biāo)記序列的酶是Sw仏優(yōu)選地試劑盒包含一對或多對確定酶消化是否完成的對照引物；優(yōu)選地試劑盒包含一對或多對用于檢測在大小分離的核酸樣品中一個或多個對照片段存在的引物。在還有其它優(yōu)選的實施方式中，試劑盒用于檢測FMRl基因的串聯(lián)重復(fù)區(qū)段;優(yōu)選地用于產(chǎn)生核酸樣品片段的酶是5^W和^^/;優(yōu)選地用于從串聯(lián)重復(fù)切割標(biāo)記序列的酶是5WiV/;優(yōu)選地試劑盒包含一對或多對確定酶消化是否完成的對照引物；優(yōu)選地試劑盒包含一對或多對用于檢測在大小分離的核酸樣品中一個或多個對照片段存在的引物。0036關(guān)于核酸，在這里所使用的"區(qū)段"指一條連續(xù)的核酸。0037在這里所使用的"感興趣的特定核酸區(qū)段"指特定"區(qū)段"或者一條具有已知序列的核酸，優(yōu)選的區(qū)段是那些PCR難擴增的區(qū)段。例子包括具有高含量鳥嘌呤和胞嘧啶堿基的核酸區(qū)段、大的核酸區(qū)段或者有大量串聯(lián)重復(fù)的區(qū)段，一般超過100個三核苷酸重復(fù)。在一些實施方式中，區(qū)段包含刪除、重復(fù)或者插入。在優(yōu)選的實施發(fā)生中，感興趣的特定核酸區(qū)段包含串聯(lián)重復(fù)區(qū)域。0038"具有高含量鳥嘌呤和胞嘧啶堿基的核酸區(qū)段"或"富含GC"指比基因組的平均值大的基因組的那些核酸區(qū)段。一般而言，富含GC是大于40%的鳥嘌呤和胞嘧啶堿基，或者大于50%，或者大于60%，或者大于75%。0039關(guān)于感興趣的特定核酸區(qū)段，在這里所使用的"大小(尺寸，size)"指描述那個區(qū)段大小(magnitude)的數(shù)目或數(shù)量，并能夠用例如分子量、堿基對數(shù)量、或者串聯(lián)重復(fù)拷貝數(shù)來表示。0040在這里所使用的"片段"指由較長長度的核酸斷裂為較短長度的核酸的方法產(chǎn)生的一部分核酸。核酸可以通過化學(xué)或生物化學(xué)方法斷裂或者片段化，優(yōu)選地以可重復(fù)的方式片段化核酸，優(yōu)選地用一種或多種限制性內(nèi)切核酸酶片段化核酸。優(yōu)選地，核酸被片段化以便感興趣的特定核酸區(qū)段和它連接的標(biāo)記序列定位于相同的片段。包含感興趣的核酸區(qū)段的核酸片段的長度將取決于感興趣的核酸區(qū)段的長度以及選擇用于片段化DNA的限制性酶。因此，片段的長度包括感興趣核酸區(qū)段外加區(qū)段上游到5'限制性酶識別位點的區(qū)域(也就是片段的5'端)和區(qū)段區(qū)域下游到3'限制性酶識別位點的區(qū)域(也就是片段的3'端)。0041在這里所使用的"分離片段"指這樣的過程，借助該過程，包含于不同片段混合物中的片段通過物理方式相互分離。0042在這里所使用的"分級(fractkmation)"指這樣的過程，借助該過程，單獨組分的單一混合物被處理，這樣混合物中的至少一些單獨組分互相分開。例如，層析是根據(jù)一些物理/化學(xué)原理分離多組分的混合物的分級方法?？梢栽谀z上或者膜上分離成分，這樣單獨的組分可以被分開鑒定。通過分離混合物成為被捕獲在分開的液體等分試樣(也就是部分)中的不同組分，混合物的單獨組分可被分級。在這里使用的"部分(fmction)"在本發(fā)明的上下文中指這樣的片段群，其具有與片段的起始非分級混合物的大小或者大小范圍不同的某一大小或者大小范圍。0043在這里所使用的"鑒定包含區(qū)段的那些部分"意思是包含感興趣區(qū)段的大小分離片段的部分，通過檢測在核酸片段上與區(qū)段連接的標(biāo)記序列來確定。0044在這里所使用的短語"串聯(lián)重復(fù)區(qū)域"或者"串聯(lián)重復(fù)區(qū)段"指的是包含多拷貝的短DNA序列的DNA區(qū)域。"串聯(lián)重復(fù)序列"或者"串聯(lián)重復(fù)"或者簡單地"重復(fù)"在這里可交替使用和指的是在串聯(lián)重復(fù)區(qū)域中重復(fù)的短的DNA序列。這樣的串聯(lián)重復(fù)能夠在同一方向上彼此相鄰(也就是同向串聯(lián)重復(fù))或者彼此在相反方向上(也就是反向串聯(lián)重復(fù))。重復(fù)序列可以是長度上為二、三、四或者更多個核苷酸。在一些人類基因編碼或者非編碼區(qū)域之內(nèi)的串聯(lián)重復(fù)序列的拷貝數(shù)量的擴增與重復(fù)擴增疾病相聯(lián)系。0046在這里所使用的術(shù)語"樣品"或者"試樣"指的是任何包含基因組DNA的液體或者固體材料。在優(yōu)選的實施方式中，從生物源(也就是"生物樣品")中得到試樣，例如培養(yǎng)的細(xì)胞或者來自于動物的組織樣品，最優(yōu)選地是人。優(yōu)選的組織樣品包括血、骨髓、體液、腦脊液、血漿、血清或組織(如活檢材料)，但不限于此。0046這里所使用的"核酸"泛指染色體區(qū)段、DNA、cDNA和/或RNA的區(qū)段或部分。從任何來源的起始分離核酸樣品可得到或獲得核酸(例如分離自、純化自、擴增自、克隆自、逆轉(zhuǎn)錄自樣品DNA或RNA)。0047在這里所使用的"目標(biāo)核酸"指的是染色體區(qū)段、有或沒有基因間序列的全基因、有或者沒有基因間序列的基因區(qū)段或者部分、或者用于設(shè)計探針或引物的核酸序列。目標(biāo)核酸可包括野生型序列、包含突變、刪除或者重復(fù)的核酸序列、串聯(lián)重復(fù)區(qū)域、感興趣的基因、感興趣基因的區(qū)域或者其任何上游或者下游區(qū)域。目標(biāo)核酸可代表特定基因的替代序列或等位基因。目標(biāo)核酸可來自于基因組DNA、cDNA或者RNA。在這里所使用的目標(biāo)核酸可以是天然DNA或者PCR擴增產(chǎn)物。0048在這里所使用的術(shù)語"標(biāo)記序列"指的是與感興趣的核酸區(qū)段連接的核酸區(qū)段，結(jié)果是樣品中感興趣的標(biāo)記序列的檢測表示感興趣的核酸區(qū)段存在。應(yīng)該根據(jù)標(biāo)記與在特定大小部分中存在的片段中感興趣核酸區(qū)段獨特或充分地連接，選擇用于檢測感興趣的特定核酸區(qū)段的標(biāo)記序列。以雜交方法為基礎(chǔ)，通過使用引物的核酸擴增能夠檢測標(biāo)記序列。通過雜交到一個或多個核酸探針也能夠檢測標(biāo)記序列。依照在這里所公開的方法，通過檢測串聯(lián)重復(fù)上游或者下游的標(biāo)記序列來鑒定在大小分級的核酸片段中包含串聯(lián)重復(fù)區(qū)段的片段。0049標(biāo)記序列可以是在感興趣的核酸區(qū)段之內(nèi)或者可以是在感興趣核酸的側(cè)翼。在這里所使用的術(shù)語"側(cè)翼"指的是鄰接或者遠(yuǎn)離感興趣區(qū)域的DNA區(qū)域。側(cè)翼區(qū)域可以是感興趣區(qū)域的"上游"(也就是5')或者下游(也就是3')。標(biāo)記序列可以鄰接串聯(lián)重復(fù)區(qū)域或者位于上游或者下游的一定距離。在優(yōu)選的實施方式中，標(biāo)記序列在串聯(lián)重復(fù)區(qū)域的上游或下游的500個堿基之內(nèi)；在更優(yōu)選的實施方式中，標(biāo)記序列在串聯(lián)重復(fù)區(qū)域上游或下游的250個堿基之內(nèi)；在最優(yōu)選的實施方式中，標(biāo)記序列在串聯(lián)重復(fù)區(qū)域上游或下游的100個堿基之內(nèi)。側(cè)翼區(qū)域可以是編碼或者非編碼序列和可以是與包含感興趣區(qū)域的基因相同或者不同的基因。在優(yōu)選的實施方式中，標(biāo)記序列位于感興趣核酸區(qū)段的側(cè)翼。0050在某些實施方式中，通過包含特定核酸區(qū)段的部分大小與核酸樣品中的特定核酸區(qū)段的大小相關(guān)聯(lián)，確定感興趣的特定核酸區(qū)段的大小。使用在這里所公開的査閱表，來完成將包含特定核酸區(qū)段的部分大小與核酸樣品中特定核酸區(qū)段的大小相關(guān)聯(lián)的這個步驟。在其它實施方式中，用計算機程序來完成這個步驟。0051這里所使用的短語"在產(chǎn)生片段的條件下，將包含感興趣的特定核酸區(qū)段的部分大小與存在于該部分中感興趣的特定核酸區(qū)段的大小相關(guān)聯(lián)"指的是由在特定部分大小中的位置來確定感興趣的特定核酸區(qū)段的大小的方法。在一個方法中，查詢表基于感興趣的特定核酸區(qū)段的每一組合和片段化方法(例如，使用特定的限制性內(nèi)切核酸酶)而建立。査詢表聯(lián)系每個部分(包含一系列的片段大小)與存在于這樣的片段中的感興趣區(qū)段的長度。在任何特定部分中，具有包含感興趣的區(qū)段和其它序列的片段。因此，在任何部分中，從序列數(shù)據(jù)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能夠計算出片段中代表感興趣區(qū)段的堿基的數(shù)量。這種相關(guān)性可用實驗來建立或者通過使用產(chǎn)生的片段的已知DNA序列來建立。對于任何特定未知的樣品，通過將包含感興趣的區(qū)段的片段大小與反映產(chǎn)生片段的相同條件的合適査詢表相關(guān)聯(lián)來確定感興趣的區(qū)段的大小。通過使用這個過程，在產(chǎn)生片段條件下，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將包含感興趣的特定核酸區(qū)段的部分大小與存在于該部分中感興趣的特定核酸區(qū)段的大小相關(guān)聯(lián)。為了實現(xiàn)該方法，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員制作查詢表不是必不可少的。例如，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以產(chǎn)生計算機程序來實現(xiàn)該相關(guān)步驟。0052"基因組核酸"或者"基因組DNA"指的是來自于細(xì)胞核的一些或者所有的DNA?；蚪MDNA可以是完整的或者成片段的(例如通過現(xiàn)有技術(shù)中已知的方法用限制性內(nèi)切核酸酶來消化)。在一些實施方式中，基因組DNA可包括來自于單一基因的所有或者一部分或者來自多基因的序列、來自于一個或多個染色體的序列、或者來自于細(xì)胞的所有染色體的序列。相比之下，在這里所使用的術(shù)語"全部的基因組核酸"指的是包含在細(xì)胞基因中全互補DNA。眾所周知，基因組核酸包括基因編碼區(qū)域、內(nèi)含子、5'和3'非翻譯區(qū)、5'和3'側(cè)翼DNA以及結(jié)構(gòu)區(qū)段例如端粒和著絲粒DNA、復(fù)制起點和基因間DNA?；蚪M核酸可以從細(xì)胞核得到，或者重組產(chǎn)生。也可由直接從細(xì)胞核分離的DNA或者RNA來轉(zhuǎn)錄基因組DNA。也可使用PCR擴增。從多種樣品純化DNA和/或RNA的方法在現(xiàn)有技術(shù)中是眾所周知的。0053術(shù)語"等位基因"和"等位變異"在這里可交換使用。等位基因是占據(jù)染色體上特定基因座或者位置的相同基因的序列或許多替代形式中的任一種。對于每個基因座的單個等位基因分別從每個親本遺傳，對于每個基因產(chǎn)生兩個等位基因。具有特定基因的兩個拷貝的相同等位基因的個體在那個基因座上是純合的，而具有特定基因的兩個不同等位基因的個體是雜合的。0054"重復(fù)擴增疾病(repeatexpansiondisease)"指的是顯示孟德爾遺傳模式的大約24種人類疾病中的任何疾病，其顯示出由內(nèi)在多態(tài)性串聯(lián)重復(fù)的擴增所引起，主要涉及不同的三核苷酸基序但還涉及多達(dá)12聚體的較長重復(fù)序列(表l)。包含擴增的串聯(lián)重復(fù)的等位基因的特征是在連續(xù)世代中過分的不穩(wěn)定性(動態(tài)突變)。而且，在相同生物的細(xì)胞群中，這些等位基因在長度上可以不同(鑲嵌現(xiàn)象)。一種類型的重復(fù)擴增疾病是三核苷酸重復(fù)序列疾病(例如，脆性X綜合癥、強直性肌營養(yǎng)不良l等)，這是最大量形式的重復(fù)擴增疾病。這些疾病顯示了代間重復(fù)不穩(wěn)定性，并具有串聯(lián)重復(fù)進(jìn)一步擴增的趨勢。在連續(xù)世代中增加的重復(fù)長度能夠?qū)е略谑芮忠u的個體中較早年齡的發(fā)作和/或加重的臨床癥狀。本文所述測量串聯(lián)重復(fù)長度的方法可以應(yīng)用于測量表3中任一種疾病/基因的串聯(lián)重復(fù)長度。21表1示例性的串聯(lián)重復(fù)擴增疾病<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>*=乂染色體；#=常染色體隱性；未指定-常染色體顯性0055在這里所使用的術(shù)語"寡核苷酸"指的是由脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸或者其任何組合組成的短聚合物。本發(fā)明的寡核苷酸在長度上一般是在大約10至大約100個核苷酸之間。寡核苷酸優(yōu)選長度為15到70個核苷酸，以20到26個核苷酸最常見。用于核苷酸的單字母代碼如在美國專利局的專利審查程序手冊2422章節(jié)的表1中所描述。在這點上，核苷酸名稱"R"表示鳥嘌呤或者腺嘌呤。"Y"表示胸腺嘧啶(如果是RNA，表示尿嘧啶)或者胞嘧啶；"M"表示腺嘌呤或鳥嘌呤。寡聚核苷酸可以用作引物或者探針。0056關(guān)于寡核苷酸，在這里所使用的術(shù)語"基本上純化的"不要求絕對的純度。相反，它表示序列比在自然環(huán)境中相對更純。通過多種方法可得到這樣的寡核苷酸，包括例如實驗室合成、限制性酶消化或者PCR。"基本上純化的"寡核苷酸優(yōu)選地大于50%純、更優(yōu)選地至少75%純，和最優(yōu)選地至少95%純。0057在這里所使用的，當(dāng)比對寡核苷酸和核酸時，如果寡核苷酸與核酸的一部分具有至少50%序列同一性時，寡核苷酸對于核酸是"特異的"。對核酸特異的寡核苷酸是這樣的寡核苷酸，其在合適的雜交或者洗滌條件下，能夠與感興趣的目標(biāo)雜交，而與非感興趣的核酸基本上不雜交。較高水平的序列同一性是優(yōu)選的，包括至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%和最優(yōu)選的至少98%的序列同一性。0058在這里所使用的，術(shù)語"雜交"或者"特異性雜交"指的是在適當(dāng)嚴(yán)格條件下兩個互補核酸鏈互相退火的過程。雜交典型地和優(yōu)選地用探針長度的核酸分子進(jìn)行，優(yōu)選長度為20-100個核苷酸。核酸雜交技術(shù)在現(xiàn)有技術(shù)中是眾所周知的。參見，例如，Sambrook等，1989,MolecularCloning:ALaboratoryManual,SecondEdition,ColdSpringHarborPress,Plainview,N.Y。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道如何評估和調(diào)整雜交條件的嚴(yán)格性，這樣至少具有理想水平的互補性的序列將穩(wěn)定地雜交，而具有低互補性的序列則不會穩(wěn)定地雜交。對于雜交條件和參數(shù)的例子，參見Sambrook等,1989,MolecularCloning:ALaboratoryManual,SecondEdition,ColdSpringHarborPress,Plainview,N.Y.;Ausubel，F(xiàn).M.等1994，CurrentProtocolsinMolecularBiology.JohnWiley&Sons,Secaucus，N.J。0059在這里所使用的術(shù)語"基本上互補"意思是在嚴(yán)格雜交條件下兩條序列雜交。熟練技術(shù)人員將理解基本互補的序列不需要在它們的整個長度雜交。特別地是，基本互補的序列包含了不與目標(biāo)或標(biāo)記序列雜交的連續(xù)堿基序列，位于在嚴(yán)格雜交條件下與目標(biāo)或標(biāo)記序列雜交的連續(xù)堿基序列的3'或5'端。0060在這里所使用的術(shù)語"互補"意思是依照沃森/克里克配對規(guī)則與核酸互補的序列?；パa序列也可以是與DNA序列或者它的互補序列互補的RNA序列，和也可以是cDNA。0061在這里所使用的術(shù)語"編碼序列"意思是能夠被轉(zhuǎn)錄和/或翻譯產(chǎn)生用于和/或多肽或其片段的mRNA的核酸序列或者它的互補、或者它的一部分。在基因組DNA或者未成熟的初級RNA轉(zhuǎn)錄物中編碼序列包含外顯子，其通過細(xì)胞的生化機制連接在一起以提供成熟mRNA。反義鏈?zhǔn)沁@樣核酸的互補，并由之可以推算出編碼序列。0062在這里所使用的"非編碼序列"意思是在體內(nèi)不轉(zhuǎn)錄成為氨基酸的核酸序列、它的互補或者它的一部分，或者在tRNA不相互作用以安置或試圖安置氨基酸時。非編碼序列包含在基因組DNA或者未成熟的初級RNA轉(zhuǎn)錄物中的內(nèi)含子序列和基因相關(guān)序列，如啟動子、增強子、沉默基因等。0063在這里所使用"擴增(amplification)，，或者"擴增(amplify)"意思是在現(xiàn)有技術(shù)中已知用于復(fù)制目標(biāo)核酸的一種或者多種方法，由此增加選擇的氨基酸序列的拷貝數(shù)。擴增可以是指數(shù)擴增或者線性擴增。目標(biāo)核酸可以是DNA或者RNA。以這種方式擴增的序列形成了"擴增子"。而在下文中所描述的示例方法涉及到使用聚合酶鏈反應(yīng)("PCR")的擴增，在現(xiàn)有技術(shù)中已知有許多用于擴增核酸的其它方法(例如等溫方法、滾環(huán)方法等)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解的是這些其它方法可以替代或者與PCR方法一起使用。參考，例如Saiki，"AmplificationofGenomicDNA"inPCRProtocols,Innis等，Eds"AcademicPress,SanDiego,CA1990,pp13-20;Wharam等，NucleicAcidsRes.2001Jun1;29(11):E54-E54;Hafner等，Biotechniques242001Apr;30(4):852-6,858，860passim;Zhong等，Biotechniques2001Apr;30(4):852-6,858,860passim。0064]在這里所使用的用于擴增的"引物"是與目標(biāo)或者標(biāo)記核苷酸序列特異性退火的寡核苷酸。引物的3'端核苷酸應(yīng)該與在相應(yīng)的核苷酸位置用于最佳擴增的目標(biāo)或者標(biāo)記序列相同。0065"有義鏈"意思是雙鏈DNA(dsDNA)中包含功能蛋白至少一部分編碼序列的鏈。"反義鏈"意思是與有義鏈反相互補的dsDNA的鏈。0066在這里所使用的，"正向引物"是與dsDNA的反義鏈退火的引物。"反向引物"與dsDNA的有義鏈退火。0067在這里所使用的，具有"高度序列同一性"的序列在至少大約50%的比對核苷酸位置具有相同的核苷酸，優(yōu)選地在至少大約75%的比對的核苷酸位置，更優(yōu)選地在至少大約90%的比對的核苷酸位置，和最優(yōu)選地在至少大約95%的比對的核苷酸位置具有相同的核苷酸。0068在這里所使用的"TagManPCR檢測系統(tǒng)"指實時PCR方法。在這種方法中，與擴增的核酸區(qū)段雜交的TaqMan探針包含在PCR反應(yīng)混合中。TaqMan探針包括在探針任一端的供體和熒光團淬滅劑并且彼此之間足夠緊密接近，以便淬滅劑吸收供體的熒光。然而，當(dāng)探針與擴增的區(qū)段雜交時，Taq聚合酶的5'-核酸外切酶活性剪切探針，因而使得供體熒光團發(fā)出能夠被檢測到的熒光。附圖簡述0069圖l，顯示檢測串聯(lián)重復(fù)的方法的一個實施方式示意圖。在每個所標(biāo)示的大小部分(例如，小、中和大)的底部圖解顯示了具有特定長度的串聯(lián)重復(fù)的FMR1片段的存在。在PCR下面所顯示的+或者-符號表明了當(dāng)在部分中存在特定片段時，側(cè)翼標(biāo)記序列的PCR擴增是否發(fā)生。0070圖2，F(xiàn)MR1基因的區(qū)域的示例性序列(SEQIDN0:1)，顯示了CGG串聯(lián)重復(fù)區(qū)域(單下劃線)、用于雜交PCR引物的優(yōu)選位置(陰影區(qū)域)和用于雜交探針的優(yōu)選位置(雙下劃線)。0071圖3，DM-1基因3，下游非翻譯區(qū)的示例性序列(SEQIDNO:2)，顯示了CTG串聯(lián)重復(fù)區(qū)域(單下劃線)、用于雜交PCR引物的優(yōu)選位置(陰影區(qū)域)和用于雜交探針的優(yōu)選位置(雙下劃線)。0072圖4，F(xiàn)RDA基因第一內(nèi)含子區(qū)的示例性序列(SEQIDNO:3)，顯示了CAA串聯(lián)重復(fù)區(qū)域(單下劃線)、用于雜交PCR引物的優(yōu)選位置(陰影區(qū)域)和用于雜交探針的優(yōu)選位置(雙下劃線)。0073圖5，F(xiàn)MR1基因的區(qū)域的限制酶圖譜。FXCEF3、FXCER3、FMR1F4、FMR1R4、FXCEF2和FXCER2顯示了優(yōu)選核苷酸弓1物的雜交位置。當(dāng)用Sphl/Bmtl、Alul和Blpl/Mlyl分別片段化核酸的時候，F(xiàn)XCEF3/FXCER3、FMR1F4/FMR1R4和FXCEF2/FXCER2是用于擴增標(biāo)記序列的優(yōu)選引物對。發(fā)明詳述0074依照本發(fā)明，提供了在核酸樣品中檢測感興趣的特定核酸區(qū)段的方法。在特定的實施方式中，感興趣的特定核酸區(qū)段是串聯(lián)重復(fù)和該方法用于確定關(guān)于這種串聯(lián)重復(fù)的大小的信息。這種信息可用于確定個體是否攜帶遺傳突變，該遺傳突變的特征是與特定基因相關(guān)的串聯(lián)重復(fù)數(shù)量增加(也就是擴增)或減少(也就是減小)。因此，所描述的是測量核酸樣品中串聯(lián)重復(fù)區(qū)段大小的方法，該方法包括通過檢測位于串聯(lián)重復(fù)區(qū)段側(cè)翼的標(biāo)記序列，在大小分離的核酸片段的部分中鑒定串聯(lián)重復(fù)，和然后將包含重復(fù)的部分大小與這樣的核酸片段中存在的串聯(lián)重復(fù)區(qū)段的大小相關(guān)聯(lián)。圖1以示圖形式顯示了這種方法的一個實施方式。如以下所討論，在大小分離之后和在"分析"步驟之前，這種方法的變化是進(jìn)行第二次片段化作用。存C備0075本發(fā)明的方法可用于檢測特征是在試樣的基因組DNA中基因的串聯(lián)重復(fù)區(qū)域擴增或者減小的突變。因此，該方法可以用包含基因組DNA的任何生物樣品進(jìn)行。例子包括組織樣品或者任何包含細(xì)胞的體液。血液是優(yōu)選的生物樣品。生物樣品可用標(biāo)準(zhǔn)流程得到，和可以立即使用或者在該類型生物樣品的合適條件下貯存，供以后使用。0076獲得試樣的方法對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是眾所周知的并且包括吸出、組織切片、血液或者其它流體的抽取、外科或者針吸組織檢查等，但是不限于此。試樣可以從個體或者患者獲得。試樣可包含從懷疑正在受折磨的患者或者由串聯(lián)重復(fù)序列的擴增所引起的疾病的攜帶者得到的細(xì)胞、組織或者流體。試樣可以是包含細(xì)胞的液體或者組織。樣品可以包括羊水、活組織檢查、血液、血細(xì)胞、骨髓、細(xì)針活組織檢査樣品、腹腔液、血漿、胸水、唾液、精液、血清、組織或組織勻漿、冷凍或石蠟組織切片，但不限于此。樣本也可處理，如組織的切片、分級、純化或細(xì)胞器分離。0077本發(fā)明方法也可以用于進(jìn)行使用胚胎、胎兒細(xì)胞或者包含核酸的體液中任何種類的產(chǎn)前診斷。胎兒細(xì)胞可以通過懷孕女性或者從胚胎樣品中得到。因此，胎兒細(xì)胞可以存在于通過羊膜穿刺術(shù)獲得的羊水、通過注射器吸取的絨膜絨毛、經(jīng)皮臍血、胎兒皮膚活組織檢測、來自四細(xì)胞到八細(xì)胞階段胚胎的卵裂球(著床前)、或者來自胚泡的滋養(yǎng)外胚層樣品(著床前或者通過子宮沖洗術(shù))中。0078在特定的實施方式中，可使用基因組DNA。基因組DNA可以用標(biāo)準(zhǔn)方法從細(xì)胞或者組織中分離，參見，例如，Sambrook等，1989,MolecularCloning:ALaboratoryManual,SecondEdition,ColdSpringHarborPress,Plainview,NY。0079基因組DNA可通過現(xiàn)有技術(shù)中眾所周知的各種方法片段化。優(yōu)選地，用限制性內(nèi)切核酸酶消化來使DNA片段化。0080在這里所使用的"限制性內(nèi)切核酸酶"或者"限制性酶"指的是在特定的序列(也就是識別序列或者位點)剪切雙鏈DNA的酶。給定限制性內(nèi)切核酸酶切割DNA的頻率取決于酶識別位點的長度。例如，一些酶識別位點是四個核苷酸長(稱為"四刀具(fourcutter)")。一般而言，根據(jù)識別位點的長度和任何一個核苷酸出現(xiàn)在給定位置的可能性是四分之一的假定，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠估計酶應(yīng)該以怎樣的頻率切割一片DNA。在"四刀具"的情況下，四個核苷酸的特定序列必須存在。假定每個核苷酸有相等的機會(也就是四分之一)出現(xiàn)在四個核苷酸序列之內(nèi)的任何特定位點，那么四刀具應(yīng)該平均每256個堿基對切割一次(也就是1/4x1/4x1/4x1/4=1/256)。只要識別位點的長度是己知的，類似的計算方法可應(yīng)用于任何限制性酶，這使得預(yù)測通過剪切己知大小的DNA分子得到的DNA片段的大小和數(shù)量成為可能。這使得本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠生產(chǎn)已知大小的DNA片段。限制性內(nèi)切核酸酶從細(xì)菌得到，或者通過重組技術(shù)產(chǎn)生，和容易從許多商業(yè)來源獲得。0081在限制性內(nèi)切核酸酶片段化方法中，限制性內(nèi)切核酸酶與基因組DNA樣品和用于內(nèi)切核酸酶最佳活性的緩沖液結(jié)合。一般而言，一個單位的內(nèi)切核酸酶將在37°C、1小時內(nèi)消化1微克的DNA。0082本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到，通過使用以特定頻率或者在特定位置切割的限制性內(nèi)切核酸酶或者使用多種限制性酶，能夠改進(jìn)這種片段化方法。在試驗中，選擇適合感興趣的基因的酶或者酶組合。一般而言，本領(lǐng)域技術(shù)人員將選擇酶或者酶組合以產(chǎn)生包含全部串聯(lián)重復(fù)區(qū)域和上游或者下游標(biāo)記序列的片段。通過使用包圍串聯(lián)重復(fù)的區(qū)域的限制性酶圖譜，可以選擇用于片段化的酶。通過本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的軟件程序，可以容易產(chǎn)生這樣圖譜。0083特別是，本領(lǐng)域技術(shù)人員會選擇獲得合適大小的片段的酶或者酶組合，以將正常長度的串聯(lián)重復(fù)區(qū)域與異常長度的串聯(lián)重復(fù)區(qū)域區(qū)別開。在確定片段的合適大小時，本領(lǐng)域技術(shù)人員將考慮與異常串聯(lián)重復(fù)區(qū)域相比正常串聯(lián)重復(fù)區(qū)域長度范圍內(nèi)的差異。例如，如果正常串聯(lián)重復(fù)區(qū)域和異常串聯(lián)重復(fù)區(qū)域之間的差異小，本領(lǐng)域技術(shù)人員將選擇較短長度的片段，而如果差異大，本領(lǐng)域技術(shù)人員將選擇較長長度的片段。0084在優(yōu)選的實施方式中，用^w/片段化核酸J/w/是一種識別雙鏈DNA的四核苷酸序列(也就是-AGCT-)的限制性酶。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到，W"/的同切點酶(也就是具有相同識別序列和切割位點的限制性酶)可容易地替代^/"/。^m/同切點酶的例子包括^a丄/、MaW、M/,/和Oca/，但是不限于此。本領(lǐng)域技術(shù)人員還會認(rèn)識到，^/"/的異切點酶(也就是與另一酶具有相同識別位點、但是不同切割位點的限制酶)也可能替代^/m/。0085本領(lǐng)域技術(shù)人員會認(rèn)識到，在這個方法中與Aw/具有相同切割頻率的其它限制酶可以替代J/"/。例如，識別4-核苷酸序列的^/m/以大約每256個堿基剪切DNA。預(yù)期具有不同4-核苷酸識別序列的其它酶(例如Z);w/、i^/、il必o/和;V/"/)將以與Alul相似的頻率切割，和因此會產(chǎn)生大小類似于J/"/的片段。0086在其它優(yōu)選的實施方式中，別;/和M(v/組合用于片段化核酸。在還有其它優(yōu)選實施方式中，S;7W和^^/組合用于片段化核酸。扁A虔游力力分蓐0087使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的各種方法可完成依照大小進(jìn)行的DNA片段分離。例如，可以使用凝膠電泳或柱層析的各種方法(例如，尺寸排阻高效液相層析(SEC-HPLC)和變性HPLC(DHPLC))。0088在凝膠電泳中，利用施加了電場的凝膠基質(zhì)根據(jù)大小來分離核酸分子或者其片段。一般而言，較小的核酸片段會比較大的片段更快地移動通過凝膠基質(zhì)。優(yōu)選的凝膠基質(zhì)包括瓊脂糖和聚丙烯酰胺。0089在優(yōu)選的實施方式中，使用毛細(xì)管電泳分離片段化的核酸。毛細(xì)管電泳是根據(jù)當(dāng)施加電壓時，樣品成分在毛細(xì)管中的不同電泳遷移率進(jìn)行的分離方法。一般通過在毛細(xì)管中的窗口，使用紫外線光譜或熒光分析"柱上"檢測分離的片段或者分子。一般而言，首先將一種或者多種標(biāo)準(zhǔn)品(具有己知長度的核酸區(qū)段)注射入到毛細(xì)管中，使用柱上檢測確定每種標(biāo)準(zhǔn)品的洗脫時間。然后，為了獲得合適大小范圍的部分，標(biāo)準(zhǔn)品的洗脫時間被用于確定收集部分所經(jīng)歷的時間長度。0090在一些實施方式中，在試驗中所使用的部分的大小范圍可根據(jù)商業(yè)上可獲得的標(biāo)準(zhǔn)品的堿基對長度來選擇。許多包含混合長度的核酸的標(biāo)準(zhǔn)品是能夠得到的。在一個例子中，使用包含具有以下長度的核酸片段的標(biāo)準(zhǔn)品200bp、300bp、400bp、500bp、600bp、700bp、800bp、900bp和1000bp。因此，隨后根據(jù)在標(biāo)準(zhǔn)品中存在的一種或多種大小來選擇部分。例如，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以選擇以下三個部分1)小于或者等于300bp，和2)301-500bp，和5)大于或者等于501。本領(lǐng)域技術(shù)人員隨后根據(jù)300bp和500bp標(biāo)準(zhǔn)品的洗脫時間來收集片段化核酸樣品的部分。能夠計算出在每個部分中存在的串聯(lián)重復(fù)的數(shù)量范圍。0091可選地，可以根據(jù)每個部分合適數(shù)量的串聯(lián)重復(fù)來選擇部分。在這種情況下，如果市場上沒有銷售，可以合成表示每個部分大小的上線和下限的標(biāo)準(zhǔn)品。0092在一些實施方式中，為了區(qū)別正常與異常長度的串聯(lián)重復(fù)區(qū)域，將片段分離成最小數(shù)量的部分。在特定的實施方式中，部分可分離成兩個部分，一個對應(yīng)于正常的串聯(lián)重復(fù)區(qū)域和一個對應(yīng)于異常的串聯(lián)重復(fù)區(qū)域。0093在其它的實施方式中，為了確定串聯(lián)重復(fù)區(qū)域的大小，將片段分離成較大數(shù)量的部分。一般而言，更多的部分將使得能夠更精確地確定串聯(lián)重復(fù)區(qū)域的長度。為了在確定串聯(lián)重復(fù)區(qū)域的長度時獲得期望水平的精確度，可以選擇部分的數(shù)量。0094在確定FMR1基因串聯(lián)重復(fù)數(shù)量的試驗的優(yōu)選實施方式中，Alul片段化的DNA被分離成對應(yīng)于大小約211-358bp(較低部分)和359bp-9kbp(較高部分)的兩個部分。來自于包含正常FMR1基因樣品的片段(也就是小于55個串聯(lián)重復(fù))將分離入較低部分，而來自于包含前突變(也就是大約55-200個串聯(lián)重復(fù))或者全突變(也就是大于200個串聯(lián)重復(fù))的FMR1基因的片段將分離入較高部分。0095在確定FMR1基因串聯(lián)重復(fù)數(shù)量的試驗的另一優(yōu)選實施方式中，Alul片段化的DNA被分離成對應(yīng)于大小約2U-400bp(較低部分)和401bp-9kbp(較高部分)的兩個部分。來自于包含正常FMR1基因樣品(也就是小于55個串聯(lián)重復(fù))和具有56-69串聯(lián)重復(fù)的前突變的片段將分離入較低部分，而來自于包含具有70-200個串聯(lián)重復(fù)的前突變或者全突變(也就是大于200個串聯(lián)重復(fù))的FMR1基因的片段將分離入較高部分。0096在確定FMR1基因串聯(lián)重復(fù)數(shù)量的試驗的另一優(yōu)選實施方式中，AM片段化的DNA被分離成對應(yīng)于大小大約小于或者等于400bp(第一/最低部分)、401-500bp(第二部分)、501掘bp(第三部分)和800bp-9kp(第四/最高部分)的四個部分。來自于包含正常FMR1基因的樣品的片段(也就是小于55個串聯(lián)重復(fù))和那些包含具有56-68個串聯(lián)重復(fù)的前突變的片段將分離入第一/最低部分，而來自于包含小前突變的FMR1基因的片段(也就是69-102個串聯(lián)重復(fù))將分離入第二部分，而來自于包含大前突變(也就是103-200個串聯(lián)重復(fù))和包含具有201-202個串聯(lián)重復(fù)的全突變的FMR1基因的片段將分離入第三部分，而具有大于202個串聯(lián)重復(fù)的全突變將分離進(jìn)入第四/最高部分。0097在確定FMR1基因串聯(lián)重復(fù)數(shù)量的試驗的另一優(yōu)選實施方式中，用Sphl和Bmtl組合片段化的DNA被分離成對應(yīng)于大小大約小于或者等于500bp(第一/最低部分)、501-800bp(第二部分)、801-900bp(第三部分)和901bp-9kp(第四/最高部分)的四個部分。來自于包含正常FMR1基因的樣品的片段(也就是小于55個串聯(lián)重復(fù))和那些包含具有56-62個串聯(lián)重復(fù)的前突變的片段將分離進(jìn)入第一/最低部分，而來自于包含小前突變的FMR1基因的片段(也就是63-163個串聯(lián)重復(fù))將分離入第二部分，而來自包含大前突變的FMR1基因的片段(也就是164-196個串聯(lián)重復(fù))將分離入第三部分，和具有197-200個串聯(lián)重復(fù)的大前突變和全突變(也就是大于200個串聯(lián)重復(fù))將分離入第四/最高部分。0098在確定FMR1基因串聯(lián)重復(fù)數(shù)量的試驗的另一優(yōu)選實施方式中，用BlpI和dMlyl組合片段化的DNA被分離成對應(yīng)于大小大約小于或者等于603bp(第一/最低部分)、604-840bp(第二部分)、841-1078bp(第三部分)和1079bp-9kp(第四/最高部分)的四個部分。來自于包含正常FMR1基因的樣品的片段(也就是小于55個串聯(lián)重復(fù))和那些包含具有56-62個串聯(lián)重復(fù)的前突變的片段將分離入第一/最低部分，而來自于包含小前突變的FMR1基因的片段(也就是63-140個串聯(lián)重復(fù))將分離進(jìn)入第二部分，而來自于含有大前突變(也就是141-200個串聯(lián)重復(fù))和具有201-220個串聯(lián)重復(fù)的全突變的FMR1基因的片段將分離入第三部分，和具有大于220個串聯(lián)重復(fù)的大的前突變將分離入第四/最高部分。0099在另外優(yōu)選實施方式中，片段化的DNA依據(jù)大小分離成為多個部分。使用例如預(yù)置部分時間窗口(presetfractiontimewindow)來實現(xiàn)部分的自動收集，在大約200bp開始和在9kb終結(jié)。這種方法使得能夠較精細(xì)地估計片段大小，和由此估計重復(fù)的數(shù)量。腦麟二汰A靴00100在還有其它優(yōu)選實施方式中，本發(fā)明方法包括在第一核酸片段化的大小分離后進(jìn)行第二次核酸片段化。優(yōu)選地，用限制性內(nèi)切核酸酶消化來進(jìn)一步斷裂DNA。優(yōu)選地，第二次片段化將串聯(lián)重復(fù)區(qū)段與連接的標(biāo)記序列分離。00101在優(yōu)選的實施方式中，當(dāng)標(biāo)記序列位于串聯(lián)重復(fù)區(qū)段的上游時，使用限制性酶5^附、7/^7朋/、//如/或者&W/進(jìn)行核酸第二次片段化。在其它優(yōu)選實施方式中，當(dāng)標(biāo)記序列位于串聯(lián)重復(fù)區(qū)段的下游時，使用限制性酶5Vw//、B6v/或者^^/進(jìn)行核酸第二次片段化。本領(lǐng)域技術(shù)人員會認(rèn)識到，也可以使用所列出的限制性酶的同切點酶和異切點酶。通過分析包括標(biāo)記位置、標(biāo)記序列以及標(biāo)記序列與串聯(lián)重復(fù)區(qū)段之間序列的因素，但是不限于此，本領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠鑒定用于第二次核酸片段化的合適的限制性酶。丈</、分離游"假A虔或^^二汰^"虔眾后游ZMC4^f皮游f潛00102大小分離的DNA可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的各種方法擴增。適合本方法使用的擴增方法包括例如聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、連接酶鏈反應(yīng)(LCR)、基于轉(zhuǎn)錄的擴增系統(tǒng)(TAS)、基于核酸序列的擴增(NASBA)反應(yīng)、自動維持序列復(fù)制(3SR)、鏈置換擴增(SDA)反應(yīng)、反向DNA擴增(boomerangDNAamplification)(BDA)、Q-|3復(fù)制或等溫核酸序列依賴性擴增。在下文對這些擴增方法每個進(jìn)行簡單描述，這些擴增方法在現(xiàn)有技術(shù)中是眾所周知的。00103PCR是用于產(chǎn)生特定模板DNA序列的許多拷貝的技術(shù)。反應(yīng)由多個擴增循環(huán)組成和使用雜交到將被復(fù)制序列的5'和3'端的一對引物序列來起始。擴增循環(huán)包括最初的變性、最高達(dá)50個循環(huán)的退火、鏈延伸和鏈分離(變性)。在反應(yīng)的每個循環(huán)中，引物之間的DNA序列進(jìn)行了復(fù)制。引物能夠結(jié)合到復(fù)制的DNA以及原始的模板序列，因此整個拷貝數(shù)隨著時間推移以指數(shù)增加。可以依照Whelan等，Jow""Z。/C"w'c"ZM/cra&oZogy,33(3):556-561(1995)，進(jìn)行PCR。簡單地說，PCR反應(yīng)混合物包括兩條特定的引物、dNTPs、大約0.25U的Taq聚合酶和lxPCR緩沖液。對于每25微升的PCR反應(yīng)，加入2微升樣品(例如來自目標(biāo)生物中的分離DNA)和使用熱循環(huán)儀進(jìn)行擴增。00104LCR是類似于PCR的DNA擴增方法，除了它使用四條引物而不是兩條引物和使用連接酶來連接或者結(jié)合兩個DNA區(qū)段之外?？梢砸勒誐oore等,Jow"a/o/a,'w'ca/M/cra6/o/ogy36(4):1028-1031(1998)，進(jìn)行LCR。簡單地說，LCR反應(yīng)混合物包含大約90微升的兩對引物、dNTPs、DNA連接酶和DNA聚合酶，加入100微升從目標(biāo)生物中分離的核酸。使用熱循環(huán)儀進(jìn)行擴增(例如，LCx，來自AbbottLabs,NorthChicago,IL)。00105TAS是每個循環(huán)由cDNA合成步驟和RNA轉(zhuǎn)錄步驟組成的核酸擴增系統(tǒng)。在cDN合成步驟中，由DNA依賴的RNA聚合酶所識別的序列(也就是聚合酶結(jié)合序列或者PBS)被插入待擴增的目標(biāo)或者標(biāo)記序列下游的cDNA拷貝中，這利用雙結(jié)構(gòu)域的寡核苷酸引物進(jìn)行。在第二步驟中，使用RNA聚合酶從cDNA模板合成多拷貝的RNA。使用TAS的擴增僅需要少數(shù)幾個循環(huán)，因為DNA依賴性的RAN轉(zhuǎn)錄對于每個cDNA模板的拷貝能夠產(chǎn)生10-1000個拷貝。可以依照Kwoh等，/W^S86:1173-7(1989)進(jìn)行TAS。簡單而言，提取的RNA與TAS擴增緩沖液和牛血清白蛋白、dNTPs、NTPs和其中一個包含PBS的兩個寡核苷酸引物組合在一起。加熱樣品使RNA模板變性并冷卻到引物退火的溫度。反轉(zhuǎn)錄酶(RT)加入到在合適溫度溫育的樣品中，使cDNA延伸。隨后，加入T7RNA聚合酶，樣品在37。C溫育大約25分鐘，用于合成RNA。然后重復(fù)上述步驟?？蛇x地，在最初的cDNA合成之后，在1分鐘IOO'C變性后，加入RT和RNA聚合酶，接著在37°。下RNA延伸大約30分鐘。也可以依照Wylie等，Jowma/o/C7/m'ca/M,'cra6/o/ogK，36(12):3488-3491(1998)，在固相上進(jìn)行TAS。在這種方法中，用包含特定捕獲引物的磁珠來捕獲目標(biāo)核酸。在加入包含擴增引物、dNTP、NTP、2500U的反轉(zhuǎn)錄酶和2500U的T7RNA聚合酶的擴增試劑之前，攜帶捕獲的目標(biāo)的磁珠進(jìn)行清洗和沉淀。100微升的TMA反應(yīng)混合物放置到試管中，加入200微升的油試劑(oilreagent)和通過在42'C水浴中溫育1小時來完成擴增。00106NASBA是從RNA或者DNA目標(biāo)物擴增RNA的轉(zhuǎn)錄依賴性擴增方法。NASBA是用于在單一混合物在一個溫度中連續(xù)擴增核酸的方法。例如，對于RNA擴增，使用禽類成髓細(xì)胞瘤病毒(AMV)反轉(zhuǎn)錄酶、核糖核酸酶H和T7RAN聚合酶?？梢砸勒誋eim等，M/c/ez'c爿cz'Aie&,26(9):2250-2251(1998)進(jìn)行該方法。簡單而言，NASBA反應(yīng)混合物包含兩種特定引物、dNTP、NTP、6.4U的AMV反轉(zhuǎn)錄酶、0.08U的大腸桿菌核糖核酸酶H和32U的T7RNA聚合酶。在20微升總體積中，于41'C，進(jìn)行擴增120分鐘。00107在相關(guān)的方法中，自動維持序列擴增(3SR)反應(yīng)、等溫擴增目標(biāo)DNA或者RAN的序列在體外使用三種酶活性反轉(zhuǎn)錄酶、DNA依賴性RNA聚合酶和大腸桿菌核糖核酸酶H。通過使用人類免疫缺陷病毒(HIV)-1反轉(zhuǎn)錄酶代替禽成髓細(xì)胞瘤病毒(AMV)反轉(zhuǎn)錄酶，可將這種方法從3-酶系統(tǒng)改良為2-酶系統(tǒng)，從而使得能用T7RNA聚合酶擴增，而無需大腸桿菌核糖核酸酶H。在2-酶的3SR中，與3-酶3SR進(jìn)行比較，得到較純形式的擴增RNA(Gebinoga&OehlenschlagerJowrna/。/￡!'0由》^",235:256-261,1996)。00100SDA是一種等溫核酸擴增方法。包含限制位點的引物與模板退火。擴增引物隨后與5'鄰近序列退火(形成切口)，和在固定溫度開始擴增。新合成的DNA鏈通過限制性酶形成切口，聚合酶擴增再次開始，從而替代新合成的鏈。可以依照Walker等，/W^S，89:392-6(1992)進(jìn)行SDA。簡單而言，SDA反應(yīng)混合物包含四種SDA引物、dGTP、dCTP、TTP、dATP、150U的HincII和5U的核酸外切酶缺陷的大腸桿菌DNA聚合酶I的大片段(外-Klenow聚合酶)。在加入酶之前，樣品混合物加熱到95X:、4分鐘，使得目標(biāo)DNA變性。在加入兩種酶之后，在50微升的總體積中于37。C，進(jìn)行擴增120分鐘。隨后，在95。C加熱2分鐘，終止反應(yīng)。0101反向DNA擴增(BDA)是這樣的方法，其中聚合酶從單個引物-結(jié)合位點延伸，隨后圍繞另一條鏈產(chǎn)生環(huán)，從而最終回到DNA上的原始引發(fā)點。BDA因其使用單一引物而不同于PCR。這種方法涉及核酸內(nèi)切酶消化核酸樣品DNA、產(chǎn)生具有黏性末端的離散DNA片段、將片段連接到"銜接(adapter)"多核苷酸(由可連接端和間隔序列所分開的第一及第二自互補序列組成)，由此形成連接的雙鏈體。連接的雙鏈體變性形成模板，寡核苷酸引物在感興趣的目標(biāo)或者標(biāo)記序列之內(nèi)的特異序列處與該模板退火。用DNA聚合酶延伸引物以形成雙鏈體產(chǎn)物，接著變性雙鏈體產(chǎn)物。隨后進(jìn)行多個循環(huán)后的退火、延伸和變性以獲得期望程度的擴增(美國專利號5,470,724)。0102QP復(fù)制系統(tǒng)使用RNA作為模板。QP復(fù)制酶合成大腸桿菌噬菌體Q|3的單鏈RNA基因組。當(dāng)RNA通過Qp復(fù)制酶進(jìn)行復(fù)制時，剪切RNA和在感興趣的核酸中連接，從而復(fù)制該序列(Kramer&Lizardi7>e"ds所o"c/mo/.19919(2):53-8，1991)。0103多種擴增酶在現(xiàn)有技術(shù)中是眾所周知的，包括例如DNA聚合酶、RNA聚合酶、反轉(zhuǎn)錄酶、QP復(fù)制酶、耐熱DNA和RNA聚合酶。因為這些和其它的擴增反應(yīng)由,催化，在單步驟試驗中，核酸釋放試劑和檢測試劑不應(yīng)該是擴增酶的潛在抑制劑，如果最終檢測是基于擴增的話。適用于本方法的擴增方法包括例如鏈置換擴增、滾環(huán)擴增、引物延伸預(yù)擴增或者簡并寡核苷酸PCR(DOP)。這些擴增方法在現(xiàn)有技術(shù)中是眾所周知的并且每一個在下文被簡單描述。0104優(yōu)選地，使用PCR擴增位于感興趣的串聯(lián)重復(fù)區(qū)段側(cè)翼的目標(biāo)或者標(biāo)記序列。在這個方法中，與目標(biāo)或者標(biāo)記序列的相反鏈退火的兩個或者多個寡核苷酸引物反復(fù)與它們的互補序列退火，通過DNA聚合酶延伸(例如AmpliTaqGold聚合酶)、和熱變性，從而導(dǎo)致目標(biāo)核酸序列的指數(shù)擴增。循環(huán)參數(shù)可以變化，這取決于將被延伸的核酸長度。本領(lǐng)域人員能夠設(shè)計和制備適合于擴增目標(biāo)或者標(biāo)記序列的引物。用于本發(fā)明的擴增引物的長度取決于數(shù)個因素，包括核苷酸序列同一性和這些核酸在體外核酸擴增期間的雜交或者使用時的溫度。必須要考慮確定特定序列同一性的擴增引物的優(yōu)選長度，這是本領(lǐng)域技術(shù)人員是眾所周知的，并包括在這里所描述的考慮。例如，短的核酸或者寡核苷酸的長度可能關(guān)系到其雜交特異性或者選擇性。0105在一些實施方式中，擴增可包括標(biāo)記的引物，由此允許檢測引物的擴增產(chǎn)物。在特定實施方式中，擴增可包括多樣性的標(biāo)記引物，優(yōu)選地這樣的引物被可區(qū)別地標(biāo)記，允許同時檢測多種擴增產(chǎn)物。0106可以設(shè)計寡核苷酸引物，其為大約IO到大約IOO個核苷酸長度并與標(biāo)記序列雜交。寡核苷酸引物的長度優(yōu)選12到70個核苷酸，更優(yōu)選15到60個核苷酸長度；和最優(yōu)選地15到25個核酸長度。0107在一個實施方式中，引物對被設(shè)計為在對由Ahil所斷裂的核酸進(jìn)行大小分離之后，擴增FMR1基因的串聯(lián)重復(fù)區(qū)域上游的標(biāo)記序列。用于設(shè)計雜交引物的FMR1串聯(lián)重復(fù)區(qū)域的上游的示例性標(biāo)記序列在圖2中描述(SEQIDNO:1)。正向引物能夠雜交到SEQIDNO:1的核苷酸1到45之間，更優(yōu)選地位于22到39之間，而反向引物能夠雜交到SEQIDNO:1的位于70到115之間，更優(yōu)選地在97到113之間。一個例子是使用引物對擴增對應(yīng)于串聯(lián)重復(fù)區(qū)域上游的大約95bp的側(cè)翼序列區(qū)域；更具體地使用正向引物SEQIDNO:4和反向引物SEQIDNO:5去擴增標(biāo)記序列的93bp區(qū)域。因此，可以用作擴增引物的優(yōu)選的寡核苷酸包括SEQIDNO:4(5'-GGTGGAGGGCCGCCTCTG-3')禾口SEQIDNO:5(5'-AGCGGCGCCTCCGTCACC-3')。其它優(yōu)選的寡核苷酸引物長度大約15-100核苷酸和包括SEQIDNO:4或SEQIDNO:5。還有其它優(yōu)選的寡核苷酸引物包括與15-100核苷酸序列的互補序列雜交的寡核苷酸序列，包括SEQIDNO:4或SEQIDNO:5。這樣的寡核苷酸可以是基本純化的。表2.用于擴增位于FMR1側(cè)翼的標(biāo)記序列的引物<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>0108在另外一個實施方式中，引物對被設(shè)計為在對由Blpl和Mlyl所斷裂的核酸進(jìn)行大小分離之后，擴增位于FMR1基因的串聯(lián)重復(fù)區(qū)域側(cè)翼的標(biāo)記序列。在一個例子中，引物對被用于擴增串聯(lián)重復(fù)區(qū)域下游的側(cè)翼序列的區(qū)域；更特定使用正向引物FXCEF2(SEQIDNO:6)和反向引物FXCER2(SEQIDNO:7)來擴增標(biāo)記序列的86bp區(qū)域。因此，可以用作為擴增引物的優(yōu)選寡核苷酸包括SEQIDNO:6(5'陽GATGGAGGAGCTGGTGGTGG-3')禾nSEQIDNO:7(5'-GGAAGGGCGAAGATGGGG-3')。其它優(yōu)選的寡核苷酸引物長度大約15-100個核苷酸和包括SEQIDNO:6或SEQIDNO:7。還有其它更優(yōu)選的寡核苷酸引物包括雜交到15-100個核苷酸序列的互補序列的寡核苷酸序列，包括SEQIDNO:6或SEQIDNO:7。這樣的寡核苷酸可以是基本上純化的。0109在另外一個實施方式中，引物對被設(shè)計為在對由Sphl和Bmtl所斷裂的核酸進(jìn)行大小分離之后，擴增位于FMR1基因串聯(lián)重復(fù)區(qū)域側(cè)翼的標(biāo)記序列。在一個例子中，引物對被用于擴增串聯(lián)重復(fù)區(qū)域下游側(cè)翼序列區(qū)域；更特異地使用正向引物FXCEF3(SEQIDNO:8)和反向引物FXCER3(SEQIDNO:9)來擴增標(biāo)記序列的86bp區(qū)域。因此，可用作擴增引物的優(yōu)選寡核苷酸包括SEQIDNO:8(5'-CGTGACGTGGTTTCAGTGTTTACA-3')禾QSEQIDNO:9(5'-GGAAGTGAAACCGAAACGGAG-3')。其它優(yōu)選的寡核苷酸引物長度大約15-100個核苷酸并包括SEQIDNO:8或者SEQIDNO:9。還有其它優(yōu)選的寡核苷酸引物包括雜交到15-100個核苷酸序列的互補序列的寡核苷酸序列，包括SEQIDNO:8或SEQIDNO:9。這樣的寡核苷酸可以是基本上純化的。0110試驗對照可以被用于試驗中以檢測攜帶者和受脆性X綜合癥影響的個體?？梢允褂糜糜谡；蛘咭吧虵MR1基因(例如小于55個串聯(lián)重復(fù))、前突變(55-200個串聯(lián)重復(fù))和全突變(大于200個串聯(lián)重復(fù))的陽性對照。0111額外的對照可以被包括于試驗中以確定基因組DNA的限制性酶消化是否完成。一種評價由特定限制性酶進(jìn)行消化的完成情況的方法，是通過使用跨越用于消化的限制性酶位點的測試引物對來確定消化的DNA是否能夠支持PCR擴增。因此，如果核酸已被限制性酶完全消化，則應(yīng)該沒有來自于測試引物對的擴增，然而，如果消化不完全，留下一些完整的核酸，則測試引物對應(yīng)該擴增目標(biāo)。在消化之后任何時間，包括在標(biāo)記序列的擴增期間，能夠進(jìn)行該測試消化PCR擴增。表3.示例性對照引物<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>0112在從攜帶者和受到脆性X綜合癥影響的個體中區(qū)別正常個體的試驗的特定實施方式中，基因組DNA用^w/消化。因此，通過擴增包含力"/識別位點的區(qū)域能夠確定v4/"/消化基因組DNA的完成。在這樣對照的一個例子中，使用一對引物爿/"/尸和爿/"http://(各自為8￡010>^0:IO禾卩SEQIDNO:ll)來擴增包含Ww/識別位點的核酸片段的103bp目標(biāo)區(qū)段。當(dāng)A"/消化不完全時，將僅出現(xiàn)這種區(qū)段的擴增。在這種試驗的另一種優(yōu)選實施方式中，用BlpI和MlyI來消化基因組DNA。因此，通過擴增包含BlpI或MlyI的識別位點的區(qū)域，能夠確定用Blpl和MlyI消化基因組DNA的完成。在這樣對照的一個例子中，使用一對引物BlpIF和BlpIR(各自為SEQIDNO:12和SEQIDNO:13)來擴增包含Blpl識別位點的核酸的目標(biāo)區(qū)段的138bp區(qū)段。當(dāng)BlpI消化不完全時，將僅出現(xiàn)這種區(qū)段的擴增。0113為驗證合適大小分離的片段化DNA，在試驗中可包含額外的對照。使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的序列分析工具，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠確定通過使用特定限制性酶得到的片段的大小分布。本領(lǐng)域技術(shù)人員隨后能夠識別具有對應(yīng)于特定部分的大小范圍的大小的特定對照片段。因此通過檢測在針對其大小的適當(dāng)部分中的對照片段，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠驗證片段化DNA的合適的大小分離。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在一個部分中使用單一的對照片段，在每個部分中與正常對異常串聯(lián)重復(fù)的確定相關(guān)的對照，或者在所有部分中的對照部分。0114在從具有前突變FMR1等位基因的那些個體和具有全突變FMR1等位基因的那些個體中區(qū)別具有正常FMR1等位基因的個體的試驗的特定實施方式中，也包括對照擴增來確定包含最大串聯(lián)重復(fù)的片段(通過用Alul消化獲得)是否收集入大小合適的部分中。在這樣的對照的一個例子中，當(dāng)存在于部分中時，一對引物L(fēng)argeF和LargeR(各自為SEQIDNO:14禾卩SEQIDNO:15)將擴增USP41基因的8，479bp^"/片段的121bp區(qū)段。在試驗的另一個實施方式中，在其中用Blpl和Mlyl消化基因組DNA，包括對照以檢測合適大小分離的675bp、905bp和7,031bp的片段。在一個例子中，當(dāng)存在于部分中時，一對引物FIIctrllF和FIIctrllR(分別為SEQIDNO:16和SEQIDNO:17)將擴增CFTR基因的675bp5//7//M/;;/片段的102bp區(qū)段。在另一個例子中，當(dāng)存在于部分中時，一對引物FIIIctrl3F和FIIIctrl3R(分別為SEQIDNO:18和SEQIDNO:19)將擴增CFTR基因的905bp祝^/M^y/片段的113bp區(qū)段。在另外一個實例中，當(dāng)存在于部分中時，一對引物L(fēng)gctrlF和LgctrlR((分別為SEQIDNO:20禾卩SEQIDNO:21)將擴增來自于染色體21(21:20912766-20919795)的7,031bpBlpl/Mlyl片段的156bp區(qū)段。薪記務(wù)纖淑0115在檢測之前可擴增標(biāo)記序列或者可在大小分離之后不進(jìn)行擴增步驟而直接檢測標(biāo)記序列。在一些實施方式中，擴增標(biāo)記序列和通過電泳檢測生成的擴增子，優(yōu)選毛細(xì)管電泳。在優(yōu)選實施方式中，用標(biāo)記的引物來擴增標(biāo)記序列，這樣生成的擴增子被可檢測地標(biāo)記。在優(yōu)選的實施方式中，引物對被熒光標(biāo)記，然而，可以依照以下針對寡核苷酸探針?biāo)枋龅姆椒?，?biāo)記引物。0116在優(yōu)選的實施方式中，直接檢測片段化的DNA，而不進(jìn)行擴增步驟，使用與串聯(lián)重復(fù)上游或者下游的標(biāo)記序列的兩個分開的區(qū)段雜交的兩種可區(qū)別地標(biāo)記的核酸探針。在一個雜交復(fù)合體中同時檢測兩種標(biāo)記表示標(biāo)記序列的存在(和因此表示連接的串聯(lián)重復(fù)的存在)。在一個實施方式中，使用Trilogy2020Analyzer36(USGenomicsWoburn,MA)完成檢測。在這個實施方式中，帶有可區(qū)別熒光標(biāo)記的兩種探針與大小分離的DNA片段接觸。生成的雜交復(fù)合體混合物被引入毛細(xì)管，在其中它暴露于多種不同波長的激光。探針的熒光標(biāo)記被激發(fā)，這樣光子被發(fā)射和檢測。同時檢測到不同顏色的熒光標(biāo)記表示目標(biāo)區(qū)域的存在。0117寡核苷酸探針可以通過本領(lǐng)域已知的方法可檢測地標(biāo)記。有用的標(biāo)記包括例如熒光染料H^WnCy5、Cy3、異硫氰酸熒光素(FITC)、羅丹明、鑭磷(lanthamidephosphors)、得克薩斯紅)、32P、35S、3H、14C、125I禾Q131I、電子致密試劑(例如金)、例如在ELISA中通常使用的酶(例如辣根過氧化物酶、卩-半乳糖苷酶、熒光素酶、堿性磷酸酶)、色度標(biāo)記(例如膠體金)、磁標(biāo)記(例如DynabeadS)、生物素、地高辛，或半抗原和可得到抗血清或者單克隆抗體的蛋白質(zhì)。其它標(biāo)記包括能夠分別與相應(yīng)受體或者寡核苷酸補體形成復(fù)合物的配體或者寡核苷酸。標(biāo)記能夠直接整合入待檢測的核酸，或者其能夠連接到與待檢測的核酸雜交或者結(jié)合的探針(例如寡核苷酸)或者抗體。0118在一個優(yōu)選的實施方式中，可檢測的標(biāo)記是熒光團。在這里所使用的術(shù)語"熒光團"指這樣的分子，其在特定波長(激發(fā)頻率)吸收光，并且作為響應(yīng)隨后發(fā)射不同的，通常更長的波長(發(fā)射頻率)的光。合適的熒光分子包括現(xiàn)有技術(shù)中已知的以下熒光團4-乙酰氨基-4'-異硫氰酸芪-2,2'-二磺酸；吖啶和衍生物吖啶異硫氰酸吖啶AlexaFluor350、AlexaFluor488、AlexaFluor546、AlexaFluor555、AlexaFluor568、AlexaFluor594、AlexaFluor647(分子探針)5-(2'-氨乙基)氨基萘-l-磺酸(ENANS)4-氨基-N-[3-乙烯砜基)苯基]萘二甲酰亞胺-3,5二磺酸酯(LuciferYellowVS)N-(4-苯胺基-l-萘基)馬來酰亞胺鄰氨基苯甲酰胺BlackHoleQuencher(BHQTM))染料((biosearchTechnologies)BODIPYR-6G、BOPIPY530/550、BODIPYFL亮黃顏料(BrilliantYellow)香豆素和衍生物7_氨基_4-甲基香豆素(AMC，香豆素120)7-氨基-4-三氟甲基香豆素(香豆素151)Cy2、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5焰紅染料(cyanosine)4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)5'，5"-二溴代焦掊酸-磺酞(BromopyrogallolRed)7-二乙氨基-3-(4'-異硫氰酸苯基)-4-甲基香豆素二亞乙基三胺五乙酸酯4,4'-二異硫氰酸二氫-芪-2,2'-二磺酸4,4'-二異硫氰酸芪-2，2'-二磺酸5-[二甲氨基]萘基-l-磺酰氯(DNS，丹酰氯)4-(4'-二甲氨基苯基偶氮基)苯甲酸(DABCYL)4-二甲氨基苯基偶氮苯基-4'-異硫氰酸酯(DABITC)Eclipse(EpochBiosciencesInc.)曙紅及衍生物曙紅曙紅異硫氰酸酯赤蘚紅及衍生物赤蘚紅B赤蘚紅異硫氰酸酯溴化乙錠熒光素及衍生物5-羧基熒光素(FAM)5-(4，6-二氯三嗪-2-基)氨基熒光素(DTAF)2',7'-二甲氧基-4'5'-二氯-6-羧基熒光素(JOE)熒光素?zé)晒馑禺惲蚯杷狨?FITC)六氯-6-羧基熒光素(HEX)QFITC(XRITC)四氯熒光素(TET)熒光胺IR144IR1446孔雀綠異硫氰酸酯4-甲基傘形酮鄰甲酚酞硝基酪氨酸副品紅堿酚紅B-藻紅蛋白、R-藻紅蛋白鄰酞二醛OregonGreen碘化丙啶芘及衍生物芘芘丁酸酯琥珀酰亞胺1-芘丁酸酯QSY7、QSY9、QSY21、QSY⑧35(分子探針)活性紅4(Cibacror^亮紅3B-A)羅丹明及衍生物6-羧基-X-羅丹明(ROX)6-羧基羅丹明(R6G)麗絲胺羅丹明B磺酰氯羅丹明(Rhod)羅丹明B羅丹明123羅丹明綠羅丹明X異硫氰酸酯硫氰酸胺B硫氰酸胺101硫氰酸胺101的磺酰氯衍生物(德州紅)N,N,N',N'-四甲基-6-羧基羅丹明(TAMRA)四甲基羅丹明四甲基羅丹明異硫氰酸酯(TRITC)核黃素玫紅酸鋱螯合物衍生物。0119也可使用其它的熒光核苷酸類似物，參見Jameson,Meth.Enzymol.278:363-390,1997;Zhu,Nucl.AcidsRes.22:3418-3422,1994。美國專利5,652,099和6,268,132也描述了用于結(jié)合進(jìn)入核酸的核苷酸類似物，例如DNA和/或RNA，或者寡核苷酸，經(jīng)過酶或者化學(xué)合成以產(chǎn)生熒光寡核苷酸。美國專利5,135,717描述了用作熒光標(biāo)記的酞菁染料和四苯并疊氮卟啉(tetrabenztriazaporphyrin)試劑。0120可檢測的標(biāo)記能夠合并入、連接或者結(jié)合到核酸。標(biāo)記可以通過各種長度的間隔臂連接，以減少潛在的位阻或者對其它有用或期望性質(zhì)的影響。參見，例如，Mansfield,Mol.Cell.Probes9:145-156,1995。0121通過共價或者非共價的方法能夠?qū)⒖蓹z測標(biāo)記合并入核酸，例如通過轉(zhuǎn)錄，如通過使用Klenow聚合酶的隨機引物標(biāo)記、或者切口移位、或者擴增、39或者在現(xiàn)有技術(shù)中已知等同方法。例如，核苷酸堿基與可檢測部分結(jié)合，如熒光染料，例如073@或者Cy5，然后在核酸合成或者擴增期間合并入基因組核酸。當(dāng)使用與未標(biāo)記dCTP混合的Cy3②-或者Cy5-dCTP偶聯(lián)物合成時，由此能夠標(biāo)記核酸。0122在標(biāo)記的前體核苷酸存在時，通過使用PCR或者切口移位能夠標(biāo)記核酸探針，例如，可以使用通過偶聯(lián)烯丙胺-dUTP到熒光染料或者半抗原(如生物素或者地高辛)的琥珀酰亞胺酯衍生物所合成的修飾的核苷酸；這種方法使得能定制最常見的熒光核苷酸，參見，Henegariu,Nat.Biotechnol.18:345-348,2000。0123核酸可以通過現(xiàn)有技術(shù)中已知的非共價方法標(biāo)記。例如，KreatechBiotechnology'sUniversalLinkageSystem(ULS⑧)提供了一種非酶標(biāo)記技術(shù)，其中通過結(jié)合到鳥嘌呤的N7位置，鉑基團與DNA、RNA或者核苷酸形成了配位鍵。通過結(jié)合到包含氮和硫的氨基酸側(cè)鏈，這種技術(shù)也可用于標(biāo)記蛋白。參見，例如美國專利號5,580,990;5,714,327和5,985,566;和歐洲專利號0539466。0124通過雜交可以確定探針與位于串聯(lián)重復(fù)區(qū)域側(cè)翼的標(biāo)記序列的結(jié)合，這在現(xiàn)有技術(shù)中是眾所周知的。可以實時或者非實時地檢測雜交。0125用于實時PCR的一種常用方法使用熒光探針例如TaqMai^探針、分子信標(biāo)和蝎(scorpions)。在TaqMai^和分子信標(biāo)技術(shù)中所應(yīng)用的探針基于熒光淬滅原理并涉及供體熒光團和淬滅部分。0126在這里所使用的術(shù)語"供體熒光團"意思是當(dāng)緊鄰淬滅劑部分時，供給或者轉(zhuǎn)移發(fā)射能量到淬滅劑的熒光團。由于將能量供給淬滅劑部分，供體熒光團自身將以特定的發(fā)射頻率發(fā)出較少的光，這會在缺乏緊密安置的淬滅劑部分時發(fā)生。0127在這里所使用的術(shù)語"淬滅劑部分"意思是這樣的分子，其當(dāng)緊鄰供體熒光團時，吸收通過供體所產(chǎn)生的發(fā)射能量和以熱的形式消散能量或者發(fā)射波長比供體的發(fā)射波長長的光。在后者的情況下，據(jù)認(rèn)為淬滅劑是受體熒光團。淬滅部分能夠經(jīng)近端(也就是，碰撞的)淬滅或者通過Foster或者熒光共振能量轉(zhuǎn)移("FRET")來起作用。通過FRET進(jìn)行的淬滅在TaqMai^探針中廣泛地使用，而近端淬滅在分子信標(biāo)和蝎類探針中使用。0128在近端淬滅(也叫做"接觸"或者"碰撞"淬滅)中，供體緊密接近淬滅劑部分，這樣供體能量轉(zhuǎn)移到淬滅劑，其以熱的形式消散能量而不是熒光發(fā)射。在FRET淬滅中，供體熒光團轉(zhuǎn)移它的能量到淬滅劑，在較高波長作為熒光來釋放能量。近端淬滅要求供體和淬滅劑部分的位置非常接近，而FRET淬滅——其也是距離相關(guān)的，在較大的距離發(fā)生(一般1-10納米，能量轉(zhuǎn)移取決于R—6，其中R是供體和受體之間的距離)。因此，當(dāng)涉及FRET淬滅時，淬滅部分是具有與供體發(fā)射頻率光譜重疊的激發(fā)頻率光譜的受體熒光團。當(dāng)通過應(yīng)用FRET淬滅時，試驗可以檢測到供體熒光團熒光的增加和受體熒光團發(fā)射的減少，其中供體熒光團熒光的增加由于供體和淬滅劑(受體熒光團)之間增加的距離所致，受體熒光團發(fā)射的減少由于供體和淬滅劑(受體熒光團)之間增加的距離所致。0129TaqMan⑧探針(Heid等，1996)使用Taq聚合酶的熒光5'核酸外切酶活性來測量在DNA樣品中目標(biāo)或者標(biāo)記序列的量。TaqMar^探針是通常在或者接近5'堿基包含供體熒光團以及通常在或者接近3'堿基包含淬滅部分的寡核苷酸。淬滅劑部分可以是染料例如TAMRA，或者可以是非熒光分子例如4-(4'-二甲氨基苯基偶氮基)苯甲酸(DABCYL)。參見Tyagi等，NatureBiotechnology16:49-53(1998)。當(dāng)照射時，通過FRET而不是發(fā)熒光，激發(fā)的熒光供體轉(zhuǎn)移能量到附近的淬滅部分。因此，供體和淬滅劑的緊密近端阻止供體熒光的發(fā)射，而探針是完整的。0130TaqMar^探針被設(shè)計成與PCR產(chǎn)物的內(nèi)部區(qū)域退火。當(dāng)聚合酶復(fù)制其上結(jié)合TaqMai^探針的模板時，它的5'核酸外切酶活性剪切探針。這結(jié)束了淬滅劑活性(沒有FRET)并且供體熒光團開始發(fā)射熒光，熒光在每個循環(huán)中與探針剪切速度成比例地增加。通過監(jiān)測報道染料熒光的增加來檢測PCR產(chǎn)物的積聚(注意，引物沒有被標(biāo)記)。如果淬滅劑是受體熒光團，那么可以通過監(jiān)測受體熒光團的熒光減少檢測PCR產(chǎn)物的積聚。0131TaqMai^試驗使用通用的熱循環(huán)參數(shù)和PCR反應(yīng)條件。因為僅如果探針雜交到目標(biāo)才出現(xiàn)剪切，所以所檢測的熒光源于特定的擴增。雜交和剪切的過程不妨礙產(chǎn)物的指數(shù)積聚。一個對于熒光探針的特定要求是在5'端沒有G。與報告染料鄰近的'G'淬滅報告熒光，即使在剪切之后。0132其它實時檢測的探針雜交的方法能夠用于檢測位于串聯(lián)重復(fù)區(qū)域側(cè)翼的目標(biāo)或者標(biāo)記序列的擴增。例如，可以使用商業(yè)上可獲得的MGBEclipseTM探針(EpochBiosciences),其不依賴于探針降解。MGBEclipseTM探針通過雜交觸發(fā)的熒光機理來工作。MGBEclipseTM探針具有Eclipse的黑淬滅齊l」(DarkQuencher)和位于探針5'-端的MGB。熒光團位于探針的3'-端。當(dāng)探針在溶液中和不雜交時，三維構(gòu)造使得淬滅劑緊密接近熒光團，并且熒光被淬滅。然而，當(dāng)探針與目標(biāo)或者標(biāo)記序列退火時，探針被展開，淬滅劑從熒光團中移去，和能夠檢測產(chǎn)生的熒光。0133合適的供體熒光團包括6-羧基熒光素(FAM)、四氯-6-羧基熒光素(TET)、2，-氯-7，-苯基-1,4-二氯-6-羧基熒光素(VIC)等。合適的淬滅劑包括四-甲基羧基羅丹明(TAMRA)、4-(4-二甲氨基苯基偶氮基)苯甲酸("DABCYL"或者DABCYL類似物)等。四甲基羅丹明(TMR)或者5-羧基羅丹明6G(RHD)可作為供體熒光團與作為淬滅劑的DABCYL組合?？梢允褂妹總€包含不同供體和淬滅劑組合的多個可檢測標(biāo)記，進(jìn)行多重TaqMan試驗。用于實時檢測擴增序列的探針可以冷凍存放(-10。C到-30°C)如100微升庫存量。可以從AppliedBioSystems(4316032)獲得TaqMan探針。0134在一個優(yōu)選的實施方式中，可以使用與合適的擴增/分析儀如ABI41Prism7900HT序列檢測系統(tǒng)組合的TaqMar^探針，進(jìn)行實時PCR。ABIPRISM7900HT序列檢測系統(tǒng)是一種檢測和定量核酸序列的高通量實時PCR系統(tǒng)。簡單而言，在PCR擴增反應(yīng)中包含對擴增的目標(biāo)或者標(biāo)記序列特異的TaqMai^探針。這些探針在5'端包含報告染料，和在3'端包含淬滅劑染料。將與不同目標(biāo)或者標(biāo)記序列雜交的探針與不同的熒光報告染料結(jié)合。在PCR期間，熒光標(biāo)記的探針特異結(jié)合它們各自的目標(biāo)或者標(biāo)記序列；Taq聚合酶的5'核酸酶活性從探針剪切報告染料并且產(chǎn)生熒光信號。只有目標(biāo)或者標(biāo)記序列與探針互補和在PCR期間擴增，才檢測到熒光信號增加。探針和目標(biāo)之間的錯配大大降低探針雜交和剪切的效率。ABIPrism7700HT或7900HT序列檢測系統(tǒng)測量在PCR熱循環(huán)期間的熒光增加，從而提供了PCR產(chǎn)物積聚的"實時"檢測。0135在ABIPrism7700HT或7卯0HT序列檢測儀上的實時檢測監(jiān)測熒光和計算在每個PCR循環(huán)期間的Rn。閾循環(huán)或者Ct值是熒光相交閾值時的循環(huán)。通過序列檢測系統(tǒng)軟件或者手工確定閾值。0136可以設(shè)計長度在大約IO至大約IOO個核苷酸之間并與擴增區(qū)域雜交的寡核苷酸探針。寡核苷酸探針優(yōu)選地是在12到70個核苷酸之間；更優(yōu)選地是長度在15-60個核苷酸；和最優(yōu)選地在長度上15-25個核苷酸。探針可以是標(biāo)記的。在一個例子中，當(dāng)分別用SEQIDNO:4禾QSEQIDN0:5中所說明的正向和反向引物擴增標(biāo)記序列時，可以使用SEQIDNO:26作為寡核苷酸探針來檢測與FMR1基因的串聯(lián)重復(fù)區(qū)域連接的標(biāo)記序列(在通過Alul的基因組片段化之后)?？梢允褂肧EQIDNO:27來檢測由AluIFtaq和AluIRtaq(各自為SEQIDNO:22和23)所擴增的Alul對照片段擴增子，和可以使用SEQIDNO:28來檢測由LargeFtaq和LargeRtaq(各自為SEQIDNOs:24禾卩25)所擴增的8，479bpAM對照片段擴增子。表4.Taqman探針<table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>0137可以使用標(biāo)準(zhǔn)凝膠電泳方法檢測擴增片段。例如，在一個優(yōu)選的實施方式中，擴增部分在瓊脂糖凝膠上分離和通過使用現(xiàn)有技術(shù)中已知的方法用溴化乙錠染色，以檢測擴增片段。遞過尸Cif潛浙敏泳遂療Xv/、橫，f^/"gj0138在某些實施方式中，涉及擴增串聯(lián)重復(fù)區(qū)域的方法被用于測量區(qū)域的大小。在一些實施方式中，使用這種方法作為在使用第二種方法按大小排列串聯(lián)重復(fù)區(qū)域之前的篩選。在優(yōu)選的實施方式中，優(yōu)選地通過PCR進(jìn)行擴增。在這個方法中，擴增了整個的串聯(lián)重復(fù)區(qū)域。使用電泳按大小排列產(chǎn)生的擴增子，優(yōu)選地是毛細(xì)管電泳。0139在一個例子中，在擴增反應(yīng)中使用正向引物FX-5F(SEQIDNO:29;5'GCTCAgCTCCgTTTCggTTTCACTTCCGGT3，)及反向引物FX-3F(SEQIDNO:30;5，-AGCCCCGCACTTCCACCACCAGCTCCTCCA-3，)來擴增FMR1基因的串聯(lián)重復(fù)區(qū)域。優(yōu)選地，這對引物當(dāng)中一個引物被標(biāo)記，優(yōu)選地標(biāo)記是熒光標(biāo)記?？赏ㄟ^電泳，優(yōu)選毛細(xì)管電泳，檢測和按大小排列擴增產(chǎn)物。可選地，使用Southern印跡檢測和按大小排列擴增產(chǎn)物。#虔力/、與正紫或,應(yīng)歸f虔微吝游被絲0140在其中檢測串聯(lián)重復(fù)區(qū)域上游或者下游的標(biāo)記序列的部分對應(yīng)于包含串聯(lián)重復(fù)的片段的大小。這種相關(guān)性使能夠估計串聯(lián)重復(fù)區(qū)域的數(shù)量，和因此估計個體是否正?；蛘邤y帶具有串聯(lián)重復(fù)區(qū)域擴增的等位基因。0141在一些實施方式中，受與在基因中的串聯(lián)重復(fù)區(qū)域突變相關(guān)疾病所侵襲的個體能夠與那些正常個體區(qū)分開來。斷裂來自個體的核酸樣品，產(chǎn)生核酸片段，在其中基因的串聯(lián)重復(fù)區(qū)段與片段中標(biāo)記序列連接。在其中包含串聯(lián)重復(fù)區(qū)段的片段會依照串聯(lián)重復(fù)區(qū)段中的重復(fù)數(shù)量定位在部分中的條件下，核酸片段依照大小分離成部分，并通過檢測標(biāo)記序列鑒定那些包含區(qū)段的部分。選擇部分，以便一個部分對應(yīng)于具有正常重復(fù)數(shù)量的串聯(lián)重復(fù)區(qū)域(也就是正常的等位基因)和另外一個部分對應(yīng)于異常數(shù)量的重復(fù)(也就是突變的等位基因)。如果僅是前一部分是陽性的，那么個體是正常的；如果僅是后一部分是陽性的，那么個體可能是攜帶者或者可能受疾病侵襲。在兩個部分中都是陽性結(jié)果則表明是雜合子和個體可能或者可能不受侵襲，這取決于疾病是否是顯性的或者隱性的。如果疾病是顯性的，雜合子將受到侵襲；如果疾病是隱性的，雜合子將不會受到侵襲，但是會是疾病攜帶者。0142在其它實施方式中，能夠從那些在基因的串聯(lián)重復(fù)區(qū)域中具有前突變或者全突變的個體中區(qū)別具有正常等位基因的個體。來自個體的核酸樣品被斷裂產(chǎn)生核酸片段，其中在片段中基因的串聯(lián)重復(fù)區(qū)段與標(biāo)記序列連接。在其中包含串聯(lián)重復(fù)區(qū)段的片段會依照串聯(lián)重復(fù)區(qū)段中的重復(fù)數(shù)量定位在部分中的條件下，核酸片段依照大小分離成部分，并通過檢測標(biāo)記序列鑒定那些包含區(qū)段的部分。選擇部分，以便第一部分對應(yīng)于具有正常重復(fù)數(shù)量的串聯(lián)重復(fù)區(qū)域(也就是正常等位基因)，第二部分對應(yīng)于具有前突變中重復(fù)數(shù)量的串聯(lián)重復(fù)區(qū)域(也就是前突變等位基因)，第三部分對應(yīng)于具有全突變中重復(fù)數(shù)量的串聯(lián)重復(fù)區(qū)域(也就是全突變等位基因)。一般而言，如果僅第一部分是陽性的，那么個體是正常的；43如果僅第二部分是陽性的，那么個體攜帶前突變；如果僅第三部分是陽性的，那么個體是受疾病侵襲的。在一個以上部分中的陽性結(jié)果表明是雜合子。雜合子可能是攜帶者或者受侵襲的個體，這取決于所涉及的基因和疾病的顯性。0143在一些實施方式中，具有與脆性X綜合癥相關(guān)的突變的個體(也就是在FMR1基因中全突變)能夠與具有前突變或者正常等位基因的個體區(qū)分開來。來自個體的核酸樣品被斷裂產(chǎn)生核酸片段，其中在片段中FMR1基因的串聯(lián)重復(fù)區(qū)段與標(biāo)記序列連接。在其中包含串聯(lián)重復(fù)區(qū)段的片段會依照串聯(lián)重復(fù)區(qū)段中的重復(fù)數(shù)量定位在部分中的條件下，片段依照大小分離成部分，并通過檢測標(biāo)記序列鑒定那些包含區(qū)段的部分。選擇部分，以便第一部分對應(yīng)于具有正常重復(fù)數(shù)量的串聯(lián)重復(fù)區(qū)域(也就是正常等位基因)，第二部分對應(yīng)于具有前突變中重復(fù)數(shù)量的串聯(lián)重復(fù)區(qū)域(也就是前突變等位基因)，第三部分對應(yīng)于具有全突變中重復(fù)數(shù)量的串聯(lián)重復(fù)區(qū)域(也就是全突變等位基因)。在優(yōu)選的實施方式中，選擇部分，以便第一部分對應(yīng)于具有小于55個重復(fù)的串聯(lián)重復(fù)區(qū)域，第二部分對應(yīng)于具有55-200個重復(fù)的串聯(lián)重復(fù)區(qū)域，以及第三部分對應(yīng)于具有大于200個重復(fù)的串聯(lián)重復(fù)區(qū)域。因此，如果第一部分是陽性的(也就是在這個部分中檢測到標(biāo)記序列)，它表明串聯(lián)重復(fù)區(qū)域包含小于55個重復(fù)(也就是正常等位基因)；如果第二部分是陽性的，它表明串聯(lián)重復(fù)區(qū)域包含55-200個重復(fù)(也就是前突變等位基因)；如果第三部分是陽性的，它表明串聯(lián)重復(fù)區(qū)域包含大于200個重復(fù)(也就是全突變等位基因)。在男性個體中，依照這個結(jié)果，可以指定顯型或者疾病狀況。男性一般只擁有一個X染色體(包含F(xiàn)MR1基因的染色體)，因此，如果第一部分是陽性的，個體是正常；如果第二部分是陽性的，個體是前突變攜帶者；如果第三部分是陽性的，個體受脆性X綜合癥侵襲。女性有兩個X染色體，因此，擁有兩個正常等位基因的女性是正常的和擁有前突變等位基因或者全突變基因的女性是攜帶者。對于正常等位基因和全突變等位基因的雜合的女性可能受或者可能不受侵襲,這取決于其它因素如基因的甲基化狀況。0144在區(qū)分具有FMR1基因的正常串聯(lián)重復(fù)區(qū)域的個體與那些具有前突變或者全突變的個體的試驗的某些實施方式中，AluI所斷裂的基因組DNA的兩個部分通過毛細(xì)管電泳分離和通過自動部分收集器來收集，一個是在211-400bp之間，一個是在401bp-9kb之間。具有6-68個重復(fù)的Alul片段將存在于下面部分中，因而正常等位基因和那些具有小前突變(也就是55-68個重復(fù))的等位基因?qū)⒎蛛x入這個部分。通過擴增串聯(lián)重復(fù)區(qū)域和通過電泳進(jìn)行大小分離還可以進(jìn)一步區(qū)分正常等位基因和小前突變。包含69-200個重復(fù)范圍的前突變和包含201-2000以上重復(fù)的全突變將存在于上面部分。因此，如果下面部分是陽性的(也就是在這個部分中檢測到標(biāo)記序列)，它表明存在包含6-68個重復(fù)的CGG串聯(lián)重復(fù)區(qū)域。如果上面部分是陽性的，它表明存在包含68-2000以上個重復(fù)的CGG串聯(lián)重復(fù)區(qū)域。兩個部分的陽性結(jié)果表明是雜合子，其中一個等位基因是正常的，另外一個等位基因包含前突變或者全突變。0145在確定FMR1基因串聯(lián)重復(fù)區(qū)域大小的試驗的另外實施方式中，用BlpI和dMlyl組合所斷裂的DNA被分離成對應(yīng)于大小大約小于或者等于603bp(第一/最低部分)、604國840bp(第二部分)、841-顧bp(第三部分)和贈-9kb(第四/最高部分)的四個部分。來自于包含正常FMR1基因樣品的片段(也就是小于55個串聯(lián)重復(fù))和那些包含具有56-62個串聯(lián)重復(fù)的前突變的片段將分離入第一/最低部分。通過擴增串聯(lián)重復(fù)區(qū)域和用電泳進(jìn)行大小分離可以進(jìn)一步區(qū)別正常等位基因和小前突變。來自于包含小前突變(也就是63-140個串聯(lián)重復(fù))的FMR1基因的片段分離入第二個部分，而來自于包含大前突變(也就是141-200個串聯(lián)重復(fù))和具有201-220個串聯(lián)重復(fù)的全突變的FMR1基因的片段將分離入第三部分，和而具有大于220個串聯(lián)重復(fù)的大前突變將分離入第四/最高部分。使用例如標(biāo)準(zhǔn)Southern印跡方法，能夠區(qū)別141-200個重復(fù)的大前突變和201-220個重復(fù)的全突變。0146在另一實施方式中，使用毛細(xì)管電泳將Ahil消化的基因組DNA根據(jù)大小分級成多個部分。使用預(yù)先設(shè)置的每個部分大約30秒的部分時間窗(fractiontimewindow)完成自動部分收集，在200bp開始和在9kb結(jié)束。大約收集了16個部分。對于串聯(lián)重復(fù)區(qū)域上游或下游標(biāo)記序列的檢測是陽性的這個或者這些部分對應(yīng)于大小范圍，并因此能夠估計串聯(lián)重復(fù)的數(shù)量。性細(xì)定0147在一些實施方式中，確定性別的核酸試驗與確定FMR1基因串聯(lián)重復(fù)區(qū)域的長度的試驗結(jié)合在一起。在優(yōu)選的實施方式中，核酸試驗包括DNA擴增。這樣的DNA擴增試驗可針對擴增Y染色體特有的序列(例如SRY基因座(Sinclair等,Nature346:240244,1990))。在這種情況下，擴增僅在Y染色體存在時出現(xiàn)，表明了核酸來自于男性。沒有擴增則表明核酸來自于女性。然而，在這些試驗中，優(yōu)選地包括陽性對照來檢測假陰性。0148在其它例子中，可以以某些基因為目標(biāo)進(jìn)行擴增，這些基因出現(xiàn)在X染色體和Y染色體上，但取決于基因出現(xiàn)在X染色體還是Y染色體上具有不同的長度。在這個例子中，包含在X和Y染色體之間具有不同的基因區(qū)段的區(qū)域?qū)⒈粩U增。這導(dǎo)致具有不同大小的擴增產(chǎn)物，對應(yīng)于核酸模板(也就是X染色體或Y染色體)。因此，來自于男性的核酸擴增會產(chǎn)丄兩個大小的擴增子，而來自于女性的樣品會產(chǎn)生僅有一個大小的擴增子。0149在一個優(yōu)選的實施方式中，把牙釉蛋白基因作為用于性別確定目標(biāo)。已經(jīng)使用在牙釉蛋白基因的X和Y同系物之間的序列差異來區(qū)別男性和女性。例如，己經(jīng)使用跨越X染色體上牙釉蛋白基因的6對堿基(bp)缺失的兩組引物來分別產(chǎn)生X/Y產(chǎn)物的106/112bp或212/218bp的片段(Sullivan等，BioTechniques4515:636-9,1993)。在優(yōu)選的實施方式中，使用下列引物擴增牙釉蛋白基因的區(qū)域AMLF2弓1物，5'-AGTACTTGACCACCTCCTGATCTACAAGG3，(SEQIDNO:40)和AMLR2弓|物，5'-TTTTTAACAGTTTACTTGCTGATAAAACTCAYCCC3，(SEQIDNO:41)。這個引物對產(chǎn)生對應(yīng)于X染色體同系物的134bp擴增子和對應(yīng)于Y染色體的140bp擴增子。這樣，通過擴增來自于男性的核酸會產(chǎn)生兩個擴增子，而通過擴增來自于女性的核酸僅產(chǎn)生一個擴增子。0150以下實施例用于舉例說明本發(fā)明。這些實施例絕非意欲限制本發(fā)明的范圍。實施例1限制性酶消化0151這個實施例描述了檢測FMR1基因串聯(lián)重復(fù)區(qū)域擴張(擴增)的方法。用限制性核酸內(nèi)切酶AM消化基因組DNA試樣和對照DNA樣品。每次消化使用1.0微克試樣或?qū)φ誅NA。純化和稀釋基因組DNA到50納克/微升的濃度。用于消化的反應(yīng)混合物依照下表制備。<table>tableseeoriginaldocumentpage46</column></row><table>015210微升的Alul反應(yīng)混合物加入到每個DNA樣品中。樣品通過渦旋混合，和用微量離心機離心以及隨后在37'C溫育過夜。實施例2消化的DNA的大小分離0153A.二部分方法0154如在例子1中所描述的限制性酶所消化DNA依照大小分離成各部分。lkb的DNA序列梯和消化的試樣基因組DNA樣品被放置入96孔板中。使用以反極性分離模式進(jìn)行的BeckmanCoulterP/ACEMDQ系列毛細(xì)管電泳系統(tǒng)，96孔板進(jìn)行自動取樣和自動分級。首先以6kv/60sec將序列梯注射入毛細(xì)管，隨后以200V/cm運行以確定正確的大小排列截止時間(cuttofftime)。使用對應(yīng)于211-400bp(較低部分或下部分)和401bp-9kb(較高部分或上部分)的預(yù)先設(shè)置分級時間窗，實現(xiàn)級分自動收集。通過紫外檢測在柱中監(jiān)測分離情況。獲得數(shù)據(jù)并通過P/ACEMDQ32Karat軟件包來評價。0155使用與lkb的DNA序列梯相同條件來分級消化的樣品。根據(jù)大小排列截止時間一一如使用lkb梯對每個大小范圍所確定的，收集較低部分(211-396bp)和較高部分(396bp-9kb)。使用P/ACEMDQ自動收集器收集部分并存放在每個孔中30微升O.lxTBE緩沖液的96孔板中。0156A.16部分方法0157使用每個部分30秒的預(yù)先設(shè)置分級時間窗，完成自動部分收集，大約從200bps開始和在9kbs結(jié)束。通過紫外檢測在柱中監(jiān)測分離。獲得數(shù)據(jù)并通過P/ACEMDQ32Karat軟件包來評價。0158lkb的DNA序列梯和消化的基因組DNA樣品被放置入96孔板中。在具有冷卻控制的BeckmanCoulterP/ACEMDQ儀器上，96孔板進(jìn)行自動取樣和自動分級。首先以6kv/60sec通過電子動力(electronkinetic)方式將序列梯注射入毛細(xì)管，隨后以200V/cm運行來確定正確的大小分離窗口(優(yōu)選地200bps-9Kbs)。0159根據(jù)與lkb的DNA序列梯運行條件相同的條件，分級消化的樣品。使用P/ACEMDQ的自動收集器收集總共16個部分并存放在每個孔中5微升雙蒸水(dH20)的96孔板中。實施例3PCR擴增和檢測具有串聯(lián)重復(fù)的片段0160在檢測特征是FMR1基因串聯(lián)重復(fù)區(qū)域擴張的突變的試驗中，根據(jù)描述的方法制備工作用PCR主混合物。0161A.PCR擴增(非TagMan)0162如表6中所示，制備用于擴增片段和用于PCR產(chǎn)物大小分離分析的PCR主混合物。表6.制備用于CCG5，側(cè)翼序列的PCR引物(非TaqMan)主混合物<table>tableseeoriginaldocumentpage47</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table>0163在使用之前，PCR引物主混合物以1.5毫升等分試樣在-2(TC儲存。當(dāng)準(zhǔn)備使用的時候，如在圖7中所示制備PCR反應(yīng)物。表7.用于CCG5，側(cè)翼序列的最終PCR擴增混合物<table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table>0164最終擴增混合物用MicrosealA膜緊緊地密封在板中。將板短暫地渦旋(大約5秒)和在離心機板中以2,000-6,000g旋轉(zhuǎn)沉淀(spindown)大約30秒(在SorvallT6000D離心機中以1,600rpm的轉(zhuǎn)速)。將板轉(zhuǎn)移到ABI9700熱循環(huán)儀。0165用于擴增的熱循環(huán)儀條件如下步驟1:95°C，15分鐘。步驟2:95°C，60秒。步驟3:64°C，60秒。步驟4:72°C，30秒。步驟5:重復(fù)步驟2-4，34次。步驟6:72°C，5分鐘。步驟7:4'C，無限期。0166PCR產(chǎn)物隨后裝載在ABI3100遺傳分析儀上用于檢測。0167B.TaaManPCR擴增0168如表8中所示，制備用于檢測CCG5，側(cè)翼序列的TaqManPCR主混合物。表8.制備用于CCG5'側(cè)翼序列的TaqManPCR主混合物<table>tableseeoriginaldocumentpage50</column></row><table>0169在使用之前，TaqManPCR主混合物以1.5毫升等分試樣在-2(TC儲存。當(dāng)準(zhǔn)備使用的時候，如在圖9中所示，制備PCR反應(yīng)物。表9.TaqManPCR主混合物<table>tableseeoriginaldocumentpage50</column></row><table>總數(shù)45.01350288038704950017045微升的TaqManPCR主混合物加到包含大小分離的DNA的部分的96孔板的每個孔中。孔用MicrosealA膜緊緊地密封。將板短暫地渦旋(大約5秒)和在離心機板中以2,000-6,000g旋轉(zhuǎn)沉淀(spindown)大約30秒(在SorvallT6000D離心機中以1,600rpm的轉(zhuǎn)速)。將板轉(zhuǎn)移到ABI7700(或者7900HT)序列檢測儀。0171用于TaqMan的熱循環(huán)儀條件如下步驟1:95'C，15分鐘。步驟2:95°C，60秒。步驟3:64°C，60秒。步驟4:72°C，30秒。步驟5:重復(fù)步驟2-4，40次。步驟6:72°C，5分鐘。步驟7:4'C，無限期。實施例4通過凝膠電泳檢測擴增的部分0172使用凝膠電泳來鑒定如在實施例3A中描述所制備的PCR擴增片段的大小。6微升的6xFEB(聚蔗糖，EDTA溴酚藍(lán)加樣染料)加到6微升的PCR產(chǎn)物中并將生成的混合物加樣到凝膠中。50bp的DNA序列梯加樣到凝膠的第一和最后一個孔中。使樣品在0.8%瓊脂糖中以200V電泳1.5小時。用紫外拍照記錄(photodocumentation)儀器(AlphaInnotechImageAnalysisSystem)照下完整的凝膠。實施例5檢測DM-1基因串聯(lián)重復(fù)區(qū)域的擴增突變0173在檢測特征是DM-1基因串聯(lián)重復(fù)區(qū)域擴增的突變的試驗中，用限制性內(nèi)切核酸酶Alul消化基因組DNA試樣。每個消化使用大約1.0微克的試樣基因組DNA。依照酶供應(yīng)商的操作方案制備用于消化的反應(yīng)混合物?；旌蠘悠罚⒃?7'C溫育完成消化。0174限制性酶消化的DNA使用毛細(xì)管電泳依照大小分離并收集到了兩個部分，如此第一部分(250-360bp)對應(yīng)于正常重復(fù)范圍(例如5-37個重復(fù))和第二部分(400bp-9kb)對應(yīng)于擴增的重復(fù)突變(例如大于50個突變)。首先將lkb的DNA序列梯注射入毛細(xì)管中以確定正確的大小排列截止時間。使用對應(yīng)于較低部分和較高部分的預(yù)先設(shè)置分級時間窗實現(xiàn)自動化部分收集。通過紫外檢測在柱上監(jiān)控分離。隨后使用與lkb的DNA序列梯相同的條件對消化的樣品進(jìn)行分級。根據(jù)使用lkb序列梯對每個大小范圍所確定的大小排列截止時間，收集較低部分和較高部分。0175使用TaqMan實時PCR方法分析每個部分是否存在包含DM-1串聯(lián)重復(fù)區(qū)域的片段。在這個方法中，使用正向引物(例如，5'陽CCATTTCTTTCTTTCGGCCA-3';SEQIDNO:31)禾卩反向弓|物(如5'-AGGCCTGCAGTTTGCCC-3';SEQIDNO:32)擴增DM-1基因的3'-非翻譯區(qū)的區(qū)段。用TaqMan標(biāo)記的探針5'-TGAGGCCCTGACGTGG-3'(SEQIDNO:33)檢測擴增片段。0176擴增區(qū)段僅在較低部分中的存在表示對于正常DM-1等位基因純合的個體。擴增區(qū)段僅在較高部分中的存在表示對于突變體等位基因純合的個體。擴增區(qū)段在兩個部分中都存在表示雜合體。實施例6檢測FRDA基因串聯(lián)重復(fù)區(qū)域的擴增突變0177]在檢測特征是FRDA基因串聯(lián)重復(fù)區(qū)域擴增的突變的試驗中，用限制性內(nèi)切核酸酶Alul和Rsal消化基因組DNA試樣。每個消化使用大約1.0微克的測試基因組DNA。依照酶供應(yīng)商的操作方案制備用于消化的反應(yīng)混合物?；旌蠘悠?，并在37'C溫育以完成消化。0178限制性酶消化的DNA使用毛細(xì)管電泳依照大小分離，并收集到了兩個部分，如此第一部分(300-405bp)對應(yīng)于正常重復(fù)范圍(例如7-34個重復(fù))和第二部分(600bp-9kb)對應(yīng)于擴增的重復(fù)突變(例如大于100個突變)。首先將lkb的DNA序列梯注射入毛細(xì)管中以確定正確的大小排列截止時間。使用對應(yīng)于較低部分和較高部分的預(yù)先設(shè)置分級時間窗實現(xiàn)自動化部分收集。通過紫外檢測在柱上監(jiān)控分離。隨后使用與lkb的DNA序列梯相同的條件對消化的樣品進(jìn)行分級。根據(jù)使用lkb序列梯對每個大小范圍所確定的大小排列截止時間，收集較低部分和較高部分。0179使用TaqMan實時PCR方法分析每個部分是否存在包含F(xiàn)RDA串聯(lián)重復(fù)區(qū)域的片段。在這個方法中，使用正向引物(例如，5'-AGGCCTAGGAAGGTGGATCAC-3';SEQIDNO:34)和反向引物(如5'陽ACCATGTTGGCCAGGTTAGTCT-3';SEQIDNO:35)擴增FRDA基因第一內(nèi)含子區(qū)域的區(qū)段。用TaqMan標(biāo)記的探針5'-TGAGGTCCGGAGTTC-3'(SEQIDNO:36)檢測擴增片段。0180擴增區(qū)段僅在較低部分中的存在表示對于正常FRDA等位基因純合的個體。擴增區(qū)段僅在較高部分中的存在表示對于突變體等位基因純合的個體。擴增區(qū)段在兩個部分中都存在表示雜合體。實施例7檢測FMR1基因串聯(lián)重復(fù)區(qū)域的擴增突變0181在這個實施列中，通過用AluI斷裂、大小分級，接著用BstNI進(jìn)行第二次限制性酶消化，檢測FMR1基因串聯(lián)重復(fù)區(qū)域的擴增突變。因此，如在以上實施例1中所描述，用限制性內(nèi)切核酸酶AluI消化基因組DNA試樣。使用毛細(xì)管電泳將消化的DNA分級為四個部分。部分1包含具有0-60個CCG串聯(lián)重復(fù)的核酸，部分2包含60-200個CCG串聯(lián)重復(fù)，部分3包含200-2000個CCG串聯(lián)重復(fù)，部分4包含2000個以上CCG串聯(lián)重復(fù)。分級之后，四個部分中每個部分的等分試樣用第二種限制性內(nèi)切核酸酶BstNI消化，BstNI從CCG串聯(lián)重復(fù)區(qū)域中剪切標(biāo)記。第二次核酸分級之后，四個部分中的每一個部分進(jìn)行PCR，如在實施例3B中所描述的(也就是TaqManPCR擴增)。0182A.第二次限制性酶消化來自受侵襲個體的樣品0183受侵襲樣品用或不用第二次限制性酶消化進(jìn)行檢測，其中標(biāo)記序列從串聯(lián)重復(fù)區(qū)域剪切。進(jìn)行第二次消化的樣品同沒有經(jīng)歷第二次酶消化的樣品相比較具有更強的信號(也就是較高的相對熒光單元(RFU)信號)。每個樣品重復(fù)一次進(jìn)行；數(shù)據(jù)在以下表9中示出。這些數(shù)據(jù)表明，當(dāng)標(biāo)記序列從串聯(lián)重復(fù)區(qū)域剪切時，存在增加的標(biāo)記序列擴增。表IO.進(jìn)行(有"2。")和不進(jìn)行(無"2。")第二次限制性酶消化的受侵襲樣品的相對熒光單元(RFU)信號<table>tableseeoriginaldocumentpage53</column></row><table>0184B.第二次限制性酶消化來自正常個體的樣品0185正常樣品用或不用第二次限制性酶消化進(jìn)行檢測，其中標(biāo)記序列從串聯(lián)重復(fù)區(qū)域剪切。具有較少起始材料的經(jīng)歷第二次消化的樣品同具有較多起始材料的沒有經(jīng)歷第二次酶消化的樣品相比較具有相當(dāng)?shù)幕蛘吒鼜姷男盘?也就是較高的相對熒光單元(RFU)信號)。數(shù)據(jù)在以下表10中示出。這些數(shù)據(jù)表明，當(dāng)標(biāo)記序列從串聯(lián)重復(fù)區(qū)域剪切時，存在增加的標(biāo)記序列擴增。表ll.進(jìn)行(有"2。")和不進(jìn)行(無"2。")第二次限制性酶消化的正常樣的相對熒光單元(RFU)信號樣品號部分l部分2部分3部分414028無2。304400014028有20435600013616無2°270100013616有2°239600013488無2。139900013488有2°225800013524無2。薩00013524有2。1074000實施例8檢測FMR1基因串聯(lián)重復(fù)區(qū)域的擴增突變0186在這個實施列中，通過用Blpl和Mlyl斷裂、大小分級，接著用Bmtl進(jìn)行第二次限制性酶消化，檢測FMR1基因串聯(lián)重復(fù)區(qū)域的擴增突變。0187用限制性內(nèi)切核酸酶BlpI和MlyI消化基因組DNA試樣，每個消化使用大約1.5微克的測試或者對照DNA(純化和稀釋到50納克/微升的濃度)。依照下表制備用于消化的反應(yīng)混合物。表12.Blpl/Mlyl反應(yīng)混合物<table>tableseeoriginaldocumentpage54</column></row><table>0188通過渦旋混合樣品，在微量離心機中離心，隨后在37。C溫育16小時和在4r儲存。消化的DNA隨后使用毛細(xì)管電泳分級成為四個部分，使用P/ACEMDQ毛細(xì)管電泳系統(tǒng)。部分1(小于603bp)包含具有6-62個CCG串聯(lián)重復(fù)的核酸，部分2(603-840bp)包含63-140個CCG串聯(lián)重復(fù)，部分3(841-翻bp)包含141-220個CCG串聯(lián)重復(fù)，部分4(1079bp-9kb)包含221-2000個以上CCG串聯(lián)重復(fù)。分級之后，用從CGG串聯(lián)重復(fù)區(qū)域剪切標(biāo)記的限制性內(nèi)切核酸酶BmtI消化四個部分中每個的等分試樣。Bmtl反應(yīng)混合物依照下表制備。表13.Bmtl反應(yīng)混合物<table>tableseeoriginaldocumentpage55</column></row><table>0189消化反應(yīng)混合物在37'C溫育16小時并儲存在4'C。0190第二次核酸消化之后，四個部分中每一個部分可以使用如下引物進(jìn)行PCR:<table>tableseeoriginaldocumentpage56</column></row><table>*、**2.5微升lOxPCR緩沖液包含15mMMgCl2、50mMKC1?？偡磻?yīng)的MgCl2是2.25mM，KCl是105mM。0192通過加入0.5微升HotStarTaq(Qiagen)到每個單獨的PCR反應(yīng)中，接著加入5微升消化分級的DNA，制備最終PCR擴增混合物。最終擴增混合物用MicrosealA膜緊緊地密封在板中。將板短暫地渦旋混合(大約5秒)和在離心機板中以2,000-6,000g旋轉(zhuǎn)沉淀大約30秒(在SorvallT6000D離心機中以1，600rpm的轉(zhuǎn)速)。將板轉(zhuǎn)移到ABI9700熱循環(huán)儀。0193用于擴增的熱循環(huán)儀條件如下步驟l:95°C，15分鐘。步驟2:95°C，30秒。步驟3:55°C，30秒。步驟4:72°C，60秒。步驟5:重復(fù)步驟2-4，33次。步驟6:72°C，10分鐘。步驟7:4'C,無限期。01942微升PCR產(chǎn)物與10.5微升的去離子甲酰胺(AppliedBiosystems)以及ROX350大小標(biāo)準(zhǔn)(AppliedBiosystems)組合，在95。C加熱5分鐘，接著在冰上5分鐘。隨后樣品裝載到ABI3100遺傳分析儀上用于檢測。實施例9檢測FMR1基因串聯(lián)重復(fù)區(qū)域的擴增突變0195在這個實施列中，通過用Sphl和Bmtl斷裂、大小分級，接著用BstNI進(jìn)行第二次限制性酶消化，檢測FMR1基因串聯(lián)重復(fù)區(qū)域的擴增突變。用限制性內(nèi)切核酸酶Sphl和Bmtl消化基因組DNA試樣，每個消化使用大約1.5微克的測試或者對照DNA(純化和稀釋到50納克/微升的濃度)。依照下表制備用于消化的反應(yīng)混合物。表16.Sphl/Bmtl反應(yīng)試劑<table>tableseeoriginaldocumentpage57</column></row><table>0196樣品通過渦旋混合，在微量離心機離心，隨后在37'C溫育過夜。消化的DNA隨后使用毛細(xì)管電泳分級成為四個部分。部分1包含具有6-62個串聯(lián)重復(fù)的核酸，部分2包含63-163個串聯(lián)重復(fù)，部分3包含164-196個串聯(lián)重復(fù)和部分4包含大于196個串聯(lián)重復(fù)。分級之后，用第二限制性內(nèi)切核酸酶BmtI消化四個部分中每個的等分試樣，Bmtl從CGG串聯(lián)重復(fù)區(qū)域剪切標(biāo)記。第二次核酸分級之后，四個部分中的每一個部分使用下列引物進(jìn)行PCR:表17.用于PCR擴增Sphl/Bmtl片段的引物引物名稱序列號引物序列FXCEF385'-CGTGACGTGGTTTCAGTGTTTACA-3'FXCER395'-GGAAGTGAAACCGAAACGGAG-3'0197用下列條件進(jìn)行PCR:步驟1:95°C，15分鐘。步驟2:95°C，30秒。步驟3:55°C，30秒。步驟4:72°C，60秒。步驟5:重復(fù)步驟2-4，33次。步驟6:72°C，IO分鐘。步驟7:4'C，無限期。0198將PCR產(chǎn)物裝載到ABI3100遺傳分析儀上用于檢測。實施例10鑒定在FMR1試驗中使用的對照片段0199來自不同于FMR1的基因組的區(qū)域的^/w/片段被鑒定用作FMRl試驗中的對照片段，所述v4/w/片段大于6000個堿基，包含三核苷酸重復(fù)和具有高GC含量和/或CpG島。如下鑒定該片段。使用EMBOSS限制程序(Rice等,"EMBOSS:TheEuropeanMolecularBiologyOpenSoftwareSuite."TrendsinGenetics16(6):276-7(2000))在人基因中鑒定所有Alul位點，導(dǎo)致了通過AluI消化所生產(chǎn)的預(yù)計11.5百萬個片段。從這些片段中，使用TACG程序(Mangalam，HJ."tacg-agrepforDNA."BMCBioinformatics3:8(2002))鑒定20個長度大于6000個堿基的片段。通過使用EMBOSSExtmctS叫得到這20個片段的序列。在這20個片段中，一個對應(yīng)于22號染色體上USP41基因的區(qū)域(也就是染色體22:19033185-19041663)的片段發(fā)現(xiàn)具有大的三核苷酸重復(fù)區(qū)域。使用EMBOSSgeecee分析GC含量，和使用EMBOSScpgseek和newcpgreport進(jìn)行CpG島分析。實施例11使用PCR確定FMR1串聯(lián)重復(fù)區(qū)域的大小0200為了確定FMR1區(qū)域的串聯(lián)重復(fù)區(qū)域大小，在熒光標(biāo)記引物(例如6-FAM)存在時，通過聚合酶鏈反應(yīng)擴增該區(qū)域，并通過毛細(xì)管電泳確定產(chǎn)生的標(biāo)記擴增子的大小。使用引物對共擴增第二個三核苷酸重復(fù)(在X-連接雄激素受體基因中的CAG)并共分析以提供內(nèi)部擴增對照，所述引物對中的一個引物是熒光標(biāo)記的。0201這樣，使用FX-5F(SEQIDN0:29)作為正向引物和FX-3F(SEQIDNO:30)作為反向引物擴增FMR1基因的串聯(lián)重復(fù)區(qū)域，和使用AR-5F(SEQIDNO:37)作為正向引物和AR-R2(SEQIDNO:38)作為反向引物擴增X-連接雄激素受體基因的三核苷酸重復(fù)，如在下表中說明的。表18.用于PCR擴增的引物<table>tableseeoriginaldocumentpage59</column></row><table>0203PCR主混合物等分分為1,100微升的等分試樣，加入來自于Qiagen的5.5微升Taq聚合酶(5UL)和來自于Stratagene的22微升PfuDNA聚合酶(2.5U/nL)，以制備聚合酶/主混合物溶液。0204在TE緩沖液中基因組DNA稀釋到20納克/微升。樣品加熱到93-97。C，持續(xù)4-6分鐘，并在冰上冷卻。加入10微升聚合酶/主混合物溶液到2微升(40納克)稀釋的基因組DNA。0205一旦熱循環(huán)儀達(dá)到85°C+/-2°C，樣品轉(zhuǎn)移到ABI9700熱循環(huán)儀。用于擴增的PCR條件如下步驟l:95°C，6分鐘。步驟2:95°C，1分鐘。步驟3:60°C，2分鐘。步驟4:75°C，5分鐘。步驟5:重復(fù)步驟2-4，31次。步驟6:75°C，13分鐘。步驟7:4'C，無限期。0206隨后將PCR產(chǎn)物裝載到ABI3100遺傳分析儀用于檢測。實施例12脆性X綜合癥攜帶者篩查0207在這個實施列中，通過兩步法篩查來自男性和女性個體的樣品的脆性X綜合癥攜帶狀況，其中，樣品起初用多重PCR篩査以確定性別和FMR1區(qū)域的大小，并依據(jù)多重PCR結(jié)果進(jìn)行進(jìn)一步的大小排列分析。確定為女性和對于兩個正常等位基因雜合的所有樣品可以不進(jìn)行進(jìn)一步的分析。確定為女性和在FMR1基因座明顯為純合(所有分析的24%)的所有樣品進(jìn)行進(jìn)一步的分析，以確定FMR1串聯(lián)重復(fù)區(qū)域的大小。鑒定為男性和對于正常FMR1等位基因為半合子的樣品不進(jìn)行進(jìn)一步的分析，而鑒定為男性、但顯示沒有FMR1擴增的樣品進(jìn)行進(jìn)一步的分析，以確定FMR1串聯(lián)重復(fù)區(qū)域的大小。0208依照生產(chǎn)廠家的全血DNA提取操作方案，使用XtractorGeneTM(CorbettLifeScience,Mortlake,NSW,Australia)從收集于EDTA抗凝采血真空管中的150微升全血中提取全基因組DNA。在IOO微升緩沖液中進(jìn)行最終洗脫，以一致地產(chǎn)生50-100納克/微升的濃度。0209隨后通過多重PCR分析基因組DNA樣品，多重PCR由以下擴增組成使用FX-5F弓I物(FAM標(biāo)記的；SEQIDNO:29)和FX-3F弓|物(SEQIDNO:30)擴增FMR1串聯(lián)重復(fù)的區(qū)域；使用AMLF2引物5,-AGTACTTGACCACCTCCTGATCTACAAGG3，(FAM-標(biāo)記的；SEQIDNO:40)禾口AMLR2弓l物5，-TTTTTAACAGTTTACTTGCTGATAAAACTCAYCCC3，(SEQIDNO:41)擴增牙釉蛋白基因的區(qū)域以確定性別；和使用AR-5F(HEX-標(biāo)記的SEQIDNO:37)禾BAR-R2引物(SEQIDNO:38)擴增X-連接雄激素受體的三核苷酸重復(fù)作為陽性內(nèi)部對照。0210制備用于多重PCR的PCR主混合物，由3.3的每個上述引物、lxQiagen標(biāo)準(zhǔn)PCR緩沖液、0.4mMMgCl2、2%DMSO、lxQiagenQ溶液、0,2mMdNTP、和0.25單位QiagenTaqDNA聚合酶(Qiagen,Valencia,CA)、0.5單位PfuDNA聚合酶(Strategene,LaJolla,CA)組成。1微升分離的DNA溶液加到10微升的多重引物混合物中至最終體積為11微升。PCR條件如下95°C6分鐘；接著32個循環(huán)95°Cl分鐘，60°C2分鐘，75°C5分鐘；和最后擴增的產(chǎn)物在75'C延伸15分鐘。在ABI3100自動DNA測序儀(AppliedBiosystems,FosterCity,CA,USA)上分析PCR片段，和用ABIGeneScanTMV3.7和GenotyperTMV3.7軟件(AppliedBiosystems)完成片段分析。牙釉蛋白引物對產(chǎn)生了對應(yīng)于X染色體同系物的134bp擴增子和對應(yīng)于Y染色體的140bp擴增子。0211為了進(jìn)一步分析確定FMR1基因串聯(lián)重復(fù)區(qū)域的大小，用限制性酶Blpl和Mlyl(NewEnglandBioLabs,Ipswich,MA,USA)在37。C消化基因組DNA16小時。在溫育之后，限制性片段加壓注射或者真空注射到攜帶紫外/可見檢測器的P/ACEMDQ毛細(xì)管電泳系統(tǒng)(BeckmanCoulter,Fullerton，CA,USA)上。以100V/cm的電場強度和在lxTBE緩沖液(90mMTris-硼酸，2mMEDTA，pH8.3)中，分離未變性的雙鏈DNA。毛細(xì)管溫度維持在25°C。四個部分被收集入O.lxTBE緩沖液(9mMTris-硼酸，0.2mMEDTA，pH10)。由在400bps到600bps之間的分子量組成的起始部分；包含600bps到800bps之間分子量的第二部分；包含800bps到1,000bps分子量的第三部分；和包含1,000bps到8,000bps分子量的第四部分。因為兩個酶中任一個在FMR1中不能剪切將導(dǎo)致區(qū)段太大而不被收集在任一個部分中，所以沒有使用針對不完全限制性消化的內(nèi)對照。0212為了從串聯(lián)重復(fù)區(qū)域剪切標(biāo)記序列，依照廠家的方案，用限制性酶Bmtl(NewEnglandBioLabs)消化所有收集的部分。5微升的每個消化部分轉(zhuǎn)被移到在每個孔中包含20微升PCR混合物的96孔板中。該PCR混合物由以下組成lxQiagen標(biāo)準(zhǔn)PCR緩沖液、1.5mMMgCl2、5%DMSO、100mMKC1、0.2mMdNTP、2.5單位HotStartTaqDNA聚合酶(QiagenInc)禾卩1微升的每種以下引物FXCEF2引物(FAM-標(biāo)記的；SEQIDNO:6)、FXCER2引物(SEQIDNO:7)，以及0.01(iM的每種以下引物BlpIF引物(HEX標(biāo)記的，SEQIDNO:12)、BlpIR引物(SEQIDNO:13)、lgctrlF引物(FAM標(biāo)記的，SEQIDNO:20)、lgctrlR引物(SEQIDNO:21)、F2ctrllF引物(HEX標(biāo)記，SEQIDNO:16)、F2ctrllR引物(SEQIDNO:17)、F3ctrl3F引物(FAM標(biāo)記的，SEQIDNO:18)、F3ctrl3R引物(SEQIDNO:19)。PCR條件如下95°C15分鐘，接著33個循環(huán)95°C30秒，55°C30秒，72'C1分鐘；和最后在72'C延伸擴增產(chǎn)物10分鐘。然后在3100Prism遺傳分析儀(AppliedBiosystems)上使用GenescanTM-350ROX大小標(biāo)準(zhǔn)(AppliedBiosystems)分析最終PCR產(chǎn)物。0213提交已經(jīng)剝?nèi)ヨb定數(shù)據(jù)的1,662份血液樣品以便通過上述方法進(jìn)行分析。在這該樣品群中，具有995個女性和557個男性。在女性個體中，6個被確定是前突變攜帶者(0.6%)和7個被確定是全突變攜帶者(0.7%)。通過標(biāo)準(zhǔn)的PCR/Southem印跡分析驗證，所有13個攜帶者被正確識別，使得靈敏度為100%。通過標(biāo)準(zhǔn)的PCR/Southern印跡試驗被認(rèn)為非攜帶者的單個患者通過上述方法似乎是前突變攜帶者。該患者可能是前突變等位基因的嵌合體或者這表示是假陽性結(jié)果。由于樣品的匿名性質(zhì)，因此不可能去再檢查Southern印跡數(shù)據(jù)或重新測試樣品。假設(shè)這個結(jié)果是假陽性的，上述方法的特異性是99.5%。在557個男性中，有1個前突變攜帶者和5個受侵襲的個體。通過Southern印跡分析確認(rèn)了這些測定。這樣，上述方法檢測到所有男性前突變攜帶者和受侵襲的男性，在551個未受侵襲的男性中沒有假陽性結(jié)果。0214除非另有規(guī)定，在這里所使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員通常所理解的相同含義。在這里所提供的核苷酸序列是以5'到3'的方向顯示。0215在這里舉例描述的發(fā)明可在沒有任何要素或多種要素、限制或多種限制的情況下合適地實施，而不是在這里特定地公開。因此，例如，術(shù)語"包含"、"包括"、"含有"等應(yīng)該被廣泛而沒有限制地閱讀。另外，在這里所應(yīng)用的術(shù)語和詞組被用作為描述性和非限制性術(shù)語，并且在使用這樣的術(shù)語和詞組時沒有意欲排除所示出和描述的特征的任何等同特征或其部分，而是認(rèn)為在本發(fā)明所要求保護(hù)的范圍之內(nèi)各種修改是可能的。0126因此，應(yīng)當(dāng)理解雖然本發(fā)明通過優(yōu)選的實施方式和任選的特征進(jìn)行了特定地公開，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以采取包含在本文公開內(nèi)容中的對本發(fā)明的修改、改進(jìn)和變化，和應(yīng)當(dāng)理解這樣的修改、改進(jìn)和變化被認(rèn)為包含在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。這里所提供的材料、方法和實施列代表優(yōu)選的實施方式，是示范性的并且不意欲限制本發(fā)明的范圍。0217本發(fā)明在這里被廣泛地和一般性地描述。落入一般公開范圍內(nèi)的每個較窄種類和亞類組也形成了本發(fā)明的一部分。這包括本發(fā)明的一般性描述，其條件或者負(fù)限定是從該種類中除去任何主題，而不管除去的材料是否在這里被特定描述。0218另外，如果本發(fā)明的特征或方面根據(jù)馬庫什組進(jìn)行描述，本領(lǐng)域技術(shù)人員會認(rèn)識到，本發(fā)明也由此根據(jù)馬庫什組的任何單個成員或者成員的亞組進(jìn)行描述。0219在這里所提到的所有出版物、專利申請、專利和其它參考文獻(xiàn)在此通過參考以全部特別引入，引入的程度如同每篇參考文獻(xiàn)通過參考單獨引入。在沖突情況下，包含定義的本說明書將處于支配地位。0220在所附的權(quán)利要求書中闡述了其它實施方式。權(quán)利要求1.一種用于在核酸樣品中確定核酸區(qū)段大小的方法，包含分離核酸片段，所述片段從包含核酸的樣品中制備，其中所述片段包括一些包含所述區(qū)段和標(biāo)記序列的片段，依照大小分離成部分，這在包含所述區(qū)段的片段將依照所述區(qū)段大小定位于所述部分的條件下進(jìn)行，和通過檢測所述標(biāo)記序列來鑒定包含所述區(qū)段的那些部分，其中，所述區(qū)段的大小通過在其中其被鑒定的部分來確定。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述核酸區(qū)段難以通過聚合酶鏈反應(yīng)擴增。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述核酸區(qū)段富含鳥嘌呤和胞嘧啶堿基。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述片段使用一種或多種限制性內(nèi)切核酸酶制備。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中選擇所述部分以將包含具有正常大小的區(qū)段的片段與包含具有異常大小的區(qū)段的片段分開。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述分離是分離為選自2-16的許多組分。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述分離通過電泳進(jìn)行。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述電泳是毛細(xì)管電泳。9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述分離通過層析進(jìn)行。10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，還包括在所述分離步驟之后，在包含所述區(qū)段和所述標(biāo)記序列的片段中，從所述標(biāo)記序列剪切所有或者部分的所述區(qū)段。11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述剪切使用限制性內(nèi)切核酸酶完成。12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述檢測還包括擴增所述標(biāo)記序列。13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中所述擴增用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)完成。14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中所述PCR包括標(biāo)記的引物。15.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述檢測使用TaqmanPCR檢測系統(tǒng)完成。16.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中通過與兩個探針雜交來檢測所述標(biāo)記序列，所述兩個探針與所述標(biāo)記序列同時雜交。17.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述區(qū)段包含串聯(lián)重復(fù)區(qū)域。18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中所確定的大小是在所述串聯(lián)重復(fù)區(qū)域中重復(fù)的數(shù)量。19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中選擇所述組分以將具有正常串聯(lián)重復(fù)數(shù)量的片段與具有異常串聯(lián)重復(fù)數(shù)量的片段分離。20.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中所述串聯(lián)重復(fù)是三核苷酸串聯(lián)重復(fù)。21.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中所述串聯(lián)重復(fù)與選自DRPLA、EPM1、FRAXA、FMR1、FRDA、亨廷頓蛋白、JPH-3、AR、DM1、DM2、SCA1、SCA2、SCA3、SCA6、SCA7、SCA8、SCAIO、SCA12、SCA17、PABPN1禾卩HOXD13的基因相關(guān)。22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中所述串聯(lián)重復(fù)與選自FMR1、FRDA和DM1的基因相關(guān)。23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中所述基因是FMR1。24.—種在核酸樣品中檢測在基因串聯(lián)重復(fù)區(qū)段中的突變的方法，其中所述突變的特征為與在野生型等位基因中重復(fù)數(shù)量相比較重復(fù)數(shù)量的變化，所述方法包括分離核酸的片段，所述片段從包含核酸的樣品中制備，其中所述片段包括一些包含所述串聯(lián)重復(fù)區(qū)段和標(biāo)記序列的片段，所述分離依照大小分離成部分，這在包含所述串聯(lián)重復(fù)區(qū)段的片段將依照所述串聯(lián)重復(fù)區(qū)段中重復(fù)的數(shù)量而定位于所述部分中的條件下進(jìn)行；通過檢測所述標(biāo)記序列來鑒定包含所述區(qū)段的那些部分，其中，在所述串聯(lián)重復(fù)區(qū)段中的重復(fù)數(shù)量通過在其中其被鑒定的部分來確定，和將來自所述核酸樣品的所述串聯(lián)重復(fù)區(qū)段中的重復(fù)數(shù)量與相應(yīng)野生型等位基因中的數(shù)量進(jìn)行比較，其中，不同于在所述野生型等位基因中的數(shù)量的重復(fù)數(shù)量表明是突變。25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，還包括通過將來自所述核酸樣品的所述串聯(lián)重復(fù)區(qū)段中的重復(fù)數(shù)量與相應(yīng)的全突變等位基因中數(shù)量進(jìn)行比較，來確定所述突變是否是前突變或者全突變，其中大于所述野生型等位基因但是小于所述全突變的重復(fù)數(shù)量表明是前突變等位基因，而大于或者等于所述全突變的重復(fù)數(shù)量表明是全突變等位基因。26.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中使用一種或多種限制性內(nèi)切核酸酶獲得所述片段。27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法，其中所述一種或多種限制性內(nèi)切核酸酶選自Alul、Sphl、Bmtl、Blpl、MlyI和BstNI。28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，Alul。29.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，Sphl和Bmtl。30.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，Blpl和Mlyl。其中所述一種或多種限制性內(nèi)切核酸酶是其中所述一種或多種限制性內(nèi)切核酸酶是其中所述一種或多種限制性內(nèi)切核酸酶是31.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中所述分離通過電泳進(jìn)行。32.根據(jù)權(quán)利要求33所述的方法，其中所述電泳是毛細(xì)管電泳。33.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中所述分離通過層析進(jìn)行。34.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中選擇所述部分以將包含具有正常數(shù)量的串聯(lián)重復(fù)的串聯(lián)重復(fù)區(qū)段的片段與包含具有異常數(shù)量的重復(fù)的串聯(lián)重復(fù)區(qū)段的片段分離開來。35.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中所述分離是分離成為選自2-16的許多部分。36.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，還包括在所述分離步驟之后，在包含所述串聯(lián)重復(fù)區(qū)段和所述標(biāo)記序列的片段中，從所述標(biāo)記序列剪切所有或者部分的所述串聯(lián)重復(fù)區(qū)段。37.根據(jù)權(quán)利要求36所述的方法，其中使用限制性內(nèi)切核酸酶完成所述剪切。38.根據(jù)權(quán)利要求37所述的方法，其中所述限制性內(nèi)切核酸酶選自BsaWI、Hphl、Bbvl、Bs龍、Hpyl881、SmlI禾卩BmtI。39.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中所述檢測還包括擴增所述標(biāo)記。40.根據(jù)權(quán)利要求39所述的方法，其中用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)完成所述擴增。41.根據(jù)權(quán)利要求40所述的方法，其中所述擴增利用可檢測地標(biāo)記的引物。42.根據(jù)權(quán)利要求41所述的方法，其中用電泳完成所述檢測。43.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中使用TaqmamPCR檢測系統(tǒng)完成所述檢測。44.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中通過與兩個探針雜交來檢測所述標(biāo)記序列，所述兩個探針與所述標(biāo)記序列同時雜交。45.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中所述串聯(lián)重復(fù)是三核苷酸串聯(lián)重復(fù)。46.—種鑒定在個體核酸中具有正常數(shù)量的串聯(lián)重復(fù)、前突變或者全突變的FMR1等位基因的方法，所述方法包括分離核酸片段，所述核酸從個體包含核酸的樣品中制備，其中所述片段包括一些包含F(xiàn)MR1基因的串聯(lián)重復(fù)區(qū)段和標(biāo)記序列的片段，所述分離是依照大小分離成部分，這在以下條件下進(jìn)行其中包含具有正常重復(fù)數(shù)量的所述串聯(lián)重復(fù)區(qū)段的片段將定位在第一部分中；包含具有前突變的串聯(lián)重復(fù)區(qū)段的片段將定位在第二部分中；和包含具有全突變的串聯(lián)重復(fù)區(qū)域的片段將定位在第三部分中，通過檢測所述標(biāo)記序列來鑒定包含所述串聯(lián)重復(fù)區(qū)段的那些部分，其中，所述串聯(lián)重復(fù)區(qū)段中的所述重復(fù)數(shù)量通過在其中其被鑒定的所述部分來確定，其中在所述第一部分中的陽性結(jié)果表示個體有具有正常數(shù)量串聯(lián)重復(fù)的FMR1等位基因；在所述第二部分中的陽性結(jié)果表示個體具有前突變FMR1等位基因；在所述第三部分中的陽性結(jié)果表示個體具有全突變FMR1等位基因。47.根據(jù)權(quán)利要求46所述的方法，其中使用一種或多種限制性內(nèi)切核酸酶獲得所述片段。48.根據(jù)權(quán)利要求47所述的方法，其中所述一種或多種限制性內(nèi)切核酸酶選自Alul、Sphl、Bmtl、Blpl、Mlyl和Bs薩。49.根據(jù)權(quán)利要求48所述的方法，其中所述一種或多種限制性內(nèi)切核酸酶是Alul。50.根據(jù)權(quán)利要求48所述的方法，其中所述一種或多種限制性內(nèi)切核酸酶是Sphl和Bmtl。51.根據(jù)權(quán)利要求48所述的方法，其中所述一種或多種限制性內(nèi)切核酸酶是Blpl和Myll。52.根據(jù)權(quán)利要求46所述的方法，其中所述分離通過電泳進(jìn)行。53.根據(jù)權(quán)利要求46所述的方法，其中所述分離通過層析進(jìn)行。54.根據(jù)權(quán)利要求46所述的方法，還包括在所述分離步驟之后，從包含所述串聯(lián)重復(fù)區(qū)段和所述標(biāo)記序列的所述標(biāo)記序列片段剪切所有或者部分的所述串聯(lián)重復(fù)區(qū)段。55.根據(jù)權(quán)利要求54所述的方法，其中使用限制性內(nèi)切核酸酶完成所述剪切。56.根據(jù)權(quán)利要求55所述的方法，其中所述限制性內(nèi)切核酸酶選自BsaWI、Hphl、Bbvl、BstNI、Hpyl881、SmlI禾卩BmtI。57.根據(jù)權(quán)利要求46所述的方法，其中所述檢測還包含擴增所述標(biāo)記。58.根據(jù)權(quán)利要求57所述的方法，其中用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)完成所述擴增。59.根據(jù)權(quán)利要求58所述的方法，60.根據(jù)權(quán)利要求59所述的方法，61.根據(jù)權(quán)利要求46所述的方法，檢測。其中所述擴增利用可檢測地標(biāo)記的引物。其中用電泳完成所述檢測。其中使用TaqmanPCR檢測系統(tǒng)完成所述62.—種確定核酸樣品中串聯(lián)重復(fù)區(qū)段的大小的方法，所述方法包括a)通過第一種方法測量所述串聯(lián)重復(fù)區(qū)段的大小，所述第一種方法包括擴增所述串聯(lián)重復(fù)區(qū)段，b)通過依照權(quán)利要求17所述的第二種方法測量所述串聯(lián)重復(fù)區(qū)段的大小，c)使用在步驟a)和b)中得到的信息來確定所述串聯(lián)重復(fù)區(qū)段的大小。63.根據(jù)權(quán)利要求62所述的方法，其中用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)完成步驟a)中的擴增。64.根據(jù)權(quán)利要求63所述的方法，還包括使用電泳對所述擴增的串聯(lián)重復(fù)區(qū)域進(jìn)行大小排列。65.—種用于篩查男性和女性個體在FMR1基因的串聯(lián)重復(fù)區(qū)域中的突變攜帶者狀況的方法，所述方法包括分析來自個體的核酸以確定性別；和分析所述核酸以確定所述FMR1基因的串聯(lián)重復(fù)區(qū)域的長度，其中所述確定包括擴增串聯(lián)重復(fù)區(qū)域，檢測擴增產(chǎn)物，和確定在所述擴增產(chǎn)物中的串聯(lián)重復(fù)數(shù)量，其中在男性個體中-具有小于55個串聯(lián)重復(fù)的擴增產(chǎn)物的存在表示所述個體不是攜帶者，具有55個或者更多個串聯(lián)重復(fù)的擴增產(chǎn)物的存在表示所述個體是攜帶者，或者不存在擴增產(chǎn)物時，攜帶者狀況是不確定的；和在女性個體中具有多于55個串聯(lián)重復(fù)的擴增產(chǎn)物的存在表示所述個體是攜帶者；或具有小于55個串聯(lián)重復(fù)的單個擴增產(chǎn)物的存在表示所述攜帶者狀況是不確定66.根據(jù)權(quán)利要求65所述的方法，還包括，分析未確定的個體以確定攜帶者狀況，其中所述分析包括，分離核酸片段，其中所述片段由包含核酸的個體樣品制備，其中所述片段包括一些包含F(xiàn)MR1基因的串聯(lián)重復(fù)區(qū)段和標(biāo)記序列的片段，按照大小分離成部分，這在以下條件下進(jìn)行含有具有正常重復(fù)數(shù)量的串聯(lián)重復(fù)區(qū)段的片段將定位在第一部分中；含有具有前突變的串聯(lián)重復(fù)區(qū)段的片段將定位在第二部分中；以及含有具有全突變的串聯(lián)重復(fù)區(qū)域的片段將定位在第三部分中，通過檢測標(biāo)記序列來鑒定包含所述區(qū)段的那些部分，其中，在所述串聯(lián)重復(fù)區(qū)段中的所述重復(fù)數(shù)量通過在其中其被鑒定的部分來確定，其中，在男性個體中在所述第一部分中的陽性結(jié)果表示所述個體不是攜帶者，在所述第二部分中的陽性結(jié)果表示所述個體是前突變攜帶者，在所述第三部分中的陽性結(jié)果表示所述個體是受侵襲的；和在女性個體中僅在所述第一部分中的陽性結(jié)果表示所述個體對于所述正常等位基因是純合的；在所述第二部分中的陽性結(jié)果表示所述個體是前突變攜帶者，和在所述第三部分中的陽性結(jié)果表示所述個體是全突變攜帶者。67.根據(jù)權(quán)利要求65所述的方法，其中所述分析核酸以確定性別包括核酸擴增。68.根據(jù)權(quán)利要求67所述的方法，其中所述核酸擴增包括，從X染色體上的牙釉蛋白基因和Y染色體上的牙釉蛋白基因擴增產(chǎn)生不同大小擴增產(chǎn)物的牙釉蛋白基因的區(qū)域，確定所述擴增產(chǎn)物或多個擴增產(chǎn)物的大小，其中單一大小的一個產(chǎn)物的存在表示性別是女性，而不同大小的兩種產(chǎn)物的存在表示性別是男性。69.根據(jù)權(quán)利要求67所述的方法，其中所述牙釉蛋白基因區(qū)域的所述擴增是用所述FMR1基因的所述串聯(lián)重復(fù)區(qū)域的多重擴增進(jìn)行。70.根據(jù)權(quán)利要求69所述的方法，其中所述多重擴增還包括擴增一個或多個對照序列。71.根據(jù)權(quán)利要求66所述的方法，還包括在所述分離步驟之后，從包含所述串聯(lián)重復(fù)區(qū)段和所述標(biāo)記序列的所述標(biāo)記序列片段剪切所有或者部分的串聯(lián)重復(fù)區(qū)段。72.用于檢測樣品中特定核酸區(qū)段的大小的試劑盒，所述試劑盒包含用于擴增所述特定核酸區(qū)段上游或下游的標(biāo)記核苷酸序列的引物對，和一種或多種限制性內(nèi)切核酸酶，所述限制性內(nèi)切核酸酶用于剪切所述核酸樣品以產(chǎn)生包含所述特定核酸區(qū)段和所述上游或下游標(biāo)記序列的核酸樣品片段，其中所述特定核酸區(qū)段是串聯(lián)重復(fù)序列。73.根據(jù)權(quán)利要求72所述的試劑盒，還包含一種或多種限制性酶，用于將所述特定核酸區(qū)段與所述標(biāo)記序列分開。74.根據(jù)權(quán)利要求72所述的試劑盒，還包含一種或多種對照，用于驗證用所述限制性內(nèi)切核酸酶消化的核酸的合適大小分離。75.根據(jù)權(quán)利要求72所述的試劑盒，其中所述串聯(lián)重復(fù)區(qū)段來自FMR1基因。全文摘要本發(fā)明提供了通過DNA斷裂(片段化)、大小分級、任選的第二次斷裂和使用標(biāo)記序列進(jìn)行鑒定，從而確定在核酸樣品中感興趣的特定核酸區(qū)段的大小的方法。在特定方面，能夠檢測串聯(lián)重復(fù)序列的擴增或者減少。在進(jìn)一步的方面，可以將攜帶者或受脆性X綜合癥或其它與串聯(lián)重復(fù)相關(guān)的疾病侵襲的個體與正常個體區(qū)別開來。文檔編號B01D57/02GK101595227SQ200780045172公開日2009年12月2日申請日期2007年4月11日優(yōu)先權(quán)日2006年10月5日發(fā)明者C·M·思特羅姆,D·黃,J·E·魯克,S·J·波茨申請人:奎斯特診斷投資公司;美國基因組公司