專利名稱：：檢測(cè)琥珀酰丙酮的制作方法檢測(cè)琥珀酰丙酮對(duì)相關(guān)申請(qǐng)的交叉參考本申請(qǐng)要求2007年5月4日提交的美國(guó)申請(qǐng)11/744，789的優(yōu)先權(quán)，將其內(nèi)容全部引入本申請(qǐng)作為參考。
背景技術(shù)：
：質(zhì)譜法用于檢測(cè)和測(cè)量寬范圍的代謝物，所述代謝物的存在或量可以指示某些病癥或疾病。由此，質(zhì)譜法可用于例如診斷與代謝物水平改變相關(guān)的多種代謝性疾病(metabolicdisorder)。一種所述代謝性疾病為I型遺傳性高酪氨酸血癥(hereditarytyrosi固ia，TypeI，HTl))，其是由延胡索酰乙酰乙酸水解酶(f麗rylacetoacetatehydrolase,FAH))的缺乏引起的，并且與酪氨酸和琥珀酰丙酮水平增加相關(guān)。HTl是兒童期疾病，其引起肝衰竭、疼痛性神經(jīng)性危象(painfulneurologicalcrises)、佝僂病(ricket)和肝癌(h印atocarcinoma)。若未經(jīng)治療，通常在不到2歲時(shí)發(fā)生死亡，一些慢性形式允許生存到12歲。如果在生命早期開始治療，則目前可能用NTBC(或尼替西農(nóng))治療HT1。由此，存在的主要?jiǎng)訖C(jī)是，通過(guò)新生兒篩查或甚至產(chǎn)前篩查來(lái)鑒別HTl感染的患者。
發(fā)明內(nèi)容琥珀酰丙酮(Succinylacetone)是早期檢測(cè)HTl的主要標(biāo)志物。然而，琥珀酰丙酮是非常具有反應(yīng)性的酮，其與蛋白質(zhì)形成綴合物。本申請(qǐng)所述的方法能夠用于在以下條件下從試樣中提取琥珀酰丙酮，所述條件允許同時(shí)提取其它代謝物，如氨基酸、游離肉毒堿或?；舛緣A。例如，可避免苛刻的提取條件(如極端酸性和高溫)。本申請(qǐng)所述的方法可用于使用質(zhì)譜法(例如串聯(lián)質(zhì)譜法)檢測(cè)和/或測(cè)量琥珀酰丙酮和一種或多種額外的生物分析物。所述方法用于診斷代謝性疾病如氨基酸病(aminoacidopathy)(例如，I型酪氨酸血癥)，以及用于產(chǎn)生所述疾病的檢測(cè)/診斷的代謝分布。在一個(gè)方面，本公開提供了提取的方法。所述方法包括以下步驟使試樣與提取溶液接觸，所述提取溶液包含Cl-3直鏈或支鏈一元醇和強(qiáng)堿，其中使試樣與提取溶液接觸從試樣中產(chǎn)生了包含以下成分的提取物(i)衍生化的琥珀酰丙酮，(ii)一種或多種氨基酸，(iii)游離肉毒堿，(iv)一種或多種酰基肉毒堿，或(v)(ii)、(iii)或(iv)的任何衍生化形式，其中衍生化的琥珀酰丙酮在提取物中的濃度反映了琥珀酰丙酮在試樣中的濃度，其中一種或多種氨基酸、游離肉毒堿、一種或多種酰基肉毒堿或它們的衍生化形式在提取物中的濃度反映了它們?cè)谠嚇又械南鄳?yīng)濃度。所述方法還可包括在使試樣與提取溶液接觸后，利用串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)試樣進(jìn)行分析的步驟。所述接觸可將至少一種琥珀酰丙酮分子衍生為3-(5-甲基-1H-妣唑-3-基)丙酸(MPP)。所述Cl-3直鏈或支鏈一元醇可以是甲醇、乙醇、丙醇或異丙醇。所述強(qiáng)堿可以是肼、修飾的肼(例如，酰肼、芳基肼、烷基肼、Girard-P和Girard-T試劑)或羥胺。在一些實(shí)施方案中，所述試樣可以是生物試樣如干燥過(guò)的血斑(bloodspot)。所述試樣可獲自新生人類。所述試樣可以是獲自不疑患有代謝性疾病如I型酪氨酸血癥或面臨發(fā)展所述疾病危險(xiǎn)的受試者的試樣。在一些實(shí)施方案中，所述提取溶液可含有水、有機(jī)酸和/或一種或多種內(nèi)標(biāo)物。例如，所述提取溶液可含有約5%至約30%水或約20%至約25%水。所述有機(jī)酸可以是例如，濃度為約5mM的草酸。所述內(nèi)標(biāo)物可包括至少一種重原子同位素如2H5N或"C。一種或多種內(nèi)標(biāo)物可以是或含有琥珀酰丙酮、氨基酸、游離肉毒堿、?；舛緣A或上述任何物質(zhì)的衍生化形式。在一些實(shí)施方案中，所述方法可包括以下步驟在使試樣與提取溶液接觸后，對(duì)試樣進(jìn)行蒸發(fā)，得到第一次蒸發(fā)的試樣。所述方法還可包括以下步驟對(duì)試樣進(jìn)行蒸發(fā)后，使第一次蒸發(fā)的試樣與烷基醇溶液接觸，所述烷基醇溶液包含烷基醇和酸。所述方法還可包括以下步驟使試樣與烷基醇溶液接觸后，蒸發(fā)溶液，得到第二次蒸發(fā)的溶液，和/或重組(reconstitute)第二次蒸發(fā)的溶液。重組第二次蒸發(fā)的溶液可包括使第二次蒸發(fā)的溶液與溶劑接觸。所述烷基醇可以是甲醇、乙醇、丙醇、異丙醇、正丁醇、叔丁醇或戊醇。所述酸可以是鹽酸(HC1)。所述溶劑可包括乙腈、異丙醇，或水與異丙醇或與乙腈的混合物。在另一個(gè)方面，本公開提供了提取(extraction)的方法，所述方法包括以下步驟使試樣與提取溶液接觸，所述提取溶液包含Cl-3直鏈或支鏈一元醇和強(qiáng)堿，其中使試樣與提取溶液接觸從試樣中產(chǎn)生了包含以下成分的提取物(i)衍生的生物學(xué)活性的酮，(ii)一種或多種氨基酸，(iii)游離肉毒堿，(iv)一種或多種?；舛緣A，或(v)(ii)、(iii)或(iv)的任何衍生化形式，其中衍生的生物學(xué)活性的酮在提取物中的濃度反映了生物學(xué)活性的酮在試樣中的濃度，其中一種或多種氨基酸、游離肉毒堿、一種或多種酰基肉毒堿或它們的衍生化形式在提取物中的濃度反映了它們?cè)谠嚇又械南鄳?yīng)濃度。所述Cl-3直鏈或支鏈一元醇可以是甲醇、乙醇、丙醇或異丙醇。所述生物學(xué)活性的酮可以是例如琥珀酰丙酮或類固醇。類固醇包括但不限于睪酮、脫氫表雄酮(DHEA)、硫酸脫氫表雄酮、雄甾烯二酮(androstenedione)、17_羥孕酮(17-0HP)、17-羥基孕烯醇酮、皮質(zhì)醇(Cortisol)、11-脫氧皮質(zhì)醇、皮質(zhì)酮、醛固酮、雌二醇、18-0H皮質(zhì)酮、孕烯醇酮、孕酮、可的松(cortisone)、四氫皮質(zhì)醇、11_脫氧皮質(zhì)酮、肌酸酐、17-酮類固醇、膽固醇、維生素B或維生素A。所述強(qiáng)堿可以是本申請(qǐng)描述的強(qiáng)堿中的任何一種。所述提取溶液也可包括水。在另一個(gè)方面，本公開的特征為檢測(cè)琥珀酰丙酮的方法。所述方法包括以下步驟使試樣與提取溶液接觸，所述提取溶液包含Cl-3直鏈或支鏈一元醇和強(qiáng)堿；對(duì)試樣中的琥珀酰丙酮進(jìn)行衍生化；然后利用串聯(lián)質(zhì)譜法評(píng)價(jià)衍生的試樣中衍生化的琥珀酰丙酮。琥珀酰丙酮的衍生化形式可以是琥珀酰丙酮至3-(5-甲基-lH-吡唑-3-基)丙酸(MPP)。所述強(qiáng)堿可以是本申請(qǐng)所述的任何強(qiáng)堿。在另一個(gè)方面，本公開提供了檢測(cè)琥珀酰丙酮的方法，所述方法包括以下步驟使試樣與提取溶液接觸，所述提取溶液包含Cl-3直鏈或支鏈一元醇和肼；將試樣中的琥珀酰丙酮衍生為3-(5_甲基-lH-吡唑-3-基)丙酸(MPP);然后利用串聯(lián)質(zhì)譜法評(píng)價(jià)衍生的試樣中的MPP。所述方法也可包括就相同注射試樣中含有MPP的一種或多種額外的分析物(例如，本申請(qǐng)所述的任何額外的分析物)來(lái)評(píng)價(jià)試樣。所述Cl-3直鏈或支鏈一元醇可以是甲醇、乙醇、丙醇或異丙醇。在另一個(gè)方面，本公開提供了檢測(cè)琥珀酰丙酮的方法。所述方法可包括以下步驟使試樣與含有有機(jī)溶劑的提取溶液在實(shí)質(zhì)上不固定蛋白質(zhì)的條件下接觸；將試樣中的琥珀酰丙酮衍生為3-(5-甲基-lH-吡唑-3-基)丙酸(MPP);然后利用串聯(lián)質(zhì)譜法評(píng)價(jià)衍生的試樣中的MPP和額外分析物(或其衍生物)。所述提取溶液可含有約5%水。所述提取溶液可含有約85%Cl-3直鏈或支鏈一元醇如甲醇、乙醇、丙醇或異丙醇。琥珀酰丙酮可用肼或衍生化的肼來(lái)衍生。在一些實(shí)施方案中，所述方法可包括以下步驟基于對(duì)試樣中琥珀酰丙酮的檢測(cè)，確定試樣所來(lái)源的受試者是否患有遺傳性I型酪氨酸血癥或面臨發(fā)展所述疾病的危險(xiǎn)。在確定受試者患有遺傳性I型酪氨酸血癥或面臨發(fā)展所述疾病的危險(xiǎn)后，所述方法可包括給予受試者4-羥基苯基丙酮酸雙加氧酶(4-hydroxyphenylpyruvatedioxygenase)的抑制劑。在另一個(gè)方面，本公開的特征為檢測(cè)生物學(xué)活性的酮的方法。所述方法包括以下步驟使試樣與提取溶液接觸，所述提取溶液包含Cl-3直鏈或支鏈一元醇和強(qiáng)堿；對(duì)試樣中的生物學(xué)活性的酮進(jìn)行衍生化；然后利用串聯(lián)質(zhì)譜法評(píng)價(jià)衍生的試樣中衍生的生物學(xué)活性的酮。生物學(xué)活性的酮可以是琥珀酰丙酮或類固醇(steroid)，如本申請(qǐng)所述的任何類固醇。所述Cl-3直鏈或支鏈一元醇可以是甲醇、乙醇、丙醇或異丙醇。所述提取溶液也可包括水。在本申請(qǐng)所述的任何方法的一些實(shí)施方案中，所述試樣可以是生物試樣如干燥過(guò)的血樣(干燥過(guò)的血斑)。所述試樣可來(lái)自新生人類。所述試樣也可包括至少一種重原子同位素，所述同位素在質(zhì)譜分析之前包括在同一試樣中。在本申請(qǐng)所述的任何方法的一些實(shí)施方案中，所述評(píng)價(jià)可包括對(duì)來(lái)自注射到串聯(lián)質(zhì)譜儀中的試樣中衍生化的琥珀酰丙酮以及一種或多種額外的分析物(例如，生物學(xué)分析物如一種或多種氨基酸、游離肉毒堿或?；舛緣A)進(jìn)行分析。例如，衍生化的琥珀酰丙酮可與來(lái)自相同注射試樣(注射到串聯(lián)質(zhì)譜儀中)的一種或多種(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、15、18、20、22、25、28或30種)額外的分析物一起分析。在本申請(qǐng)所述的任何方法的一些實(shí)施方案中，所述試樣為先前未經(jīng)提取的試樣。在本申請(qǐng)所述的任何方法的一些實(shí)施方案中，使試樣與提取溶液接觸導(dǎo)致了從試樣中提取出(i)衍生化的琥珀酰丙酮(SA)和(ii)一種或多種氨基酸、游離肉毒堿、一種或多種?；舛緣A或上述成分的衍生化形式，而沒(méi)有改變這些分析物在試樣中的比例。例如，從含有比例為約5:1:2的SA、酪氨酸和游離肉毒堿的試樣中獲得的提取液可含有比例為約5:i:2的衍生化的琥珀酰丙酮、酪氨酸(或衍生化的酪氨酸)和游離肉毒堿(或衍生化的游離肉毒堿)。在另一個(gè)方面，本公開的特征為用于檢測(cè)琥珀酰丙酮的試劑盒(kit)。所述試劑盒可包括衍生化的琥珀酰丙酮，所述琥珀酰丙酮包含至少一種重原子同位素；以及如何檢測(cè)衍生化的琥珀酰兩酮的說(shuō)明書。所述試劑盒也可包括強(qiáng)堿如肼。所述強(qiáng)堿可按小于約0.1%的濃度提供。所述肼可以是二鹽酸肼。所述試劑盒也可包括一種或多種內(nèi)標(biāo)物，每種內(nèi)標(biāo)物含有(i)氨基酸、游離肉毒堿或?；舛緣A，和(i)至少一種重原子同位素。所述試劑盒也可包括至少一種干燥過(guò)的血斑，其包含已知量的一種或多種或琥珀酰丙酮、氨基酸、游離肉毒堿或?；舛緣A。所述衍生化的琥珀酰丙酮可以是3-(5_甲基-1H-吡唑-3-基)丙酸(MPP)。在另一個(gè)方面，本公開提供了用于檢測(cè)生物學(xué)活性的酮的試劑盒。所述試劑盒可包括相關(guān)的衍生化生物學(xué)活性的酮，所述酮至少一種重同位素原子，以及如何檢測(cè)衍生化生物學(xué)活性的酮的說(shuō)明書。許多質(zhì)譜儀具有高分辨的質(zhì)量精確度。例如，在帶單個(gè)電荷的離子(singlychargedion)的情況中，該范圍對(duì)應(yīng)于0.6m/z。質(zhì)譜儀中較小變化(例如，校準(zhǔn)的變化)可產(chǎn)生與本申請(qǐng)所述的信號(hào)不相同的離子m/z信號(hào)，但可例如通過(guò)對(duì)校準(zhǔn)中的偏移量進(jìn)行補(bǔ)償而容易地鑒別和使用對(duì)應(yīng)于所披露的信號(hào)的m/z信號(hào)。將本申請(qǐng)?zhí)峒暗乃谐霭嫖?、專利申?qǐng)、專利和其它參考文獻(xiàn)全文引入作為參考。圖1為描述酪氨酸分解代謝途徑的示意圖。圖2為描述從生物試樣中提取和衍生化琥珀酰丙酮的必要反應(yīng)的示意圖。圖3為一種方法的示意圖，所述方法在通過(guò)串聯(lián)質(zhì)譜法(tandemmassspectrometry)進(jìn)行注射和檢測(cè)/測(cè)量前提取和衍生化琥珀酰丙酮。圖4為一種方法的示意圖，所述方法在通過(guò)串聯(lián)質(zhì)譜法進(jìn)行注射和檢測(cè)/測(cè)量前提取和衍生化琥珀酰丙酮，以及提取和酯化額外的分析物。圖5為使用圖3所述的方法獲得的衍生化的琥珀酰丙酮和其它非衍生化的氨基酸的串聯(lián)質(zhì)譜圖(46次掃描的中性丟失(neutralloss))。氨基酸由三字母編碼命名，例如，丙氨酸為"ala"，單獨(dú)氨基酸的子離子(daughterion)的具體荷質(zhì)比(m/z)信號(hào)由箭頭指示。"IS"是指內(nèi)標(biāo)物。X-軸代表m/z，Y-軸代表試樣中各種離子的相對(duì)豐度(百分?jǐn)?shù))。圖6為所提取的血斑的串聯(lián)質(zhì)譜圖(102次掃描的中性丟失)，其描述當(dāng)根據(jù)圖4所述的方法處理試樣時(shí)，可與琥珀酰丙酮一起檢測(cè)和/或測(cè)量的示例性分析物。圖7為用圖3所述的方法獲得的一系列光譜(46次掃描的中性丟失)。所述光譜描述了測(cè)量來(lái)自健康新生兒以及來(lái)自證實(shí)患有I型酪氨酸血癥的新生兒的干燥過(guò)的血斑中琥珀酰丙酮和酪氨酸水平。X-軸代表相應(yīng)的m/z，峰高代表分析物的相對(duì)豐度。圖8是一對(duì)條形圖和表，其描述與健康新生兒("真陰性(trueneg)")相比，測(cè)量從25小時(shí)和15天的證實(shí)患有I型酪氨酸血癥的新生兒中獲得的干燥過(guò)的血斑中琥珀酰丙酮和酪氨酸水平。圖8A的條形圖的Y-軸代表琥珀酰丙酮的水平(單位為iiM)(左)。圖8B的條形圖的Y-軸代表酪氨酸水平(單位為PM)(右)。圖9為描述水合肼和二鹽酸肼相對(duì)穩(wěn)定性的線性圖。X-軸代表天數(shù)，Y-軸代表保持在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的水合肼(菱形)或二鹽酸肼(方形)的量(百分?jǐn)?shù))。具體實(shí)施例方式可通過(guò)將試樣中的琥珀酰丙酮修飾成更穩(wěn)定形式，由質(zhì)譜法來(lái)檢測(cè)琥珀酰丙酮。本申請(qǐng)披露的是用于進(jìn)行所述修飾以及當(dāng)前用于處理試樣的方法和組合物，所述試樣處理是以這樣的方式進(jìn)行該方式允許在單次步驟中從試樣中提取琥珀酰丙酮和其它分析物(例如，氨基酸、?；舛緣A和游離肉毒堿)，從而使琥珀酰丙酮和其它分析物在提取物中的濃度反映它們?cè)谠嚇又械南鄳?yīng)濃度。還披露了使用質(zhì)譜法檢測(cè)和/或測(cè)量琥珀酰丙酮(衍生化的琥珀酰丙酮)和一種或多種額外的分析物的方法。本申請(qǐng)所述的方法尤其可用于診斷受試者中一種或多種代謝性疾病如氨基酸病(例如，遺傳性I型酪氨酸血癥)和有機(jī)酸和脂肪酸代謝障礙或用于產(chǎn)生所述診斷的代謝分布(見下文)。,人辦巾翻德白酉先翻禾口客頁(yè)夕卜白彌斤麵誠(chéng)本公開的特征為在單次步驟中從試樣中提取琥珀酰丙酮以及一種或多種額外的分析物(例如，氨基酸、?；舛緣A和游離肉毒堿)的方法，從而使琥珀酰丙酮和一種或多種額外的分析物(例如，氨基酸、游離肉毒堿和酰基肉毒堿)在提取物中的濃度反映它們?cè)谠嚇又械南鄳?yīng)濃度。提取后，可使用質(zhì)譜法(例如串聯(lián)質(zhì)譜法)確定琥珀酰丙酮以及一種或多種額外的分析物(例如，游離肉毒堿，?；舛緣A和氨基酸)的存在或存在量。所述方法可包括使試樣與提取溶液接觸，所述提取溶液含有Cl-3直鏈或支鏈一元醇(例如，甲醇、乙醇、丙醇或異丙醇)和強(qiáng)堿如肼、修飾的肼(例如，酰肼、芳基肼、烷基肼、Girard-P和Girard-T試劑)或羥胺。所述提取溶液也可含有水。使試樣與提取溶液接觸導(dǎo)致了對(duì)琥珀酰丙酮(若存在于試樣中)的修飾(衍生化)以及對(duì)所修飾的琥珀酰丙酮和一種或多種額外的分析物(例如，游離肉毒堿、酰基肉毒堿和氨基酸)的提取。圖2描述了根據(jù)本申請(qǐng)所述的方法從干燥過(guò)的血斑試樣中提取琥珀酰丙酮的示例性反應(yīng)。琥珀酰丙酮是非常具有反應(yīng)性的二酮，因此其快速地與生物學(xué)流體如全血中的某些氨基酸(例如，游離氨基酸或肽和蛋白質(zhì)成分)的側(cè)鏈反應(yīng)。通過(guò)琥珀酰丙酮與氨基酸殘基反應(yīng)形成的席夫堿(Schiffbase)綴合物比游離琥珀酰丙酮更穩(wěn)定，因此血液中存在的多數(shù)(若不是全部)琥珀酰丙酮呈結(jié)合形式。為了在單次步驟中從試樣(例如，生物試樣如血斑)中提取(釋放)琥珀酰丙酮以及一種或多種額外的分析物，可使所述試樣與提取溶液接觸，所述提取溶液含有Cl-3直鏈或支鏈一元醇(例如，甲醇、乙醇、丙醇或異丙醇)和強(qiáng)堿。所述強(qiáng)堿可以是肼或修飾的肼(例如，酰肼、芳基肼、烷基肼、Girard-P和Girard-T試劑)以及羥胺。所述C1-3直鏈或支鏈一元醇在溶液中的濃度按體積計(jì)例如可為約70%(例如，約70%、約71%、約72%、約73%、約74%、約75%、約76%、約77%、約78%、約79%、約80%、約81%、約82%、約83%、約84%、約85%、約86%、約87%、約88%、約89%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%或約95%)。所述強(qiáng)堿(例如，肼、修飾的肼或羥胺)在溶液中的濃度可以為約600iiM(例如，約200iiM、約300iiM、約400iiM、約500iiM、約550iiM、約650iiM、約700iiM、約800iiM、約900iiM、約1，000iiM、約1，200iiM、約1，500iiM或約2，000iiM)。所述提取溶液也可含有水。水在提取溶液中的濃度按體積計(jì)例如可為約6_30%(例如，7-28%、8-26%、10-26%、14-25%、18-24%)。水的濃度可以是這樣的濃度，該濃度使提取溶液重組一些蛋白質(zhì)和肽，同時(shí)溶解試樣中存在的其它分析物(例如，酰基肉毒堿、游離肉毒堿和氨基酸)。所述提取溶液也可含有有機(jī)酸如草酸，濃度為約3mM(例如，約lmM、約2mM、約2.5mM、約3.5mM、約4mM、約4.5mM或約5mM)。任選地，在用作催化劑的有機(jī)酸(例如，草酸)輔助下，肼將琥珀酰丙酮從氨基酸殘基中釋放，形成穩(wěn)定的吡唑環(huán)(pyrazonering)。琥珀酰丙酮與肼反應(yīng)形成的吡唑環(huán)(pyrazone)稱為3_(5_甲基_1H_吡唑_3_基)丙酸(MPP)。該化合物比琥珀酰丙酮與氨基酸殘基形成的席夫堿更穩(wěn)定。因此，一旦琥珀酰丙酮與肼反應(yīng)，在單次步驟中可將該MPP衍生物與額外的分析物(例如，氨基酸、游離肉毒堿和?；舛緣A)一起全部提取出來(lái)。然后可利用串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)量所提取的MPP和額外的分析物。目前例如可利用串聯(lián)質(zhì)譜法評(píng)價(jià)琥珀酰丙酮可其它分析物。MPP的濃度直接反映試樣中琥珀酰丙酮的濃度。圖3描述了制備用于質(zhì)譜分析的試樣的示例性方法。在這種情況中，可對(duì)獲自新生兒(或任何年齡的人)的干燥過(guò)的血斑試樣進(jìn)行穿孔以產(chǎn)生置于例如微量滴定板的孔中的小盤(smalldisc)。可向該試樣中加入提取溶液以提取試樣中的分析物。所述提取溶液可包含Cl-3直鏈或支鏈一元醇和強(qiáng)堿的混合物(這兩種組分的比例可如上文所述的那樣變化)。肼的來(lái)源可以是水合肼或二鹽酸肼，或其它修飾的肼(例如，酰肼、芳基肼、烷基肼、Girard-P和Girard-T試劑)或羥胺。所述也可含有水(見上文)以及較小百分含量的有機(jī)酸(例如，草酸)。該溶液也可任選含有一種或多種內(nèi)標(biāo)物，例如，已知濃度的氨基酸、游離肉毒堿、?；舛緣A和琥珀酰丙酮。然后將試樣混合物孵育預(yù)定的一段時(shí)間(例如，約25至約45分鐘(例如，約30至約45分鐘)；約30至約60分鐘；約30至約70分鐘；約30至約90分鐘；約30至約120分鐘；約35至約60分鐘；或約40至約60分鐘)，從而允許提取氨基酸、游離肉毒堿和?；舛緣A以及提取結(jié)合的琥珀酰丙酮并允許所述酮與肼發(fā)生伴隨的反應(yīng)。然后可將提取液轉(zhuǎn)移到微量滴定板的未用過(guò)的孔中，然后通過(guò)串聯(lián)質(zhì)譜法，任選在用于注射試樣的液體處理裝置的輔助下對(duì)試樣進(jìn)行分析。然后將串聯(lián)質(zhì)譜儀上的儀器設(shè)置設(shè)置為以多路模式(multiplexfashion)檢測(cè)所涉及的分別的代謝物(氨基酸、?；舛緣A、肉毒堿和琥珀酰丙酮)以及它們對(duì)應(yīng)的內(nèi)標(biāo)物?？赡苡幸娴氖?，不僅對(duì)所修飾的琥珀酰丙酮(例如MPP)進(jìn)行衍生化，還對(duì)試樣中額外的分析物(例如額外的分析物如氨基酸、?；舛緣A和肉毒堿)進(jìn)行衍生化。本申請(qǐng)所述的多種分析物，包括琥珀酰丙酮相當(dāng)于羧酸；因此，它們適合用于通過(guò)酯化進(jìn)行試樣衍生化。在通過(guò)質(zhì)譜法分析前對(duì)試樣中的多種分析物進(jìn)行酯化的示例性方法描述于圖4中。首先，進(jìn)行如上文類似的操作，然而，可進(jìn)行進(jìn)一步的樣品試樣處理。例如，在用肼進(jìn)行衍生化步驟后，可將試樣蒸發(fā)至干。然后將干燥過(guò)的試樣在烷基醇的酸性溶液中重組。所述醇可以是任何烷基醇，例如，但不限于甲醇、乙醇、丙醇、正丁醇、叔丁醇、戊醇或己醇?？墒乖摯寂c試樣接觸，并結(jié)合強(qiáng)的濃酸(例如，鹽酸或硫酸)。所述烷基醇和酸的溶液可以是例如，丁醇/3NHC1或甲醇/1NHC1。在約39t:(例如，約30°C、約35°C、約36°C、約37°C、約40°C、約42°C、約50°C、約55°C、約60°C或約70°C)可將試樣在所述烷基醇/酸溶液中孵育約30分鐘(例如，約20分鐘、約40分鐘、約45分鐘、約50分鐘、約60分鐘、約70分鐘、約80分鐘、約90分鐘、約100分鐘或約120分鐘)。在該孵育后，可將試樣蒸發(fā)至干，然后在溶劑(例如，乙腈；或乙腈和水(例如，80%乙腈和20%水)、異丙醇(例如80%異丙醇和20%水)或適于質(zhì)譜法分析并能夠溶解酯化的有機(jī)化合物的任何其它溶劑中重組?？捎醚苌?修飾的)琥珀酰丙酮檢測(cè)和/或測(cè)量的額外的分析物包括表1中列出的分析物。表1.分析物名稱縮寫酉同琥珀酰丙酮SA氨基酸丙氨酸Ala精氨酸Arg天冬氨酸Asp天冬酰胺Asn瓜氨酸Cit半胱氨酸Cys甘氨酸Gly谷氨酰胺Gin谷氨酸Glu組氨酸His<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>質(zhì)譜法串聯(lián)質(zhì)譜法可用于檢測(cè)和/或測(cè)量試樣(例如，生物試樣)中的琥珀酰丙酮和一種或多種額外的分析物(例如，游離肉毒堿、酰基肉毒堿和氨基酸)。在串聯(lián)質(zhì)譜法中，將兩臺(tái)質(zhì)譜儀通過(guò)碰撞池(collisioncell)串聯(lián)。第一臺(tái)質(zhì)譜儀(MS-1)用于選擇相關(guān)離子(例如，具有特別荷質(zhì)比(m/z)的離子)。然后將所選擇的離子傳輸?shù)脚鲎渤刂?，在那里它們通過(guò)與惰性氣體碰撞變成碎片。這一過(guò)程被稱為碰撞活化的解離(collisionallyactivateddissociation,CAD))。一旦母體(有時(shí)稱為前體)離子變成碎片，則使用第二臺(tái)質(zhì)譜儀(MS-2)掃描和檢測(cè)所有產(chǎn)生的子離子或選擇和檢測(cè)特別的碎片離子。如附隨的實(shí)施例所詳細(xì)描述的那樣，串聯(lián)質(zhì)譜法用于使衍生化的(修飾的)琥珀酰丙酮的前體分子和若干氨基酸的前體分子電離，使離子成為碎片并檢測(cè)具體特征峰(specificpeaks)，這些特征峰是試樣中這些分子的存在的指示。所述串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)可通過(guò)多種方式實(shí)現(xiàn)。在一種類型的串聯(lián)質(zhì)譜法(通常在三重四極串聯(lián)質(zhì)譜儀(triplequadrupoletandemmassspectrometer)上進(jìn)行)中，變成碎片以產(chǎn)生普通子離子(碎片)的離子可通過(guò)進(jìn)行"先驅(qū)離子掃描"(也稱為母離子掃描)作為一類來(lái)掃描，其中通過(guò)選擇用于MS-2中普通碎片離子的適當(dāng)質(zhì)量，對(duì)產(chǎn)生普通碎片離子的所有離子進(jìn)行檢測(cè)。這種類型的掃描可用于檢測(cè)試樣中的酰基肉毒堿(m/z85的先驅(qū)離子掃描)。在一種不同形式的串聯(lián)質(zhì)譜法中，變成碎片以產(chǎn)生普通中性丟失(Neutralloss)的離子可通過(guò)進(jìn)行所謂的中性丟失掃描作為一類來(lái)掃描，其中通過(guò)設(shè)置與MS-1和MS-2之間的普通中性丟失相等的適當(dāng)質(zhì)量偏移量，對(duì)變成碎片而產(chǎn)生特異性中性丟失的所有離子進(jìn)行檢測(cè)。進(jìn)行這種類型的掃描以檢測(cè)試樣中的氨基酸和琥珀酰丙酮(若將所提取的試樣中分析物修飾為丁酯，為m/zl02的中性丟失，或若沒(méi)有發(fā)生進(jìn)一步分析物修飾，為m/z46的中性丟失)。圖5顯示m/z46的中性丟失掃描為若干氨基酸，而琥珀酰丙酮從相同試樣中檢測(cè)。在m/z155時(shí)觀測(cè)到對(duì)應(yīng)于衍生化的琥珀酰丙酮的獨(dú)特峰，以及對(duì)應(yīng)于氨基酸的若干獨(dú)特峰。由此，琥珀酰丙酮(如本申請(qǐng)所述的衍生化的琥珀酰丙酮)可在單一試樣中在一次分析中與一種或多種額外的分析物一起被檢測(cè)和/或測(cè)量。在稱為多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)的另一種類型的串聯(lián)質(zhì)譜法中，在MS-1中選擇相關(guān)的母離子，在碰撞池中變成碎片，在MS-2中選擇得自碰撞活化的特異性碎片離子，并最后進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)MS-1和MS-2進(jìn)行固定，從而歷時(shí)預(yù)定量的時(shí)間(幾毫秒)分別選擇相關(guān)的相應(yīng)母離子和碎片離子對(duì)。這種特異性母離子-產(chǎn)物離子躍遷可視為一種檢測(cè)通道。若需要檢測(cè)額外的分析物，可在實(shí)驗(yàn)中引入具有特異性質(zhì)量躍遷的額外檢測(cè)通道。可連續(xù)采集來(lái)自所有選擇的質(zhì)量躍遷(通道)的數(shù)據(jù)以獲得期望的信息?；旌衔镏戌牾１?如本申請(qǐng)所述那樣制備的試樣中衍生化的琥珀酰丙酮)的檢測(cè)和定量可通過(guò)采用每種這些化合物的特異性質(zhì)量躍遷(specificmasstransition)如下獲得對(duì)于衍生化的琥珀酰丙酮而言在m/zl55固定MS-1以選擇和傳輸母離子，在m/z109固定MS_2以選擇和傳輸特異性產(chǎn)物離子(通道1或MRM躍遷1);對(duì)于氨基酸如酪氨酸而言在m/zl82固定MS_1以選擇和傳輸母離子，在m/z136固定MS-2以選擇和傳輸特異性產(chǎn)物離子(通道2或MRM躍遷2)。這兩種MRM躍遷可從相同試樣中連續(xù)測(cè)量預(yù)定量的時(shí)間，從而檢測(cè)所述試樣中這些化合物的混合物的存在和/或濃度?？蓪?duì)琥珀酰丙酮(衍生化的琥珀酰丙酮)的穩(wěn)定的同位素標(biāo)記的內(nèi)標(biāo)物加到試樣中，可通過(guò)所述內(nèi)標(biāo)物對(duì)衍生化的琥珀酰丙酮以及琥珀酰丙酮本身進(jìn)行定量。用穩(wěn)定同位素標(biāo)記的衍生化的琥珀酰丙酮的產(chǎn)生了質(zhì)量漂移(massshift)，而保留標(biāo)記的和未標(biāo)記的化合物之間非常類似的理化性質(zhì)?！愕兀蓪⒁环N或多種內(nèi)標(biāo)物按已知濃度加到試樣中，從而允許對(duì)相關(guān)的分析物(例如，琥珀酰丙酮)進(jìn)行定量。例如，對(duì)于利用串聯(lián)質(zhì)譜法進(jìn)行分析的試樣而言，由衍生化的琥珀酰丙酮(例如，MPP)及其相應(yīng)的內(nèi)標(biāo)物產(chǎn)生的信號(hào)比例可用于確定試樣中這些化合物的量。也可加入內(nèi)標(biāo)物以分辨天然存在的(內(nèi)源性)分子。如上所述，在將試樣(例如，血樣)和提取溶液混合前，可在提取溶液中制備所述內(nèi)標(biāo)物?？晒┻x擇地，可在試樣制備的任何步驟中將內(nèi)標(biāo)物加到混合物中，而確保這些內(nèi)標(biāo)物不會(huì)在試樣處理(例如在液液提取或固相提取后)過(guò)程中從混合物中除去。通過(guò)本申請(qǐng)描述的方法檢測(cè)的相關(guān)分析物的內(nèi)標(biāo)物(或其它分子，例如，本申請(qǐng)所述的生物分子)可以是可通過(guò)質(zhì)譜法檢測(cè)的分析物分子的任何修飾形式或類似物。內(nèi)標(biāo)物是基于獨(dú)特的物理性質(zhì)(如獨(dú)特的質(zhì)量或荷質(zhì)比)從分子中單獨(dú)檢測(cè)的。用于質(zhì)譜法的常用內(nèi)標(biāo)物為相關(guān)分析物的穩(wěn)定的同位素標(biāo)記形式或化學(xué)衍生物(例如，若分析物為MPP，則內(nèi)標(biāo)物可為同位素標(biāo)記的MPP)。例如，穩(wěn)定的同位素標(biāo)記的類似物可用于使用稱為同位素稀釋質(zhì)譜法的技術(shù)來(lái)定量相應(yīng)的相關(guān)分析物，其中分析物和內(nèi)標(biāo)物在同一試樣中處理。內(nèi)標(biāo)物可設(shè)計(jì)成這樣1)所述標(biāo)記引起至少1個(gè)質(zhì)量單位的的質(zhì)量漂移以及2)沒(méi)有穩(wěn)定的同位素標(biāo)記位于不穩(wěn)定位點(diǎn)以預(yù)防交換。標(biāo)記可以是、(D)、15N、13C或180或任何組合形式。標(biāo)記在分子上的實(shí)際位置可發(fā)生變化，只要滿足了條件2(上文中)。此外，碎片離子的質(zhì)量中標(biāo)記的位置和電勢(shì)變化也可用于確認(rèn)內(nèi)標(biāo)物和分析物的分離。用于本申請(qǐng)所述的方法中的可能內(nèi)標(biāo)物的實(shí)例包括但不限于同位素標(biāo)記的衍生化的琥珀酰丙酮(例如，3-(5_甲基-lH-吡唑-3-基)丙酸(MPP))、肉毒堿、?；舛緣A或氨基酸(例如，脯氨酸、蛋氨酸或酪氨酸)。幾種類型的質(zhì)譜儀是可獲得的或可用多種配置產(chǎn)生，所有這些都可用于本申請(qǐng)所述的方法中。一般而言，質(zhì)譜儀具有以下主要組件進(jìn)樣口、離子源、碰撞池、質(zhì)量分析儀、檢測(cè)器、真空系統(tǒng)和儀器控制系統(tǒng)以及數(shù)據(jù)系統(tǒng)。進(jìn)樣口、離子源和質(zhì)量分析儀的差異通常限定了儀器的類型及其能力。例如，進(jìn)口可以是毛細(xì)管柱液相色譜源，或可為例如用于基質(zhì)輔助的激光解吸(matrix-assistedlaserdesorption)中的直接探針或鏡臺(tái)。常見離子源為例如，電噴霧，包括納米噴霧(nanospray)和微量噴霧(microspray)或基質(zhì)輔助的激光解吸。常見的質(zhì)譜儀包括四極質(zhì)量濾器、飛行時(shí)間質(zhì)量分析儀(優(yōu)選為正交加速飛行時(shí)間質(zhì)量分析儀)、離子阱質(zhì)量濾器(iontr即massfilter)、扇形磁場(chǎng)分析儀(magneticsectoranalyser)，或傅里口十變換離子回方定力口速器(FourierTransformIonCyclotronResonance(〃FTICR〃))質(zhì)量分析儀。所述碰撞池可以是例如，四級(jí)桿裝置、六極桿裝置或八極桿裝置。所述碰撞池優(yōu)選形成與離子進(jìn)口和離子出口隔離的基本上氣密的外殼?？蓪⑴鲎矚怏w如氦、氬、氮?dú)?、空氣或甲烷引入到碰撞池中。本申?qǐng)描述的具體實(shí)施例使用串聯(lián)質(zhì)譜儀進(jìn)行(參見例如，附隨的實(shí)施例)。試樣用于本申請(qǐng)所述方法的合適試樣包括任何生物學(xué)流體、細(xì)胞、組織或它們的級(jí)份，其包括作為代謝狀態(tài)(例如，特征為琥珀酰丙酮水平改變的代謝性疾病，如遺傳性I型酪氨酸血癥)指示的生物分子。試樣可以是例如，獲自受試者(例如，哺乳動(dòng)物如人)的標(biāo)本，或可從所述受試者得到。例如，試樣可以是由活組織檢查(biopsy)獲得的組織切片，或置于組織培養(yǎng)基中或適于組織培養(yǎng)的細(xì)胞。因此示例性試樣包括培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞、培養(yǎng)的羊水細(xì)胞和絨膜絨毛取樣(chorionicvillussample)。試樣也可以是生物學(xué)流體標(biāo)本如尿、血液、血漿、血清、唾液、精液、痰(sputum)、腦脊髓液(cerebralspinalfluid)、眼淚、粘液等。期望時(shí)，可將試樣進(jìn)一步分級(jí)為含有具體細(xì)胞類型的級(jí)份。例如，可將血樣分級(jí)成血清或分級(jí)成含有具體類型的血細(xì)胞(如紅細(xì)胞或白血病(白血球))的級(jí)份。期望時(shí)，試樣可以是來(lái)自受試者的試樣的組合，如組織和流體試樣的組合等。保持試樣中分子的活性或完整性的獲得試樣的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。所述方法包括使用適當(dāng)?shù)木彌_液和/或抑制劑，包括核酸酶抑制劑、蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑，其使試樣中的分子得到保持或使分子的變化最小。所述抑制劑包括例如，螯合劑如乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二醇二(P-氨基乙基醚)N，N，Nl，Nl-四乙酸(EGTA)，蛋白酶抑制劑如苯甲磺酰氟(PMSF)、抑肽酶、亮肽素、抗痛素等，以及磷酸酶抑制劑如磷酸鹽、氟化鈉、釩酸鹽等。用于分離分子的適當(dāng)緩沖液和條件是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，并且可根據(jù)例如試樣中分子的類型來(lái)變化(參見例如，Ausubeletal.CurrentProtocolsinMolecularBiology(Supplement47)，JohnWiley&Sons，NewYork(1999);HarlowandLane，Antibodies:ALaboratoryManual(ColdSpringHarborLaboratoryPress(1988);HarlowandLane，UsingAntibodies:ALaboratoryManual，ColdSpringHarborPress(1999);TietzTextbookofClinicalChemistry,3rded.BurtisandAshwood，eds.W.B.Saunders,Philadelphia,(1999))。也可對(duì)試樣進(jìn)行處理以消除干擾物或使干擾物的存在最小化。就用于本申請(qǐng)所述的方法而言，試樣可呈各種物理狀態(tài)。例如，試樣可以為液體或固體，可溶于或懸浮于液體中，可呈乳液或凝膠形式，并可吸附在物質(zhì)上。作為非限制性實(shí)例，試樣可以是液態(tài)血樣、液態(tài)血清試樣、液態(tài)白細(xì)胞試樣、干燥過(guò)的血液、干燥過(guò)的血清或干燥過(guò)的白細(xì)胞試樣，或吸附在紙上或聚合物基質(zhì)上的所述試樣。示例性應(yīng)用本申請(qǐng)所述的方法可用于對(duì)試樣(例如來(lái)自受試者如人的試樣)獲得分子分布。所述分布可包括指示琥珀酰丙酮或琥珀酰丙酮和其它生物學(xué)分析物如氨基酸是否存在的信息，并且通常包括關(guān)于琥珀酰丙酮(和一種或多種額外的生物分析物)的存在(定性的或定量的)的信息。在這些質(zhì)譜法的一些應(yīng)用中，可獲得受試者(例如，人)的代謝分布。例如，所述分布可包括受試者(例如，人類患者)中琥珀酰丙酮的水平。也可利用串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)生物試樣中的其它生物分子進(jìn)行檢測(cè)、定量和/或評(píng)價(jià)，這些生物分子包括例如，一種或多種氨基酸、游離肉毒堿、?；舛緣A。得到的信息(代謝分布)可用于評(píng)價(jià)受試者(例如，人類患者)的健康狀態(tài)，如代謝性疾病(例如，氨基酸病、脂肪酸或有機(jī)酸病癥，或與琥珀酰丙酮的水平改變相關(guān)的代謝性疾病(例如，遺傳性I型酪氨酸血癥))的存在或不存在，或用于評(píng)價(jià)所述病癥的危險(xiǎn)。氨基酸病的實(shí)例包括但不限于精氨酸血癥，精氨基琥珀酸尿(精氨基琥珀酸裂解酶缺乏/精氨琥珀酸酶缺乏)、瓜氨酸血癥(精氨琉王白酸合成醇缺乏(argininosuccinicacidsynthetasedeficiency)/精氛基琉王白酸合成酶缺乏(argininosuccinatesynthetasedeficiency))、同型胱氨酸血癥、胱硫醚合成酶缺乏(cystathionesynthasedeficiency)、高蛋氨酸血癥、高鳥氨酸血癥、高氨血(hyperammonemia)、超均瓜氨酸尿綜合征(hyperhomocitrulli皿riasyndrome)、鳥氨酸易位酶缺乏、血脯氨酸過(guò)多(hyperprolinemia)、槭糖漿尿病(M即leSyrupUrineDisease)(支鏈酮酸尿)、非酮性高甘氨酸血癥(nonketotichyperglycinemia)、苯丙酮酸尿(phenylketonuria)、焦谷氨酸血癥/六氫吡啶羧酸血癥(pyroglutamic/pipecolicacidacademia)、酪氨酸血癥(I型)、酪氨酸血癥(II型)、5-羥脯氨酸血尿或焦谷氨酸尿。脂肪酸和有機(jī)酸病癥的實(shí)例包括例如，2-甲基丁酰輔酶A脫氫酶缺乏、2，4-二烯酰輔酶A還原酶缺乏、3-羥基-3-甲基戊二烯輔酶A裂解酶缺乏(羥甲基戊二酸血癥)、3-甲基丁烯酰輔酶A羧化酶缺乏(3-甲基巴豆酰甘氨酸血癥)、肉毒堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶(I型)缺乏、肉毒堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶(II型)缺乏、肉毒堿運(yùn)載體缺乏、肉毒堿/?；舛緣A易位酶缺乏、乙基丙二酸血癥、戊二酸血癥(I型；戊二酰輔酶A脫氫酶缺乏)；異丁酰輔酶A脫氫酶缺乏、異戊酸血癥、長(zhǎng)鏈酰基輔酶A脫氫酶缺乏、長(zhǎng)鏈羥基?；o酶A脫氫酶缺乏、丙二酸尿、中鏈?；o酶A脫氫酶缺乏、甲基丙二酸血癥、線粒體乙酰?；o酶A硫解酶缺乏(B-酮硫解酶缺乏)、多種酰基輔酶A脫氫酶缺乏(戊二酸血癥，II型)、多種輔酶A羧化酶缺乏(羧化全酶合成酶缺乏)、丙酸血癥、短鏈?；o酶A脫氫酶缺乏、短鏈羥基乙烯輔酶A脫氫酶缺乏、三官能蛋白缺乏和極長(zhǎng)鏈酰基輔酶A脫氫酶缺乏。額外的代謝性疾病描述于例如，Chaceetal.(2001)ClinicalChemistry47:1166-82;Rashedetal.Q997)ClinicalChemistry43(7):1129-41;Schulzeetal.(2003)Pediatrics111(6):1399-1406;andZytkoviczetal.(2001)ClinicalChemistry47(11):1945-55中。I型酪氨酸血癥(例如，遺傳性I型酪氨酸血癥)，例如，是由延胡索酰乙酰乙酸酶(fumarylacetoacetase)活性的缺乏引起的，這種缺乏導(dǎo)致乙酰乙酸酶的蓄積(圖1)。延胡索酰乙酰乙酸被其它酶快速轉(zhuǎn)化為琥珀酰丙酮，由此患有I型酪氨酸血癥的患者在其血液中蓄積琥珀酰丙酮。因此，單獨(dú)檢測(cè)琥珀酰丙酮或一起檢測(cè)檢測(cè)琥珀酰丙酮和其它生物分子(例如，代謝性生物分子)的能力可用于評(píng)價(jià)受試者的健康狀態(tài)。因此，可能的是，同時(shí)檢測(cè)試樣中的其它氨基酸如酪氨酸和蛋氨酸，以及其它生物分子如游離肉毒堿和酰基肉毒堿，這種檢測(cè)例如通過(guò)在質(zhì)譜法分析中鑒定所述分子的獨(dú)特峰來(lái)進(jìn)行。表1包括可使用本申請(qǐng)所述的方法用琥珀酰丙酮(通過(guò)衍生化的琥珀酰丙酮)來(lái)檢測(cè)/測(cè)量的分析物(例如，生物分子)的非窮舉性列舉。由本申請(qǐng)所述的方法獲得的代謝分布可用于診斷或預(yù)測(cè)各種代謝性疾病的易感性(susc印tibility)，因?yàn)樗鶛z查的生化指示劑(例如，琥珀酰丙酮)可以是所述病癥的指示，無(wú)論這些病癥的生理學(xué)癥狀或行為癥狀是否變得明顯(例如，懷疑患有代謝性疾病如氨基酸病(例如，I型酪氨酸血癥)的人)。本申請(qǐng)所述的代謝分布可用于監(jiān)測(cè)受試者(例如，哺乳動(dòng)物如人)例如進(jìn)行代謝性疾病治療的受試者的代謝。作為非限制性實(shí)例，所述方法可用于確定具體治療的治療效果(例如，將琥珀酰丙酮的水平恢復(fù)至生理水平的治療的能力)?；谶@種測(cè)定，所述受試者可被提供額外的或供選的治療選擇。所述代謝分布也可用于評(píng)價(jià)患者對(duì)具體治療方式如飲食限制(例如，將琥珀酰丙酮的水平恢復(fù)至生理水平的飲食方案的效力)的順應(yīng)性。因此，本申請(qǐng)所述的技術(shù)適用于篩查、診斷、預(yù)測(cè)、監(jiān)測(cè)治療和順應(yīng)性(compliance)，并且確定名單所列的兩種或多種生物分子(如琥珀酰丙酮和一種或多種氨基酸、游離肉毒堿或?；舛緣A)的存在或量的任何其它應(yīng)用都是有用的。使用本申請(qǐng)所述的方法產(chǎn)生的代謝分布可使用多種生物試樣獲得。合適的試樣包括上述的那些。在一個(gè)方面，如本申請(qǐng)所述的代謝分布可用于評(píng)價(jià)代謝性疾病如氨基酸病(例如，I型酪氨酸血癥)的存在或不存在。所有年齡的受試者都有可能被使用本申請(qǐng)所述的代謝分布診斷的代謝性疾病感染。因此，在本申請(qǐng)所述的方法中使用的試樣可從任何年齡的受試者(例如，人)獲得，包括嬰兒(neonate)、新生兒(newborn)、幼兒(baby)、兒童和成人，如患有或懷疑患有酪氨酸血癥的懷孕的女性和個(gè)體。所述方法也可用于面臨感染代謝性疾病危險(xiǎn)的個(gè)體。所述個(gè)體包括具有以下情況的個(gè)體(i)所述病癥的家族史(遺傳傾向)或(ii)發(fā)展所述病癥的一種或多種危險(xiǎn)因子。如果在母體試樣如羊水、孕婦外周血或血漿中琥珀酰丙酮或至少一種額外分析物(例如，一種或多種氨基酸、游離肉毒堿或酰基肉毒堿)水平的變化是明顯的，所述方法也可用于產(chǎn)前診斷。所述方法還可用于監(jiān)測(cè)具有與琥珀酰丙酮水平改變相關(guān)的健康狀況的個(gè)體中琥珀酰丙酮水平，所述個(gè)體如進(jìn)行肝移植的個(gè)體。本申請(qǐng)所述的方法涉及檢測(cè)琥珀酰丙酮和一種或多種額外的生物分析物(例如，氨基酸、游離肉毒堿或酰基肉毒堿)的存在或量，其中每種生物分子的存在或量與代謝性疾病的存在或不存在相關(guān)。期望時(shí)，本申請(qǐng)所述的方法可定量使用，從而允許對(duì)試樣結(jié)果與已知的或一種或多種預(yù)定標(biāo)準(zhǔn)量的具體分析物進(jìn)行比較(例如，通過(guò)使用上文所述的內(nèi)標(biāo)物)。當(dāng)將試樣與參比試樣(其可以是正常的參比或代謝性疾病參比)進(jìn)行比較時(shí)，所述方法也可定量使用。在這種形式中，生物分子的相對(duì)量可為代謝性疾病的指示。參比試樣，例如，可來(lái)自以下受試者，所述受試者患有、并不被懷疑患有病癥(如代謝性疾病如氨基酸病(例如，I型酪氨酸血癥))或并不面臨發(fā)展所述病癥的危險(xiǎn)?！愣?，針對(duì)通常測(cè)試的分析物和酶，給定生物分子的截止值(cut-offvalue)可發(fā)生變化，并且在本領(lǐng)域是已知的。本領(lǐng)域已知的常規(guī)的明顯的適應(yīng)(ad即tation)可用于建立不常見測(cè)試分析物的截止值。截止值通常為生物分子的量，或與另一種生物分子的比例，在所述截止值之上或之下所述生物分子被視為代謝性疾病的指征或再檢驗(yàn)的起因。由此，根據(jù)本申請(qǐng)所述的技術(shù)，具體試樣類型中至少一種生物分子的參比水平鑒定為截止值，在大于截止值時(shí)在至少一種生物分子的存在和代謝性疾病的存在(或不存在)之間有著顯著關(guān)聯(lián)。應(yīng)該理解生物分子名單可解釋為整體、部分或基于分析物-分析物(analyte_by_analyte)角率釋。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該認(rèn)識(shí)到一些截止值不是絕對(duì)的，因?yàn)樵谒鼋刂怪档娜我欢说闹涤蚍秶信R床關(guān)聯(lián)仍然是顯著的；然而，可能的是針對(duì)具體試樣類型選擇生物分子的最佳截止值(例如變化的H得分(H-score)等)。通常將所確定的用于本申請(qǐng)所述方法的截止值與公開的范圍進(jìn)行比較，但可將其個(gè)體化以適應(yīng)所用的方法學(xué)和患者群體的需要。應(yīng)該理解最佳截止值的改進(jìn)可根據(jù)所用的統(tǒng)計(jì)方法的復(fù)雜化(sophistication)以及用于確定不同生物分子和試樣類型參比水平值的試樣的數(shù)目和來(lái)源來(lái)確定。因此，可根據(jù)周期再評(píng)價(jià)(periodicre-evaluation)或方法學(xué)的變化或總體分布對(duì)所建立的截止值進(jìn)行上調(diào)或下調(diào)。此外，期望時(shí)可使用儀器特異性截止值，例如當(dāng)儀器間性能相似性>10%時(shí)。參比水平可由各種方法確定，只要得到的參比水平精確地提供了每種生物分子的量，在大于所述量時(shí)存在第一組受試者(例如，人)，所述受試者患代謝性疾病的概率不同于具有低于參比水平的代謝分析物或酶活性量的第二組受試者的患病概率。參比水平可如下確定對(duì)例如患有相同代謝性疾病的各種群受試者(例如，患者)中生物分子的量進(jìn)行比較。這可通過(guò)例如直方圖分析來(lái)實(shí)現(xiàn)，在直方圖分析中，患者的全部同齡組以圖解方式表現(xiàn)，其中第一軸代表生物分子的量，第二軸代表在給定量時(shí)其試樣含有一種或多種生物分子的同齡組中受試者的數(shù)目。兩個(gè)或多個(gè)分別的受試者組可如下確定鑒別具有相同或類似生物分子水平的同齡組的種群的亞組。然后可基于最能分辨這些分別的組的量來(lái)進(jìn)行參比水平的確定。參比水平可以是單一的數(shù)，其同樣適用于每個(gè)受試者，或參比水平可根據(jù)受試者的具體亞群而變化。例如，就同一代謝性疾病而言，年長(zhǎng)的受試者可能具有不同于年輕受試者的參比水平。此外，患有更多重病(例如，代謝性疾病的更嚴(yán)重形式)的受試者可具有不同于患有所述疾病的輕度形式的受試者的參比值。所述方法也可用于確定其它生物學(xué)活性的酮例如類固醇的存在或量。例如，本申請(qǐng)所述的方法可用于檢測(cè)獲自受試者(例如，人類患者)的生物試樣中類固醇的存在或量，所述方法可用于診斷或產(chǎn)生代謝分布，所述代謝分布用于診斷與類固醇水平改變相關(guān)的一種或多種病癥，例如，21-0H缺乏、1lb-0H缺乏、鹽耗(saltwasting)21-0H缺乏、腎上腺癌、腎上腺增生、垂體功能減退、醛固酮合成酶缺乏、腎上腺皮質(zhì)病癥、絕經(jīng)或懷孕。，船白翻瞧，仆洽麵誠(chéng)本申請(qǐng)還提供了鑒定在細(xì)胞中調(diào)節(jié)(例如，降低)琥珀酰丙酮水平的化合物的方法。所述化合物可調(diào)節(jié)琥珀酰丙酮和多種額外的生物分子例如，但不限于游離肉毒堿、酰基肉毒堿和氨基酸(例如，脯氨酸、蛋氨酸或酪氨酸)。如上文所討論的那樣，因?yàn)槭д{(diào)的(例如，升高的)琥珀酰丙酮水平與某些病癥(例如，氨基酸病)的增加的危險(xiǎn)相關(guān)，如此鑒定的化合物可用于治療氨基酸病如I型酪氨酸血癥。可與候選化合物接觸的細(xì)胞可以是任何物種的細(xì)胞，只要所述細(xì)胞產(chǎn)生琥珀酰丙酮(無(wú)論是合成的還是天然的)。所述細(xì)胞可以是原代細(xì)胞或細(xì)胞系并可以是任何組織學(xué)類型的細(xì)胞，例如而不限于上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、淋巴樣細(xì)胞、巨噬細(xì)胞/單核細(xì)胞、粒細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞(neuronalcell)或肌細(xì)胞。所述細(xì)胞可在組織培養(yǎng)皿中培養(yǎng)。通常優(yōu)選的是在多孔測(cè)定板(例如，96孔或384孔測(cè)定板)中培養(yǎng)細(xì)胞，從而可一次性評(píng)價(jià)多種候選化合物。可將候選化合物(任選為不同的濃度范圍例如，O.001nM至10mM)加到含有細(xì)胞的溶液(例如，培養(yǎng)基)中，或者當(dāng)所述化合物為蛋白質(zhì)時(shí)，所述細(xì)胞可重組表達(dá)該蛋白質(zhì)。在孵育表達(dá)琥珀酰丙酮的細(xì)胞后，可使用本申請(qǐng)所述的試樣制備(提取)方法和串聯(lián)質(zhì)譜法確定琥珀酰丙酮的存在或水平。在檢測(cè)前，可將細(xì)胞在允許制備試樣的條件下溶解，該條件與本申請(qǐng)所述的提取方法和串聯(lián)質(zhì)譜法相容。通?？蓪⒆鳛殛?yáng)性對(duì)照或陰性對(duì)照的對(duì)照化合物加到一組細(xì)胞中。本申請(qǐng)所述的任何方法中鑒定的化合物包括各種化學(xué)種類?；衔锟梢允巧锓肿樱ǖ幌抻陔?、多肽、肽模擬物(例如，類肽)、氨基酸、氨基酸類似物、糖、脂肪酸、類固醇、嘌呤類、嘧啶類、它們的衍生物或結(jié)構(gòu)類似物、多核苷酸和多核苷酸類似物。化合物可以是小分子化合物或大分子化合物。通過(guò)使用本申請(qǐng)所述的各種信息庫(kù)鑒定測(cè)試化合物允許隨后對(duì)測(cè)試化合物"目的化合物(hit)"或"先導(dǎo)化合物(lead)"進(jìn)行修飾以優(yōu)化"目的化合物"或"先導(dǎo)化合物"調(diào)節(jié)細(xì)胞中琥珀酰丙酮水平的能力?？蓪?duì)本申請(qǐng)所述的方法進(jìn)行改良以鑒定調(diào)節(jié)生物學(xué)活性的酮(如類固醇或本申請(qǐng)所述的任何生物學(xué)活性的酮)水平的化合物。試劑盒本申請(qǐng)還提供了試劑盒，其用于制備用來(lái)檢測(cè)和/或測(cè)量(利用串聯(lián)質(zhì)譜法)試樣(如干燥過(guò)的血樣或本申請(qǐng)所述的任何試樣)中琥珀酰丙酮以及多種其它分析物(例如，氨基酸、游離肉毒堿和?；舛緣A)的試樣。所述試劑盒可用于在單次步驟中從試樣(例如，血斑)中提取琥珀酰丙酮以及一種或多種額外的分析物(例如，氨基酸、?；舛緣A和肉毒堿)，從而使提取物中琥珀酰丙酮和額外的分析物(例如，氨基酸、肉毒堿和酰基肉毒堿)的濃度反映它們?cè)谠嚇又械南鄳?yīng)濃度(或比例)。所述試劑盒可用于制備試樣，從而同時(shí)篩選琥珀酰丙酮、丙氨酸、精氨酸、瓜氨酸、甘氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、鳥氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、纈氨酸和酰基肉毒堿，如C0、C2、C3、C3DC/C40H、C4、C4DC/C50H、C5、C5:1.C5DC/C60H、C6、C6DC/C70H、C8、C8:l、CIO、C10:l、C10:2、C12、C12:l、C14、C14:l、C14:2、C140H、C16、C16:1、C160H、C16:IOH、C18、C18:1、C18:2、C180H、C18:IOH(參見表1)。所述試劑盒可包括用于隨后質(zhì)譜分析的一種或多種內(nèi)標(biāo)物和/或?qū)φ?。例如，所述試劑盒可包括作為?duì)照的琥珀酰丙酮(SA)和作為內(nèi)標(biāo)物的標(biāo)記的(例如，同位素標(biāo)記的)SA的衍生化形式(例如，3，4，5，6，7-13(:5-(3-(5-甲基-lH-吡唑-3-基)丙酸(MPP))。琥珀酰丙酮和/或衍生化的琥珀酰丙酮可分別在所述試劑盒中以液體或干燥過(guò)的(例如，凍干的)形式存在。琥珀酰丙酮和/或衍生化的琥珀酰丙酮可按以下的量提供約1毫摩爾(例如，約1.5毫摩爾、約2毫摩爾、約2.5毫摩爾、約3.0毫摩爾、約3.5毫摩爾、約4.0毫摩爾、約4.5毫摩爾或約5毫摩爾)。所述試劑盒可包括琥珀酰丙酮或衍生化的琥珀酰丙酮(例如，MPP)，它們位于含有一種或多種額外對(duì)照或內(nèi)標(biāo)物的容器中。例如，所述試劑盒可包括含有琥珀酰丙酮對(duì)照、一種或多種氨基酸對(duì)照，和一種或多種肉毒堿(例如，游離肉毒堿和?；舛緣A)對(duì)照的容器。所述試劑盒也可包括作為對(duì)照的脯氨酸，和作為內(nèi)標(biāo)物的穩(wěn)定標(biāo)記的(例如，同位素標(biāo)記的)脯氨酸。所述試劑盒也可包括強(qiáng)堿如肼，例如，二鹽酸肼或本申請(qǐng)所述的任何其它強(qiáng)堿。所述堿可在溶液中按以下濃度提供小于約0.5%(例如，小于約0.05%、小于約0.06%、小于約0.07%、小于約0.08%、小于約0.09%、小于約0.1%、小于約0.15%、小于約0.2%、小于約0.25%、小于約0.3%、小于約0.35%、小于約0.4%、小于約0.45%或小于約0.475%)。包括在所述試劑盒中的一種或多種溶液可貯存在例如硅烷化玻璃小瓶中。試劑盒的一種或多種組分可貯存在這樣的容器中，其防止物質(zhì)的損失或溶劑的蒸發(fā)或使物質(zhì)的損失或溶劑的蒸發(fā)最小化。例如，所述容器可用隔膜密封。所述試劑盒可包括例如，用作對(duì)照的干燥過(guò)的血液(例如，血漿、淋巴)斑點(diǎn)。例如，干燥過(guò)的血斑可富集一種或多種分析物(例如，一種或多種已知濃度的分析物)如琥珀酰丙酮、一種或多種氨基酸、游離肉毒堿或一種或多種?；舛緣A。所述試劑盒也可任選包括提取溶液如本申請(qǐng)所述的任何提取溶液。所述提取溶液可含有Cl-3直鏈或支鏈一元醇和強(qiáng)堿。所述試劑盒也可包括一種或多種含有例如乙腈或異丙醇的溶劑溶液。所述溶劑溶液也可含有水，例如，含有80%乙腈和20%水的溶劑溶液。在一些實(shí)施方案中，所述試劑盒也可包括一種或多種組分，所述組分用于測(cè)試試樣中生物素酰胺酶(biotinidase)活性以及用于測(cè)試受試者中溶酶體貯存病癥(lysosomalstoragedisorder)或半乳糖血癥的存在。然后可將所述試劑盒用于檢測(cè)新生兒血液中升高的或降低的琥珀酰丙酮、氨基酸、游離肉毒堿或?；舛緣A水平，用于針對(duì)若干代謝性疾病中的一種或多種。例如，升高的琥珀酰丙酮水平可指示I型酪氨酸血癥。游離肉毒堿和?；舛緣A是通常分類為脂肪酸氧化(FA0)病癥有機(jī)酸尿病癥(OAD)的標(biāo)志物。類似地，氨基酸用作統(tǒng)稱為氨基酸病的若干代謝性疾病的標(biāo)志物。這些病癥是先天性代謝缺陷(或遺傳性代謝缺陷)。應(yīng)該理解，實(shí)質(zhì)上并不影響本發(fā)明各種實(shí)施方案的作用的修改也包括在本申請(qǐng)?zhí)峁┑陌l(fā)明的定義中。因此，以下實(shí)施例旨在闡述而不是限制本發(fā)明。實(shí)施例實(shí)施例1使用獲自受試者的全血制備參比標(biāo)準(zhǔn)血液(全血)斑點(diǎn)。對(duì)血液如下處理將血紅蛋白濃度調(diào)節(jié)至17mg/dL，向血液中加入已知濃度的若干氨基酸、肉毒堿、?；舛緣A和琥珀酰丙酮。將經(jīng)處理的血液分配到濾紙卡上，從而在濾紙基質(zhì)上形成血斑。每個(gè)血斑是通過(guò)分配75iiL經(jīng)處理的血液而產(chǎn)生的。將血斑干燥過(guò)夜。將干燥過(guò)的血斑的小圓片(1/8")穿孔，然后置于微量滴定板的孔中。試樣如下提取調(diào)配lOOiiL提取溶液，其由甲醇和水的混合物構(gòu)成，相對(duì)體積-體積比例大約為78%甲醇和22%水。此外，提取溶液含有3mM草酸和濃度為600iiM的二鹽酸肼。用于若干氨基酸、肉毒堿、酰基肉毒堿和琥珀酰丙酮(MPP)的內(nèi)標(biāo)物(相關(guān)分析物的穩(wěn)定重同位素類似物)也存在于提取溶液中。包括在溶液中的內(nèi)標(biāo)物在圖5所示的串聯(lián)質(zhì)譜法掃描中指明。在自動(dòng)液體處理裝置的輔助下，將提取的試樣注射到電噴射三重四級(jí)串聯(lián)質(zhì)譜儀中。通過(guò)46次掃描的中性丟失獲得氨基酸和琥珀酰丙酮(MPP)的質(zhì)譜數(shù)據(jù)。實(shí)施例2.含有已知濃度的若干氨基酸、肉毒堿、酰基肉毒堿和琥珀酰丙酮的血斑如上制備(實(shí)施例l)。將干燥過(guò)的血斑的小圓片(1/8")穿孔，然后置于微量滴定板的孔中。試樣在內(nèi)標(biāo)物存在下如上所述提取。提取后，將試樣蒸發(fā)至干。然后將干燥過(guò)的試樣在3NHC1/正丁醇中重組，然后在39t:孵育約30分鐘。該次孵育后，將試樣再次蒸發(fā)至干，然后在乙腈和水的溶液中重組。在自動(dòng)液體處理裝置的輔助下，將提取的試樣注射到電噴射三重四級(jí)串聯(lián)質(zhì)譜儀中。在102次掃描的中性丟失采集數(shù)據(jù)。丁酯形成的證據(jù)為，由這種酯化(圖6)使離子的m/z增加了56道爾頓(Da)(交叉參考圖5)。這些數(shù)據(jù)顯示在對(duì)琥珀酰丙酮(如本申請(qǐng)所述)進(jìn)行衍生化之后，需要時(shí)可進(jìn)一步處理(例如，酯化)試樣，以檢測(cè)其它分析物組成。實(shí)施例3.干燥過(guò)的血斑如上制備。將血斑用表2和表3所示的不同水平的分析物(氨基酸、琥珀酰丙酮(SA)、游離肉毒堿和?；舛緣A)穿剌。血斑如上所述提取(實(shí)施例1;表中指明的每種分析物的定義參見表1)。在自動(dòng)液體處理裝置的輔助下，將提取的試樣注射到電噴射三重四級(jí)串聯(lián)質(zhì)譜儀中。通過(guò)m/z46次掃描的中性丟失獲得氨基酸和琥珀酰丙酮(MPP)的質(zhì)譜數(shù)據(jù)，通過(guò)m/z85次掃描先驅(qū)離子獲得肉毒堿和?；舛緣A的質(zhì)譜數(shù)據(jù)?；厥盏母鞣N分析物的百分?jǐn)?shù)通過(guò)與每種分析物的內(nèi)標(biāo)物進(jìn)行比較來(lái)確定。各種百分比回收率顯示于表2中，精確的各種水平顯示于表3中。不精確性的確定通過(guò)分析表3中所述的試樣來(lái)確定。每種試樣運(yùn)行包括對(duì)每種試樣進(jìn)行三次穿孔，所述試樣如實(shí)施例1所述來(lái)處理和測(cè)量。該研究每天包括兩次這樣的運(yùn)行，共5天。有了這種信息，確定以下的不精確性組成運(yùn)行中、運(yùn)行間_日中和日間的不精確性，由此確定總的不精確性。不精確性的結(jié)果于表3中。這些數(shù)據(jù)顯示，本申請(qǐng)所述的方法可用于利用串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)提取和定量MPP、氨基酸、肉毒堿和?；舛緣A。實(shí)施例4.酪氨酸目前用作篩查I型酪氨酸血癥的診斷標(biāo)志物。為了顯示檢測(cè)到，與酪氨酸相比，琥珀酰丙酮導(dǎo)致用于確定個(gè)體中I型酪氨酸血癥狀態(tài)的特異性增加，針對(duì)相關(guān)酪氨酸和琥珀酰丙酮(MPP)濃度，將來(lái)自被感染的患者(即，I型酪氨酸血癥陽(yáng)性患者)的血樣與已知正常試樣進(jìn)行比較。來(lái)自健康新生兒的干燥過(guò)的血斑和來(lái)自證實(shí)患有I型酪氨酸血癥的新生兒干燥過(guò)的血斑在25小時(shí)齡和14日齡獲得。如上所述提取血斑并進(jìn)行質(zhì)譜分析(實(shí)施例l)。然而被感染的患者在25小時(shí)齡(新生兒篩查床)顯示正常的酪氨酸水平，直到患者14日齡時(shí)酪氨酸水平才顯著升高(圖7光譜和圖8;表和條形圖)。相反，琥珀酰丙酮(MPP)在甚至出生后25小時(shí)就顯示非常顯著的升高(偏離正常中值的30-40標(biāo)準(zhǔn)誤差)。由此，在25小時(shí)齡時(shí)，若酪氨酸不是唯一使用的標(biāo)志物，則這種患者將為假陰性。因此針對(duì)I型酪氨酸血癥的早期檢測(cè)是關(guān)鍵的，檢測(cè)琥珀酰丙酮對(duì)針對(duì)這種病癥而言是非常有益的。實(shí)施例6.本申請(qǐng)所述的許多方法使用強(qiáng)堿與琥珀酰丙酮形成席夫堿，從而使其可被提取和測(cè)量。肼可呈若干形式獲得，例如，水合肼或二鹽酸肼。然而這兩種形式在本申請(qǐng)所述的方法中都有類似的表現(xiàn)，為了測(cè)試這兩種形式中哪種是最穩(wěn)定的并由此具有最長(zhǎng)的貯存期限，歷時(shí)約60天的時(shí)間跨度來(lái)測(cè)試每種形式的相對(duì)穩(wěn)定性。將每種形式的肼溶液(水合肼為0.5%，二鹽酸肼為0.1%)在3(TC孵育，并且在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)(例如，1至約60天)，由標(biāo)準(zhǔn)化熒光測(cè)定法來(lái)確定每種肼形式的量。水合肼被確定為不穩(wěn)定的，而二鹽酸肼被確定為更穩(wěn)定的，由此更適于堅(jiān)固的產(chǎn)物(圖9)。0103]表2.干燥過(guò)的血液中各種分析物的回收率百分?jǐn)?shù)穿剌回收率穿剌回收率穿剌回收率穿剌回收率05](uM)(uM)(uM)(uM)06]ALA8l6764477145078326l9007]ARG79706357l14297l32168008]CI／3l9025l865648312709209]GLY838366579149578336488LEU45683577080370180779SA4722969656614776ORN6810054494122392275210lPHE4210l33799759991708109PRO639650794114l922567104／YR549443l939699l218l102VAL4l783248373083164293CO4510l3629481492183l102C214791107724875557830120]C31.7721473317170810121]C41.3711068246653750122]C51.2801076217448820123]C5DC0.5102497995211040124]C61.2831080217748870125]C80.880776157333800126]C100.58548097820880127]C120.982778157535850128]C140.887684148331920129]C161.5841282288162900130]C180.590479108022880131]l量的濃度)-(內(nèi)源性濃度)刺穿的濃度x100表3.總不精確件.測(cè)量的％CV:的％cv:的％cv:的％cvALAARGCITGLYLEUMETSA0RNPHEPROTYRVALCOC2C3C4C5C5DCC6C8CIOC12567.18604.19709.981104.2730.0751.17135.66476.8729.11139.71081.68243.99327.110359.09463.18867.09185.67201.27251.86447.1627.2733.5857.07152.370.8251.7215.41220.510127.27152.57254.66637.2784.77102.28166.37419.58275.59304.49398.96763.4983.88104.17182.07482.87206.28222.98278.67489.2851.0767.97134.98390.0636.4742.0860.87134.673.394.0116.3815.390.3110.7102.288.3100.3110.6102.077.470.2130.4121.2104.280.1120.5102.087.780.1130.491.385.070.1120.3100.993.370.1100.481.576.0C140.2100.481.475.37C162.282.774.6612.28C182.172.362.965.510總％CV包括:運(yùn)行中、運(yùn)行間-日中和日間的不精確性。其它實(shí)施方案包括在所附的權(quán)利要求的范圍中。權(quán)利要求檢測(cè)琥珀酰丙酮的方法，所述方法包括使試樣與包含甲醇和強(qiáng)堿的提取溶液接觸；對(duì)試樣中的琥珀酰丙酮進(jìn)行衍生化；以及利用串聯(lián)質(zhì)譜法評(píng)價(jià)衍生的試樣中的衍生化的琥珀酰丙酮。2.檢測(cè)琥珀酰丙酮的方法，所述方法包括使試樣與包含甲醇和肼的提取溶液接觸；將試樣中的琥珀酰丙酮衍生為3-(5-甲基-lH-吡唑-3-基)丙酸(MPP);以及利用串聯(lián)質(zhì)譜法評(píng)價(jià)衍生的試樣中的MPP。3.權(quán)利要求2的方法，還包括針對(duì)一種或多種額外分析物來(lái)評(píng)價(jià)試樣。4.權(quán)利要求3的方法，其中將同一試樣注射中的一種或多種額外的分析物與MPP—起評(píng)價(jià)。5.檢測(cè)琥珀酰丙酮的方法，所述方法包括使試樣與含有有機(jī)溶劑的提取溶液在實(shí)質(zhì)上不固定蛋白質(zhì)的條件下接觸；將試樣中的琥珀酰丙酮衍生為3-(5-甲基-lH-吡唑-3-基)丙酸(MPP);以及利用串聯(lián)質(zhì)譜法評(píng)價(jià)衍生的試樣中的MPP和額外分析物(或其衍生物)。6.權(quán)利要求2或5的方法，其中所述提取溶液包含至少約5%水。7.權(quán)利要求2或5的方法，其中所述提取溶液包含小于約85%甲醇。8.權(quán)利要求2或5的方法，其中所述琥珀酰丙酮用肼或衍生的肼來(lái)進(jìn)行衍生化。9.權(quán)利要求2或5的方法，其中所述試樣為干燥過(guò)的血樣。10.權(quán)利要求2或5的方法，其中所述試樣來(lái)自新生人類。11.權(quán)利要求2或5的方法，還包括基于對(duì)試樣中琥珀酰丙酮的檢測(cè)，確定試樣所來(lái)源的受試者是否患有遺傳性I型酪氨酸血癥或面臨發(fā)展所述疾病的危險(xiǎn)。12.權(quán)利要求11的方法，還包括在確定受試者患有遺傳性I型酪氨酸血癥或面臨發(fā)展所述疾病的危險(xiǎn)后，給予受試者4-羥基苯基丙酮酸雙加氧酶的抑制劑。13.權(quán)利要求2或5的方法，其中在質(zhì)譜分析之前，所述試樣中包括衍生化的琥珀酰丙酮，所述衍生化的琥珀酰丙酮包含至少一種重原子同位素。14.檢測(cè)生物學(xué)活性的酮的方法，所述方法包括使試樣與包含甲醇和強(qiáng)堿的提取溶液接觸；對(duì)試樣中的生物學(xué)活性的酮進(jìn)行衍生化；以及利用串聯(lián)質(zhì)譜法評(píng)價(jià)衍生的試樣中的衍生化的生物學(xué)活性的酮。15.權(quán)利要求14的方法，其中生物學(xué)活性的酮為琥珀酰丙酮。16.權(quán)利要求14的方法，其中生物學(xué)活性的酮為類固醇。17.用于檢測(cè)琥珀酰丙酮的試劑盒，所述試劑盒包含衍生化的琥珀酰丙酮，所述琥珀酰丙酮包含至少一種重原子同位素；以及如何檢測(cè)衍生化的琥珀酰丙酮的說(shuō)明書。18.權(quán)利要求17的試劑盒，其中所述衍生化的琥珀酰丙酮為3-(5_甲基-lH-吡唑-3-基)丙酸(MPP)。19.權(quán)利要求17的試劑盒，還包括強(qiáng)堿。20.權(quán)利要求19的試劑盒，其中所述強(qiáng)堿為肼。21.權(quán)利要求20的試劑盒，其中所述肼為二鹽酸肼。22.權(quán)利要求20的試劑盒，其中所述肼呈濃度小于約O.1%的溶液形式。23.權(quán)利要求17的試劑盒，還包括一種或多種內(nèi)標(biāo)物，每種內(nèi)標(biāo)物含有(i)氨基酸、游離肉毒堿或?；舛緣A，和(ii)至少一種重原子同位素。24.權(quán)利要求17的試劑盒，還包括至少一種干燥過(guò)的血斑，所述血斑包含已知量的一種或多種或琥珀酰丙酮、氨基酸、游離肉毒堿或?；舛緣A。25.提取的方法，所述方法包括使試樣與提取溶液接觸，所述提取溶液包含甲醇和強(qiáng)堿，其中使試樣與提取溶液接觸從試樣中產(chǎn)生了包含以下成分的提取物(i)衍生化的琥珀酰丙酮，(ii)一種或多種氨基酸，(iii)游離肉毒堿，(iv)一種或多種酰基肉毒堿，或(v)(ii)、(iii)或(iv)的任何衍生化形式，其中衍生化的琥珀酰丙酮在提取物中的濃度反映了琥珀酰丙酮在試樣中的濃度，其中一種或多種氨基酸、游離肉毒堿、一種或多種酰基肉毒堿或它們的衍生化形式在提取物中的濃度反映了它們?cè)谠嚇又械南鄳?yīng)濃度。26.權(quán)利要求25的方法，還包括在使試樣與提取溶液接觸后，利用串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)試樣進(jìn)行分析。27.權(quán)利要求25的方法，其中所述接觸將至少一種琥珀酰丙酮分子衍生為3-(5-甲基-1H-吡唑-3-基)丙酸(MPP)。28.權(quán)利要求25的方法，其中所述試樣為生物試樣。29.權(quán)利要求28的方法，其中所述生物試樣為干燥過(guò)的血樣。30.權(quán)利要求25的方法，其中所述提取溶液還包含水。31.權(quán)利要求25的方法，其中所述提取溶液包含約5%至約30%水。32.權(quán)利要求25的方法，其中所述強(qiáng)堿為肼。33.權(quán)利要求25的方法，其中所述強(qiáng)堿為修飾的肼。34.權(quán)利要求25的方法，其中所述提取溶液還包含有機(jī)酸。35.權(quán)利要求34的方法，其中所述有機(jī)酸為草酸。36.權(quán)利要求25的方法，其中所述提取溶液還包含一種或多種內(nèi)標(biāo)物。37.權(quán)利要求25的方法，還包括在使試樣與提取溶液接觸后，對(duì)試樣進(jìn)行蒸發(fā)，得到第一次蒸發(fā)的試樣。38.權(quán)利要求37的方法，還包括對(duì)試樣進(jìn)行蒸發(fā)后，使第一次蒸發(fā)的試樣與烷基醇溶液接觸，所述烷基醇溶液包含烷基醇和酸。39.權(quán)利要求38的方法，其中所述烷基醇為正丁醇。40.權(quán)利要求38的方法，其中所述酸為HC1。41.權(quán)利要求38的方法，還包括使試樣與所述烷基醇溶液接觸后，蒸發(fā)溶液，得到第二次蒸發(fā)的溶液。42.權(quán)利要求41的方法，還包括重組第二次蒸發(fā)的溶液。43.權(quán)利要求42的方法，其中所述重組包括使第二次蒸發(fā)的溶液與包括乙腈的溶劑接觸。全文摘要本發(fā)明尤其涉及使用質(zhì)譜法檢測(cè)和/或測(cè)量琥珀酰丙酮和一種或多種額外的生物分析物。文檔編號(hào)B01L99/00GK101742995SQ200880023247公開日2010年6月16日申請(qǐng)日期2008年5月5日優(yōu)先權(quán)日2007年5月4日發(fā)明者亞歷克斯·徹卡斯基,布拉斯·瑟達(dá),李義軍申請(qǐng)人:珀金埃爾默健康科學(xué)股份有限公司