專利名稱：一種快速檢測(cè)飼料中嘔吐毒素的膠體金試劑板的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
一種快速檢測(cè)飼料中嘔吐毒素的膠體金試劑板技術(shù)領(lǐng)域[0001]本實(shí)用新型涉及一種快速檢測(cè)飼料中嘔吐毒素的膠體金試劑板，具體涉及一種檢測(cè)嘔吐毒素的免疫膠體金快速檢測(cè)試劑板。
背景技術(shù)：
[0002]嘔吐毒素(vomitoxin),又叫做脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol, DON), F.鐮刀菌的二級(jí)代謝產(chǎn)物，它是全球性的污染谷物的霉菌毒素之一，通常在大麥、小麥、燕麥和玉米等農(nóng)作物中濃度較高。其對(duì)谷物的污染率和污染水平居鐮刀菌毒素之首，而嘔吐毒素又可與其他真菌毒素共存，被食入后可以共同作用于人體，對(duì)人類健康造成很大威脅。嘔吐毒素的性質(zhì)穩(wěn)定，耐熱、耐壓、耐弱酸、耐儲(chǔ)藏，一般的食品加工不能破壞其結(jié)構(gòu)，加堿或高壓處理可破壞部分毒素。人畜攝入了被嘔吐毒素污染的食物后，會(huì)導(dǎo)致厭食、嘔吐、 腹瀉、發(fā)燒、站立不穩(wěn)和反應(yīng)遲鈍等急性中毒癥狀，嚴(yán)重時(shí)損害造血系統(tǒng)造成死亡。此外， 嘔吐毒素還具有很強(qiáng)的細(xì)胞毒性和胚胎毒性，已被聯(lián)合國糧農(nóng)組織(FAO)和世界衛(wèi)生組織 (WHO)確定為最危險(xiǎn)的自然發(fā)生食品污染物之一。在1998年國際癌癥研究機(jī)構(gòu)公布的評(píng)價(jià)報(bào)告中，嘔吐毒素被列為三類致癌物。[0003]嘔吐毒素的危害已受到很多國家高度關(guān)注，部分國家對(duì)谷物中嘔吐毒素的制定了明確的限量標(biāo)準(zhǔn)。我國GB13078.3-2007 “配合飼料中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的允許量”中規(guī)定了豬配合飼料限量為lmg/kg、犢牛配合飼料限量為lmg/kg、泌乳期動(dòng)物配合飼料限量為lmg/kg、牛配合飼料限量為5mg/kg、家禽配合飼料限量為5mg/kg ；GB2715-2005 “糧食衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)”中規(guī)定小麥、大麥、玉米及其成品糧中的嘔吐毒素的限量為1000yg/kg; GB2761-2005 “食品中真菌毒素限量”規(guī)定小麥和玉米的嘔吐毒素的限量為1000μ g/kg。[0004]目前，嘔吐毒素的檢測(cè)方法主要有薄層色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法，高效液相色譜法，高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法和免疫學(xué)檢測(cè)法。色譜法應(yīng)用較為普遍，精確度和靈敏度高，但因其流程繁瑣、設(shè)備昂貴、檢測(cè)速度慢等原因，難以實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)和普及推廣。基于抗原抗體特異性反應(yīng)建立起來的免疫學(xué)測(cè)定方法靈敏度高，特異性強(qiáng)，試樣預(yù)處理簡(jiǎn)單，分析時(shí)間短，使用方便。因此，在現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)控和基層大規(guī)模篩選檢測(cè)中，免疫學(xué)檢測(cè)方法更實(shí)際。[0005]膠體金免疫層析法是在免疫滲濾技術(shù)的基礎(chǔ)上建立的一種簡(jiǎn)易快速的免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)，除了具備酶聯(lián)免疫法的諸多優(yōu)點(diǎn)外，還克服了酶聯(lián)免疫法的一些不足。該方法將反應(yīng)所需要的原料的全部或大部分均已整合到試劑中，反應(yīng)通常只需數(shù)分鐘至數(shù)十分鐘，檢測(cè)結(jié)果以肉眼可見的顯色條帶來判讀。此法具有簡(jiǎn)便快速、操作簡(jiǎn)單、特異性強(qiáng)、不需要額外設(shè)備等優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于生物技術(shù)的諸多領(lǐng)域。實(shí)用新型內(nèi)容[0006]本實(shí)用新型針對(duì)飼料中的嘔吐毒素殘留開展研究，提供一種用于現(xiàn)場(chǎng)快速篩選嘔吐毒素陽性樣本的免疫膠體金快速檢測(cè)試劑板。本實(shí)用新型具有簡(jiǎn)單、快 速、靈敏度高等特點(diǎn)，無須儀器設(shè)備配合測(cè)定。檢測(cè)過程不受地點(diǎn)限制，既可在實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行，也可現(xiàn)場(chǎng)測(cè)定，15min即可完成對(duì)樣品中嘔吐毒素的定性和半定量測(cè)定。本試劑板由上下兩塊塑料模板和背襯組成，背襯上依次緊密粘貼著樣品墊、膠體金結(jié)合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊。在樣品墊、膠體金結(jié)合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊相鄰的地方有I 2mm的重疊，一方面是為了保證層析作用從樣品墊到吸水墊部位的順利進(jìn)行，另一方面是為了使樣品溶液與樣品墊有充分反應(yīng)時(shí)間，樣品墊上的緩沖體系可以中和樣品溶液的酸堿度，保證樣品溶液中的有效成分與膠體金結(jié)合墊上的金標(biāo)抗體順利發(fā)生反應(yīng)。膠體金結(jié)合墊上噴有抗嘔吐毒素單克隆抗體與膠體金的結(jié)合物，膠體金顆粒的粒徑大小約為40nm ;硝酸纖維素膜上從樣品墊到吸水墊方向依次噴有DON-OVA偶聯(lián)物和羊抗鼠IgG，分別作為檢測(cè)線和質(zhì)控線。本實(shí)用新型試劑板應(yīng)用層析式抗體免疫競(jìng)爭(zhēng)原理，通過抗原和金標(biāo)抗體反應(yīng)顯色，特異性檢測(cè)飼料中的嘔吐毒素殘留。如果樣品溶液含有殘留，嘔吐毒素先和膠體金顆粒上的抗體反應(yīng)，因此當(dāng)膠體金顆粒隨樣品溶液擴(kuò)散至檢測(cè)線時(shí)，膠體金顆粒上抗體的活性位點(diǎn)因被樣品溶液中的嘔吐毒素占據(jù)而無法與檢測(cè)線上嘔吐毒素特異性抗原結(jié)合；當(dāng)樣品中的嘔吐毒素含量超過試劑板檢出限時(shí)，試劑板上的檢測(cè)線顯色較質(zhì)控線淺甚至無顯色，判定為陽性。相反，當(dāng)樣品中嘔吐毒素含量在試劑板檢出限以下或無殘留時(shí)，試劑板上的檢測(cè)線顯色與質(zhì)控線相近或偏深，判定為陰性。本實(shí)用新型試劑板的各部分組成成分與功能如下:塑料模板，起固定試紙條及標(biāo)示功能區(qū)(加樣孔、檢測(cè)區(qū)、質(zhì)控區(qū))的作用。背襯為一面涂有不干膠的不吸水的韌性材料，如PVC板，起固定支持試紙其他組成部分的作用。樣品墊由玻璃纖維制成，起吸收樣品溶液與緩沖樣品溶液pH值的作用。
膠體金結(jié)合墊由聚酯膜制成，其上噴有抗DON單抗與膠體金的結(jié)合物，是樣品溶液中的有效成分與金標(biāo)抗體發(fā)生反應(yīng)的場(chǎng)所。硝酸纖維素膜部分主要作用是將反應(yīng)結(jié)果以肉眼可見的顏色表征出來。吸水墊為濾紙,作為吸水部分其作用是將移動(dòng)上來的多余的溶液吸收。本實(shí)用新型試劑板具有如下有益效果:(I)特異性好、靈敏度高、檢出限可調(diào)本實(shí)用新型試劑板對(duì)DON的交叉反應(yīng)率為100%，與其他種類的霉菌毒素包括黃曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、伏馬霉素、赭曲霉素等均沒有交叉反應(yīng)。本實(shí)用新型試劑板的最低檢測(cè)限可以達(dá)到0.5mg/kg，完全可以滿足國家殘留限量要求。根據(jù)用戶不同需求，試劑板可以通過調(diào)節(jié)樣品溶液稀釋比例來選擇不同的檢出限。(2)操作簡(jiǎn)便、快速、對(duì)實(shí)驗(yàn)設(shè)備的依賴性小本實(shí)用新型試劑板整個(gè)檢測(cè)過程只需要15min。樣品前處理簡(jiǎn)單，滴樣后3 5min內(nèi)即可用肉眼讀取結(jié)果。本實(shí)用新型試劑板除樣品前處理過程中需要用到小型離心機(jī)外，不涉及其他儀器設(shè)備，便于野外及現(xiàn)場(chǎng)操作。(3)成本低，效益好本實(shí)用新型試齊板生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單，生產(chǎn)成本低，既可檢測(cè)單個(gè)樣本，也適用于大批量樣品檢測(cè)，大大降低了檢測(cè)費(fèi)用。


[0026]圖1為嘔吐毒素免疫膠體金快速檢測(cè)試劑板結(jié)構(gòu)示意圖，其中I為樣品墊，2為膠體金結(jié)合墊，3為硝酸纖維素膜,4為檢測(cè)線,5為質(zhì)控線,6為吸水墊,7為不干膠,8為PVC 板。[0027]圖2為嘔吐毒素免疫膠體金快速檢測(cè)試劑板操作示意圖，其中S為加樣孔，T為檢測(cè)區(qū)，C為質(zhì)控區(qū)。[0028]圖3、4、5為嘔吐毒素免疫膠體金快速檢測(cè)試劑板結(jié)果判定示意圖，其中T為檢測(cè)區(qū)，C為質(zhì)控區(qū)；圖3為陰性結(jié)果，圖4為陽性結(jié)果，圖5為無效。
具體實(shí)施方式
[0029]本實(shí)用新型試劑板的制備包括嘔吐毒素-載體蛋白偶聯(lián)物的制備、抗DON單抗的制備、膠體金溶液的制備、膠體金標(biāo)記抗DON單抗的制備和嘔吐毒素疫膠體金快速檢測(cè)試劑板的組裝。[0030]1、嘔吐毒素-載體蛋白偶聯(lián)物的制備[0031]1.1嘔吐毒素肟(DONO)的制備[0032]稱取嘔吐毒素標(biāo)準(zhǔn)樣品lmg，溶于150μ L吡啶中，加入10.4mgl_丁基硼酸，混合物在室溫下攪拌20h，然后在攪拌的情況下加入1.7mol/L琥珀酐吡啶溶液200 μ L，反應(yīng)管密閉，混合物在沸水浴中攪拌反應(yīng)3h，然后將溶劑吡啶在100°C氮蒸汽下?lián)]干。用乙酸乙酯萃取三次，真空濃縮得到D0N0。[0033]1.2D0N-BSA 與 D0N-0VA 的制備[0034]分別稱取0.78mg EDC、1.38mg NHS,并分別溶于100 μ L的DMF中，冰箱中冷藏待用。將300mg牛血清白蛋白(BSA)和400mg EDC溶于15mL蒸餾水中，加入10%乙二胺水溶液lmL，用lmol/L鹽酸調(diào)pH值至5.5，室溫下緩慢攪拌反應(yīng)2h ;再加入200mg EDC，并用 lmol/L鹽酸調(diào)pH值至5.5，室溫下繼續(xù)緩慢攪拌反應(yīng)過夜，用蒸餾水4°C透析3d，冷凍真空干燥后4 °C保存?zhèn)溆?。[0035]將配置好的DONO溶于350 μ L的DMF中，將NHS溶液加入，并在攪拌的同時(shí)緩慢加入EDC溶液，混合物在4°C避光反應(yīng)2h，經(jīng)離心提取上清夜，然后在攪拌的同時(shí)緩慢滴加 BSA溶液，4°C下緩慢攪拌反應(yīng)20h。將產(chǎn)物溶液用0.01mol/L pH7.4PBS溶液在4°C下透析 72h，每12h換透析液一次，溶液用小瓶分裝，真空冷凍干燥后，在4°C保存。[0036]制備包被抗原所用的蛋白為0VA，方法與免疫抗原相同。[0037]2、抗DON單抗的制備[0038]取6 8周齡雌性BALB/c小鼠，將DON-BSA偶聯(lián)物與等體積的弗氏完全佐劑乳化后按100 μ g/只劑量皮下注射，每隔2周加強(qiáng)免疫I次，用不完全佐劑腹腔注射。融合前3d 強(qiáng)化免疫I次，不用佐劑，劑量加倍。將SP2/0多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞與免疫脾細(xì)胞按1: 10的比例混合，在50%聚乙二醇作用下融合，HAT培養(yǎng)基懸浮,分種于96孔培養(yǎng)板中，37°C, 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。融合后，待細(xì)胞生長到培養(yǎng)孔面積的1/4時(shí)，分步篩選法篩選雜交瘤細(xì)胞。初篩選擇10mg/L DON-BSA偶聯(lián)物包被酶聯(lián)板，被測(cè)孔加入培養(yǎng)上·清，經(jīng)孵育、清洗后， 加入羊抗鼠IgG-HRP (I: 1000)，OPD顯色。篩選出的陽性孔再用D0N-0VA偶聯(lián)物包被的酶聯(lián)板進(jìn)行阻斷間接ELISA。將細(xì)胞培養(yǎng)上清與2X 10_3mol/L嘔吐毒素溶液等量混合，37°C干燥lh，加入已包被的酶標(biāo)板中。另外用PBS (0.0lmol/L、pH7.4)替代嘔吐毒素溶液作對(duì)照，其余步驟同上。若嘔吐毒素阻斷后的OD值降至對(duì)照孔的50%以下，則判為陽性孔。立即用有限稀釋法進(jìn)行克隆化。將克隆化的細(xì)胞株擴(kuò)大培養(yǎng)，細(xì)胞濃度達(dá)5 X IOVmL時(shí)停止換液，細(xì)胞全部死亡后收集培養(yǎng)液。給腹腔注射液體石蠟IOd后的小鼠腹腔注射克隆化細(xì)胞株IO7個(gè)細(xì)胞，7d后抽取腹水。3、膠體金溶液的制備在IOOmL去離子水中加入ImLl %檸檬酸三鈉，煮沸后迅速加入ImLl %氯金酸，繼續(xù)煮沸l(wèi)Omin，冷卻后，4°C下保存?zhèn)溆谩＝?jīng)試驗(yàn)篩選，測(cè)定該膠體金顆粒的粒徑約為40nm。4、膠體金標(biāo)記抗DON單抗的制備取已制備好的膠體金溶液1001^，用0.111101/1碳酸鉀溶液調(diào)？!1到8.0。邊攪拌邊加入2mg抗DON單抗，攪拌20min，逐滴加入2mL25mol/L聚乙二醇20000 (PEG20000)，攪拌 15min。20000r/min 離心 15min,棄上清液，加入 10mT, pH7.4 的 PBS 緩沖液(含 0.4mol/L PEG)清洗2次。將沉淀用IOmL含2% BSA的PBS緩沖液(pH7.4)溶解，無菌過濾器過濾后，4 C保存?zhèn)溆谩?、嘔吐毒素免疫膠體金快速檢測(cè)試劑板的組裝用點(diǎn)膜機(jī)把適當(dāng)濃度的DON-OVA偶聯(lián)物及羊抗鼠IgG噴在硝酸纖維素膜上，分別作為檢測(cè)線和質(zhì)控線，37°C烘 箱干燥8h。以同樣方法，將制備好的膠體金標(biāo)記嘔吐毒素單抗包被在膠體金結(jié)合墊上。檢測(cè)試劑組成為一個(gè)PVC背襯，在其上按順序粘上樣品墊、膠體金結(jié)合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊。試紙條組裝完畢后，干燥箱內(nèi)烘干。然后用切割機(jī)將貼好的大卡切割成3.84mm寬的條,裝入塑料模板中制成檢測(cè)試劑板,再放入帶干燥劑的招箔袋中密閉儲(chǔ)存。6、嘔吐毒素免疫膠體金快速檢測(cè)試劑板檢測(cè)實(shí)施操作方法6.1樣品的前處理取Ig樣品置于5mL離心管中，加入4mL提取劑，劇烈震蕩3min,4000r/min離心5min。根據(jù)下表中檢測(cè)限取對(duì)應(yīng)量的上層溶液，再吸取對(duì)應(yīng)量的專用稀釋液稀釋，吹打均勻后，待檢。
權(quán)利要求1.一種快速檢測(cè)飼料中嘔吐毒素的膠體金試劑板，其特征在于試劑板由上下兩塊塑料模板和背襯組成，背襯上依次緊密粘貼著樣品墊、膠體金結(jié)合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊，所述樣品墊、膠體金結(jié)合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊各部分之間有I 2_的重疊，所述膠體金結(jié)合墊上噴有抗嘔吐毒素單克隆抗體與膠體金的結(jié)合物，膠體金顆粒的粒徑大小約為40nm，所述硝酸纖維素膜上從樣品墊到吸水墊方向依次噴有DON-OVA偶聯(lián)物和羊抗鼠IgG，分別作為檢測(cè)線和質(zhì)控線。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑板，其特征在于背襯為一面涂有不干膠的PVC板，樣品墊由玻璃纖維制成，膠體金 結(jié) 合墊由聚酯膜制成，吸水墊為濾紙。
專利摘要本實(shí)用新型涉及一種快速檢測(cè)飼料中嘔吐毒素的膠體金試劑板，可用于快速檢測(cè)飼料中的嘔吐毒素。本實(shí)用新型試劑板由上下兩塊塑料模板和背襯組成，背襯上依次緊密粘貼著樣品墊、膠體金結(jié)合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊。硝酸纖維素膜從樣品墊到吸水墊方向上依次噴有檢測(cè)線和質(zhì)控線，嘔吐毒素的檢測(cè)結(jié)果能夠以肉眼判斷。該試劑板可進(jìn)行半定量直觀檢測(cè)，整個(gè)操作過程僅需15min，且無需任何昂貴實(shí)驗(yàn)設(shè)備輔助，利于大規(guī)模樣本篩選，適合于工商部門、檢驗(yàn)檢疫機(jī)構(gòu)、養(yǎng)殖場(chǎng)以及飼料生產(chǎn)加工企業(yè)對(duì)飼料中嘔吐毒素進(jìn)行大規(guī)模的快速檢測(cè)。
文檔編號(hào)G01N33/544GK203148951SQ20122071424
公開日2013年8月21日 申請(qǐng)日期2012年12月4日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月4日
發(fā)明者楊敏, 陳笑笑, 王振國, 桑麗雅, 苑淑賓 申請(qǐng)人:杭州南開日新生物技術(shù)有限公司