黃曲霉毒素b1適配體親和柱的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種黃曲霉毒素B1適配體親和柱的制備方法，屬于親和層析和真菌毒素分析領域。采用環(huán)氧活化瓊脂糖微球FF作為固相載體，與氨基修飾黃曲霉毒素B1適配體偶聯(lián)后，封閉載體中多余活性位點，填入微型小柱制成。所制備的適配體親和柱能與黃曲霉毒素B1特異性結合，其加標回收率在70~110之間，至少可以重復使用五次。
【專利說明】黃曲霉毒素B1適配體親和柱的制備方法

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及親和層析及真菌毒素檢測【技術領域】，具體涉及黃曲霉毒素B1適配體 親和柱的制備方法及其應用。

【背景技術】
[0002] 黃曲霉毒素B1均為黃曲霉菌、寄生曲霉菌產生的代謝物，具有致癌、致畸、致突變 的作用，是迄今發(fā)現(xiàn)的最穩(wěn)定的一種真菌毒素，一般食品加工條件都不易破壞，因此給消費 者的飲食安全埋下了巨大的隱患。各國對食品中黃曲霉毒素殘留量現(xiàn)狀非常重視，制定了 相應的限量標準，如我國規(guī)定大米、食用油中黃曲霉毒素允許量標準為（Bl + B2 + G1 + G2) 10 ng /g〇
[0003] 目前，黃曲霉毒素B1的分析方法中，常用的有高效液相色譜、毛細管電泳、液質聯(lián) 用等。這些儀器分析方法對樣品純度要求較高，需要經(jīng)過一些前處理，傳統(tǒng)的前處理技術有 免疫親和柱、多功能凈化柱等，這些凈化柱價格較貴，多為一次性的。建立高選擇、快速有效 的樣品前處理技術已成為黃曲霉毒素B1檢測分析中需要解決的重要問題。 基于適配體親和層析是一種新型高效樣品前處理技術。它的原理是利用適配體對靶分 子選擇性吸附來實現(xiàn)對復雜樣品中靶分子的提取和凈化處理，這種吸附是可逆的。適配體 的親和層析結合常規(guī)儀器分析已成為真菌毒素分析的一個發(fā)展方向，但目前尚未見其適配 體親和柱的制備方法及其應用報道。


【發(fā)明內容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種黃曲霉毒素B1適配體親和柱的制備方法，所研制的 親和柱是將氨基修飾的黃曲霉毒素B1適配體與環(huán)氧活化的瓊脂糖6FF偶聯(lián)填充于固相萃 取柱中，用于純化含黃曲霉毒素B1的待測樣品。
[0005] 本發(fā)明的技術方案為：一種黃曲霉毒素B1適配體親和柱的制備方法，其步驟：1 活化：取60mg的環(huán)氧活化瓊脂糖微球FF在2mL去離子水中懸浮溶脹成凝膠1小時。用60mL 去離子水分三次洗滌凝膠，靜置5min后，移除清洗液；2偶聯(lián)：將氨基修飾的黃曲霉毒素B1 適配體溶于lmL20. Ommol/LpHlO. 0的磷酸鹽緩沖液中。將步驟1中溶脹凝膠懸浮于含適配 體的緩沖液中，在37°C的水浴中振搖16小時。反應完后，再用3mL去離子水洗滌未反應的適 配體，靜置5min后，移除清洗液；3封閉：將步驟（2)中凝膠懸浮到2mLlmol/LpH8. 0乙醇胺 溶液中，在50°C的水浴中振搖4小時，反應完后，用3mL含0.5mol/LNaCl的0? lmol/LpH4.0 乙酸緩沖液和3mL含0. 5mol/LNaCl的pH8. 3偶聯(lián)緩沖液交替清洗，每次清洗2min，至少循 環(huán)3次；4裝柱：將步驟3的懸浮凝膠液移入固相萃取小柱（內徑5. 0 mm，容積1. OmL)，避免 產生氣泡，用5mL0. lmol/LpH8. 0磷酸鹽緩沖液平衡小柱。
[0006] 其中步驟2中氨基修飾的黃曲霉毒素B1適配體為DNA合成公司商品化生產，黃曲 霉毒素B1 適配體的序列為：5'-ITT ITT GIT GGG CAC GTG ITG TCT CTC TGT GTC TCG TGC CCT TCG CTA GGC CCA C-NH2-3，。
[0007] 本發(fā)明黃曲霉毒素B1適配體親和柱的應用方法，按下述步驟進行：a上樣：放掉柱 內溶液，將提取的樣品用〇. lmol/LpH8.0磷酸鹽緩沖液溶解或稀釋，上樣。上樣時流速不超 過lmL/min，避免樣品流干。b淋洗：待樣品過柱后，用3 mL二次水淋洗柱床、棄去。c洗脫： 用3mL甲醇洗脫，在50°C下氮氣吹干，用流動相定容待測。d再生：對于使用之后的凝膠，以 2?3 倍柱體積的含 0? 5mol/LNaCl 的 0? lmol/LpH8. 3Tris-HCl 和含 0? 5mol/LNaCl 的 0? lmol/ pH4. 5乙酸緩沖液交替沖洗2?3次。
[0008] 本發(fā)明的優(yōu)點在于：本發(fā)明制備的適配體親和柱能夠與黃曲霉毒素B1特異性結 合，一次凈化能除去絕大部分干擾物。制備的適配體親和柱最大結合容量約為80 ng黃曲 霉毒素B1。采用的洗脫液為甲醇時，加標回收率在70~110%之間。制備的適配體親和柱重 復使用5次，回收率不低于70%。

【具體實施方式】
[0009] 本發(fā)明下面的實施例僅作為本
【發(fā)明內容】
的進一步說明，不能作為本發(fā)明的限定內 容或范圍。下面通過實施例對本發(fā)明作進一步說明。
[0010] 實施例1黃曲霉毒素B1適配體親和柱的制備： 1活化：取60mg的環(huán)氧活化瓊脂糖微球FF在2mL去離子水中懸浮溶脹成凝膠1小時。 用60mL去離子水分三次洗滌凝膠，靜置5min后，移除清洗液； 2偶聯(lián)：將氨基修飾的黃曲霉毒素B1適配體溶于lmL20. Ommol/LpHlO. 0的磷酸鹽緩沖 液中。將步驟1中溶脹凝膠懸浮于含適配體的緩沖液中，在37°C的水浴中振搖16小時。反 應完后，再用3mL去離子水洗漆未反應的適配體，靜置5min后,移除清洗液； 3封閉：將步驟2中凝膠懸浮到2mLlmol/LpH8. 0乙醇胺溶液中，在50°C的水浴中振搖 4小時，反應完后，用3mL含0.5mol/LNaCl的0?lmol/LpH4.0乙酸緩沖液和3mL含0.5mol/ LNaCl的pH8. 3偶聯(lián)緩沖液交替清洗，每次清洗2min，至少循環(huán)3次； 4裝柱：將步驟3的懸浮凝膠液移入固相萃取小柱（內徑5. 0 mm，容積1. OmL)，避免產 生氣泡，用5mL0. lmol/LpH8. 0磷酸鹽緩沖液平衡小柱。
[0011] 其中步驟2中氨基修飾的黃曲霉毒素B1適配體為DNA合成公司商品化生產。
[0012] 本發(fā)明所述黃曲霉毒素B1適配體親和柱的性能評價方法： 實施例1所制備的親和柱最大結合容量的測定：分別用10mL20. 0ng/mL (200ng)過黃 曲霉毒素B1親和柱。上樣液每毫升收集一管，用HPLC-MS/MS測定每管中黃曲霉毒素B1含 量。根據(jù)下式計算：最大結合容量（即被吸附的黃曲霉毒素B1總量）等于上樣總量減去洗 下的黃曲霉毒素B1總量。結果發(fā)現(xiàn)，l~5mL上樣液只測出黃曲霉毒素B1，到5mL開始無吸 附。因此，偶聯(lián)1.9 nmol/L黃曲霉毒素B1適配體的親和柱最大結合容量約為80 ng。
[0013] 實施例1所制備的親和柱加標回收率和重復性測定：分別上樣20mL的0. 5ng/mL、 1.0 ng/mL、2. 0ng/mL三種不同濃度的黃曲霉毒素B1，每種濃度作三組平行。收集洗滌液后 用HPLC-MS/MS測定回收率。結果見表1，經(jīng)測定回收率均達到90%以上，相對標準偏差少于 10%。
[0014] 表1制備的黃曲霉毒素B1親和柱加標回收率和重復性

【權利要求】
1. 一種黃曲霉毒素B1適配體親和柱的制備方法，其步驟：（1)活化：取60mg的環(huán)氧 活化瓊脂糖微球FF在2mL去離子水中懸浮溶脹成凝膠1小時，用60mL去離子水分三次 洗滌凝膠，靜置5min后，移除清洗液；（2)偶聯(lián)：將氨基修飾的黃曲霉毒素B1適配體溶于 lmL20. Ommol/LpHlO. 0的磷酸鹽緩沖液中，將步驟（1)中溶脹凝膠懸浮于含適配體的緩沖 液中，在37°C的水浴中振搖16小時，反應完后，再用3mL去離子水洗滌未反應的適配體，靜 置5min后，移除清洗液；（3)封閉：將步驟（2)中凝膠懸浮到2mLlmol/LpH8. 0乙醇胺溶液 中，在50°C的水浴中振搖4小時，反應完后，用3mL含0.5mol/LNaCl的0? lmol/LpH4.0乙 酸緩沖液和3mL含0. 5mol/LNaCl的pH8. 3偶聯(lián)緩沖液交替清洗，每次清洗2min，至少循環(huán) 3次；（4)裝柱：將步驟（3)的懸浮凝膠液移入固相萃取小柱，避免產生氣泡，用5mL0. lmol/ LpH8. 0磷酸鹽緩沖液平衡小柱。
2. 根據(jù)權利要求1所述黃曲霉毒素B1適配體親和柱的制備方法，其特征在于：其中步 驟（2)中氨基修飾的黃曲霉毒素B1適配體為DNA合成公司商品化生產，黃曲霉毒素B1適配 體的序列為：5，_ NH2-TIT ITT GIT GGG CAC GTG ITG TCT CTC TGT GTC TCG TGC CCT TCG CTA GGC CCA C -3，。
3. 根據(jù)權利要求1所述黃曲霉毒素B1適配體親和柱的制備方法，其特征在于：本發(fā)明 黃曲霉毒素B1適配體親和柱的應用方法，按下述步驟進行：（a)上樣：放掉柱內溶液，將提 取的樣品用〇. lmol/LpH8. 0磷酸鹽緩沖液溶解或稀釋，上樣，上樣時流速不超過lmL/min， 避免樣品流干；（b)淋洗：待樣品過柱后，用3 mL去離子水淋洗柱床、棄去；（c)洗脫：用 3mL甲醇洗脫，在50°C下氮氣吹干，用流動相定容待測；（d)再生：對于使用之后的凝膠，以 2?3 倍柱體積的含 0? 5mol/LNaCl 的 0? lmol/LpH8. 3Tris-HCl 和含 0? 5mol/LNaCl 的 0? lmol/ pH4. 5乙酸緩沖液交替沖洗2?3次。
【文檔編號】B01D15/38GK104399283SQ201410723990
【公開日】2015年3月11日 申請日期:2014年12月4日 優(yōu)先權日:2014年12月4日
【發(fā)明者】廖且根, 羅林廣, 李偉紅, 胡麗芳 申請人:江西省農業(yè)科學院農產品質量安全與標準研究所