本發(fā)明屬于毛細(xì)管整體柱的制備領(lǐng)域，更具體地涉及一種雙功能親和有機(jī)聚合基質(zhì)毛細(xì)管整體柱的制備方法。

背景技術(shù)：

蛋白質(zhì)是生理功能的執(zhí)行者，當(dāng)今生命科學(xué)研究的熱點(diǎn)之一是蛋白質(zhì)組學(xué)，其中翻譯后修飾蛋白組學(xué)在蛋白質(zhì)組學(xué)的研究中占重要地位。糖基化和磷酸化蛋白質(zhì)翻譯后修飾是最常見的翻譯后修飾。雖然糖基化和磷酸化蛋白質(zhì)種類繁多，但生物樣品中多數(shù)目標(biāo)糖蛋白和磷酸化蛋白的相對(duì)豐度較低。因此，研究糖基化和磷酸化蛋白質(zhì)的首要工作就是如何將其從復(fù)雜體系中分離富集出來，這也是翻譯后修飾蛋白質(zhì)組學(xué)發(fā)展的關(guān)鍵技術(shù)。

毛細(xì)管整體柱是微分離領(lǐng)域的熱點(diǎn)研究對(duì)象，是具有多孔結(jié)構(gòu)的整體棒狀固定相，其優(yōu)點(diǎn)是制備簡(jiǎn)單、條件溫和、通透性好、易于改性等，在復(fù)雜生物樣品分離領(lǐng)域逐漸發(fā)揮重要作用。整體柱按基質(zhì)的不同可分為三個(gè)部分：無機(jī)基質(zhì)整體柱、有機(jī)基質(zhì)整體柱和有機(jī)-無機(jī)雜化整體柱。有機(jī)基質(zhì)整體柱主要是將單體、交聯(lián)劑、致孔劑、引發(fā)劑等混合均勻后注入改性后的毛細(xì)管內(nèi)，在一定溫度條件下反應(yīng)一段時(shí)間，形成聚合物連續(xù)床。有機(jī)基質(zhì)整體柱具有合成方法簡(jiǎn)單、色譜性能穩(wěn)定、生物兼容性好等優(yōu)點(diǎn)。

硼酸親和色譜是一種經(jīng)典的糖蛋白富集技術(shù)（Zian Lin, Jilei Pang, Huanghao Yang, Zongwei Cai, Lan Zhang, Guonan Chen, Chem. Commun., 2011, 47 (34), 9675-9677.）。硼酸基團(tuán)在堿性條件下可與含1,2-順式二羥基的物質(zhì)發(fā)生可逆共價(jià)鍵結(jié)合，在酸性條件下共價(jià)鍵解離重新釋放出含順式二羥基的物質(zhì)。由于硼酸鹽親和色譜具有親和力強(qiáng)，過程可逆，操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，在糖蛋白分離與富集領(lǐng)域受到了越來越廣泛的關(guān)注。

磷酸化肽的選擇性富集通常是用固定金屬離子親和色譜（IMAC）。傳統(tǒng)的IMAC是Fe³⁺或Ga³⁺等與亞氨基二乙酸（IDA）或次氨基三乙酸（NTA）形成螯合作用，然而，這種方法不僅能富集磷酸化肽，而且對(duì)非磷酸化的酸性肽段以及含組氨酸殘基的多肽也具有一定的親和效果，將會(huì)抑制磷酸化肽的富集。鄒漢法課題組（Shun Feng, Mingliang Ye, Houjiang Zhou, Xiaogang Jiang, Xingning Jiang, Hanfa Zou, Bolin Gong, Mol.Cell.Proteomics, 2007, 6:1656-1665）發(fā)展了一種新型的以磷酸化基團(tuán)為配位基團(tuán)的IMAC技術(shù)，將磷酸基團(tuán)通過共價(jià)鍵結(jié)合到載體上，然后將Ti⁴⁺或Zr⁴⁺固載到載體表面，用于選擇性富集磷酸化蛋白。

雙功能親和有機(jī)聚合基質(zhì)毛細(xì)管整體柱具有同時(shí)富集糖蛋白和磷酸化蛋白的優(yōu)點(diǎn)，并且機(jī)械強(qiáng)度高，滲透性好，為糖蛋白和磷酸化蛋白的富集提供了新方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)不足，提供一種基于雙功能親和有機(jī)聚合基質(zhì)毛細(xì)管整體柱的制備方法。該方法制備的整體柱可分別用于兩種翻譯后修飾蛋白質(zhì)的分離富集，具有均勻連續(xù)層固定相、良好的機(jī)械穩(wěn)定性和滲透性；在分離具有1,2-順式二羥基的小分子、糖蛋白和磷酸化蛋白方面具有較好的應(yīng)用。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

一種雙功能親和有機(jī)聚合基質(zhì)毛細(xì)管整體柱的制備方法，包括以下步驟：

1）將含硼酸基團(tuán)的單體、含磷酸基團(tuán)的單體、交聯(lián)劑、致孔劑和引發(fā)劑混合均勻，將所得混合物在室溫下超聲振蕩，然后通氮?dú)猓ǖ担┮猿セ旌衔镏腥芙獾难鯕猓?/p>

2）將步驟1）制得的混合物注入經(jīng)乙烯基改性的石英毛細(xì)管內(nèi)，密封后置于水浴鍋內(nèi)，并于60~85℃（優(yōu)選75℃）發(fā)生原位自由基聚合反應(yīng)12~24h（優(yōu)選24h），將毛細(xì)管從水浴鍋內(nèi)取出用甲醇或乙腈沖洗制得所述的原位自由基聚合的雙功能親和有機(jī)聚合基質(zhì)毛細(xì)管整體柱。

該方法的步驟1）中所述含硼酸基團(tuán)的單體為任意同時(shí)含硼酸基團(tuán)和末端烯烴的化合物，優(yōu)選4-乙烯基苯硼酸；含磷酸基團(tuán)的單體為任意同時(shí)含磷酸基團(tuán)和末端烯烴的化合物，優(yōu)選乙烯基膦酸；交聯(lián)劑為乙二醇二甲基丙烯酸酯、季戊四醇三丙烯酸酯或聚乙二醇二甲基丙烯酸酯中的一種，優(yōu)選所述交聯(lián)劑為乙二醇二甲基丙烯酸酯；致孔劑為二甘醇和乙二醇的混合物，引發(fā)劑為偶氮二異丁腈。

所述含硼酸基團(tuán)的單體與含磷酸基團(tuán)的單體的摩爾質(zhì)量比為1~2:1，優(yōu)選1:1；含硼酸基團(tuán)的單體與含磷酸基團(tuán)的單體的總質(zhì)量與交聯(lián)劑的質(zhì)量比為11~12:8~9，優(yōu)選11.3:8.7；所述含硼酸基團(tuán)的單體、含磷酸基團(tuán)的單體和交聯(lián)劑三者之和與致孔劑的質(zhì)量比為20~40:60~80，優(yōu)選20:80；致孔劑二甘醇和乙二醇的混合物中，二甘醇與乙二醇的質(zhì)量比為60~80:1~20，優(yōu)選72:8；所述引發(fā)劑的質(zhì)量為含硼酸基團(tuán)的單體、含磷酸基團(tuán)的單體和交聯(lián)劑三者總質(zhì)量的1~2%，優(yōu)選1%。

本發(fā)明還保護(hù)了利用上述制備方法制得的雙功能親和有機(jī)聚合基質(zhì)毛細(xì)管整體柱的應(yīng)用，制得的毛細(xì)管整體柱用于分離或富集含1,2-順式二羥基結(jié)構(gòu)的小分子、生物大分子糖蛋白和磷酸化蛋白。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)如下：

1.本發(fā)明提供的雙功能親和有機(jī)聚合基質(zhì)毛細(xì)管整體柱制備方法，反應(yīng)溫度溫和，制備過程簡(jiǎn)單，易于操作。制得的毛細(xì)管整體柱具有良好的固定床，通透性好，可滿足快速、高效分離的要求；

2.本發(fā)明提供的雙功能親和有機(jī)聚合基質(zhì)毛細(xì)管整體柱可滿足含1,2-順式二醇結(jié)構(gòu)的小分子、糖蛋白質(zhì)以及磷酸化蛋白等物質(zhì)的分離或富集，具有高效的選擇性，在同一根整體柱上分別分離富集不同的蛋白質(zhì)。

附圖說明

圖1 為本發(fā)明的雙功能親和毛細(xì)管整體柱截面的掃描電鏡圖；

圖2 為圖1所示整體柱柱體與管內(nèi)壁連接處的掃描電鏡圖；

圖3 為實(shí)施例2中鄰苯二酚和對(duì)苯二酚混合樣的色譜分離圖；

圖4 為實(shí)施例3中牛血清白蛋白（BSA）、辣根過氧化酶（HRP，一種糖蛋白）兩種蛋白的色譜分離圖；

圖5 為實(shí)施例4中牛血清白蛋白（BSA）、血紅蛋白（Hb）和β-酪蛋白（一種磷酸化蛋白）三種蛋白的色譜分離圖。

具體實(shí)施方式

下面通過具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步說明，但是本發(fā)明不僅限于此。本發(fā)明采用的原材料可在市場(chǎng)購得，或可用本領(lǐng)域已知的方法合成。

實(shí)施例1

1. 柱子預(yù)處理

將毛細(xì)管內(nèi)壁依次用丙酮沖洗30min，二次水沖洗1h，1.0mol/L氫氧化鈉溶液沖洗12h，二次水沖洗1h，0.2mol/L鹽酸溶液沖洗3h，二次水沖洗1h，甲醇沖洗30min，在60℃氮?dú)獯蹈伞?/p>

2. 硅烷化

在預(yù)處理過的毛細(xì)管內(nèi)注入無水甲醇與甲基丙烯酰氧丙基三甲氧基硅烷（γ-MAPS）體積比為1：1的混合液，在45℃下反應(yīng)24h，然后用甲醇沖洗30min，在60℃氮?dú)獯蹈伞?/p>

3. 柱內(nèi)合成

準(zhǔn)確稱取32.5 mg 4-乙烯基苯硼酸（VPBA），24 mg乙烯基膦酸（VPA），1 mg 偶氮二異丁腈（AIBN）于離心管中，加入322 μL二甘醇、36 μL乙二醇和42 μL乙二醇二甲基丙烯酸酯（EDMA），于室溫下超聲20 min，直至混合物完全溶解。將混合物注入硅烷化后的100 μm內(nèi)徑毛細(xì)管中，至25 cm處，兩端封口放入75 ℃水浴中反應(yīng)24 h。反應(yīng)結(jié)束后取出冷卻至室溫，用高壓恒流泵在低流速下100%甲醇沖洗40 min以除去未反應(yīng)的功能單體以及反應(yīng)產(chǎn)生的一些副產(chǎn)物，制得雙功能親和有機(jī)聚合基質(zhì)毛細(xì)管整體柱。該整體柱在使用前用100 mmol/L醋酸沖洗平衡30 min。

用掃描電子顯微鏡觀察上述制備得到的整體柱的柱體微觀形貌，可以得知材料具有微米級(jí)的通孔和連續(xù)的三維骨架，如圖1所示。

用掃描電子顯微鏡觀察上述制備得到的整體柱的柱體微觀形貌，可以得知整體柱基質(zhì)與石英毛細(xì)管內(nèi)壁鍵合完好，能耐受16兆帕的泵壓，具有較好的機(jī)械穩(wěn)定性，如圖2所示。

實(shí)施例2

在微柱液相色譜（μHPLC）模式下，以pH 8.0，離子濃度20 mmol/L磷酸鹽溶液：乙腈（50/50，v/v）的緩沖液為流動(dòng)相A，運(yùn)行時(shí)間7min；以100 mmol/L醋酸溶液：乙腈（50/50，v/v）的緩沖液為流動(dòng)相B，運(yùn)行時(shí)間從7min開始；泵流速為0.05 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為214 nm。以1000 μg/mL鄰苯二酚和1000 μg/mL對(duì)苯二酚為例，在流動(dòng)相A條件下，對(duì)苯二酚在整體柱上不保留而直接被洗脫出來，而含1,2-順式結(jié)構(gòu)的鄰苯二酚因與硼酸基團(tuán)形成可逆共價(jià)鍵而被吸附在柱上，當(dāng)流動(dòng)相切換到B條件下，鄰苯二酚得到洗脫。二者混合物在實(shí)施例1中制得的雙功能親和有機(jī)聚合基質(zhì)毛細(xì)管整體柱上實(shí)現(xiàn)高效選擇性的分離，其色譜分離圖如圖3所示。

實(shí)施例3

在微柱液相色譜（μHPLC）模式下，以pH9.0，離子濃度20 mmol/L磷酸鹽緩沖溶液：0.4 mol/L 氯化鈉（NaCl）（50/50，v/v）的混合溶液為流動(dòng)相A，運(yùn)行時(shí)間7 min；以100 mmol/L醋酸溶液為流動(dòng)相B，運(yùn)行時(shí)間從7 min開始；泵流速為0.05 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為214 nm。以非糖蛋白（1000 μg/mL牛血清白蛋白，BSA）與含1,2-順式結(jié)構(gòu)的糖蛋白（1000 μg/mL辣根過氧化酶，HRP）為例，在流動(dòng)相A條件下，BSA在整體柱上不保留而直接被洗脫出來，而HRP上的糖鏈因與硼酸基團(tuán)形成可逆共價(jià)鍵而被吸附在柱上，當(dāng)流動(dòng)相切換到B條件下，HRP得到洗脫。二者蛋白混合物在實(shí)施例1中制得的雙功能親和有機(jī)聚合基質(zhì)毛細(xì)管整體柱上實(shí)現(xiàn)高效選擇性的分離，其色譜分離圖如圖4所示。

實(shí)施例4

實(shí)施例1中制得的雙功能親和有機(jī)聚合基質(zhì)毛細(xì)管整體柱使用前先用10 mmol/L ZrCl₄以0.005 mL/min流速過夜處理，使整體柱骨架表面的磷酸基團(tuán)與Zr⁴⁺形成螯和作用，剩余的Zr⁴⁺的結(jié)合位點(diǎn)在酸性條件下與磷酸化蛋白形成螯和，用于吸附磷酸化蛋白，然后在堿性條件下脫附。

在微柱液相色譜（μHPLC）模式下，以10 mmol/L，pH6.0的 3-嗎啉丙磺酸（MOPS）為流動(dòng)相A，運(yùn)行時(shí)間7min；以10%氨水為流動(dòng)相B，運(yùn)行時(shí)間從7 min開始；泵流速為0.05 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm。以非磷酸化蛋白BSA和Hb以及磷酸化蛋白β-酪蛋白為例，蛋白濃度均為1000 μg/mL，在流動(dòng)相A條件下，非磷酸化蛋白BSA和Hb在整體柱上不保留而直接被洗脫出來，而磷酸化蛋白β-酪蛋白在酸性條件下整體柱中的Zr⁴⁺形成螯合作用；當(dāng)流動(dòng)相切換到B條件下，β-酪蛋白得到洗脫。二者蛋白混合物在實(shí)施例1中制得的雙功能親和毛細(xì)管整體柱上實(shí)現(xiàn)高效選擇性的分離，其色譜分離圖如圖5所示。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，凡依本發(fā)明申請(qǐng)專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應(yīng)屬本發(fā)明的涵蓋范圍。